CN115181381B - 低体温保存细胞并实时监测ros含量的水凝胶及制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞保存领域，具体涉及一种低体温保存细胞并实时监测ROS含量的水凝胶及制备和应用。两性离子水凝胶包括两性离子‑苯硼酸聚合物以及聚乙烯醇；所述的两性离子‑苯硼酸聚合物由两性离子与含苯硼酸的单体聚合而成。本发明所提出的利用智能两性离子水凝胶低体温保存细胞并且实时监测体系ROS含量的方法，角度新颖，具有较高的灵敏度和稳定性，可以显著延长细胞保存时间，在细胞保存、细胞诊断、细胞治疗等方面具有应用前景。
Description
技术领域
本发明属于细胞保存领域，具体涉及一种低体温保存细胞并实时监测ROS含量的水凝胶及制备和应用。
背景技术
近年来，基于细胞治疗和细胞诊断的突破性发展以及大规模临床试验研究表明，细胞的细胞活性及功能会直接影响最终的治疗效果，这对作为支撑技术的细胞保存技术也提出了越来越高的要求。目前根据保存温度的不同，细胞保存方法主要分为超低温冻存法和低体温保存法。
超低温冻存法作为目前应用最广泛的细胞保存法，通过将细胞置于超低温条件下(-80℃至-196℃)完全暂停其细胞代谢进程来实现细胞几个月甚至几年的长期保存。然而，高浓度有机冻存保护剂的添加(如10％二甲亚砜或者40％甘油等)，不仅会造成细胞表型的紊乱和活性降低，同时在应用时残留的保护剂又会对患者造成肾、肝功能损伤和视神经障碍等多种不良影响。除此之外，冻存过程中复杂的操作程序、严苛的保存环境(液氮环境)和专业的设备要求也大大阻碍了该技术的广泛应用。
除了超低温冻存法之外，在低体温(0℃-35℃)条件下，利用保存液进行的低体温保存法是另一种极具潜力的细胞保存方式。在低体温条件下，细胞周期和生理进程大幅度减缓，使细胞在该条件下具有长期保存潜力；同时与超低温冻存相比，简单的操作、更低的成本和更高的保存效率也使其成为目前应用更加广泛的细胞保存技术。但低体温条件是一把双刃剑，虽可以延缓细胞代谢，同时也会造成细胞损伤。由于该条件下温度显著低于生理温度，线粒体内的氧化磷酸化反应无法充分进行，活性氧(ROS)作为副产物被大量产出；与此同时，胞内可催化过氧化物分解的酶活性显著降低，导致细胞自身抗氧化能力降低，从而使得细胞由于ROS过量而引起抗氧化防御系统失衡，进而导致细胞损伤。为此，传统细胞体系的低体温保存会添加细胞保护液(如抗氧化剂谷胱甘肽GSH、维生素E等)，以暂缓ROS过量引发的细胞损伤。但保护液的快速消耗以及高频率更换又会造成不必要的细胞损失、样本污染和运输操作不便等问题。
除了上述ROS损伤问题，近年大量的研究也表明，细胞外基质(ECM)构建的三维网络环境对细胞的活性、基因表达乃至分化具有决定性作用；传统的2D细胞培养和保存(细胞冻存管、离心管或表面皿)无法完全模拟体内细胞ECM，导致细胞的生理活性水平以及特异性功能与体内细胞相差甚远。离体细胞由于丧失ECM的包裹和环境的变化也会快速进入失巢凋亡程序，对细胞的体外培养和保存均造成了巨大阻碍。因此，在低体温溶液保存时，细胞在遭受低体温冷应激诱导的ROS损伤的同时，也会经受失去ECM支撑所引发的“失巢凋亡”，从而造成大量细胞凋亡或不可逆的细胞损伤风险。所以低体温条件下，传统溶液保存的细胞仅能维持几小时到几周的细胞活力，给偏远、交通不便利的地区细胞治疗和诊断带来了难以克服的困难。近年来，具备三维网络结构和亲水性的水凝胶材料逐渐在组织工程或细胞生物学研究中作为细胞外基质模拟物被广泛应用。然而，目前包埋细胞的水凝胶存在不易解离，造成内部细胞难以回收等问题，限制了其在细胞低体温保存领域的应用。
因此，在低体温条件下，如何突破现有保存技术的瓶颈，延长细胞的活性和功能稳定时间，并尽可能地减小低体温引发ROS过量对细胞的损伤影响等问题亟需新的技术和材料进行解决，对细胞治疗和诊断有着十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺点，提供一种低体温保存细胞并实时监测ROS含量的水凝胶及制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种低体温保存细胞并能实时监测ROS含量的水凝胶，其特征在于，两性离子-苯硼酸聚合物以及聚乙烯醇；所述的两性离子-苯硼酸聚合物由两性离子与含苯硼酸的单体聚合而成。
所述的两性离子材料为羧基甜菜碱、磺基甜菜碱、磷酸甜菜碱中的一种或几种混合物。
所述的含苯硼酸的单体为2-甲氧基苯基硼酸、3-甲基丙烯酰胺基苯基硼酸、4-乙烯基苯基硼酸、4-叔丁基苯基硼酸、3-氨基苯基硼酸中的一种或几种的混合物。
所述的两性离子-苯硼酸聚合物具体采用下述方式制备：将两性离子材料、含苯硼酸的单体溶于水和二甲基亚砜的混合溶液中，超声使其完全溶解，随后加入热引发剂和促进剂，充分搅拌均匀后油浴反应得到聚合物溶液；反应结束后，将产物置于透析袋中透析至少4天，最后使用冷冻干燥机将透析溶液冻干，得到白色产物即两性离子-苯硼酸聚合物。
所述的两性离子材料、含苯硼酸的单体的质量比为1:0.1-0.2255。优选的，所述的两性离子材料、含苯硼酸的单体的质量比为1:0.1。
本发明还包括一种所述的低体温保存细胞并能实时监测ROS含量的水凝胶的制备方法，包括下述步骤：用PBS作为溶剂，将两性离子-苯硼酸聚合物以及聚乙烯醇分别配制成一定浓度的溶液，之后将两种溶液进行混合即可得到所需水凝胶。
所述的两性离子-苯硼酸聚合物溶液的浓度为2.5-5wt％。
所述的聚乙烯醇溶液的浓度为2.5-10wt％。
本发明还包括一种所述的低体温保存细胞并能实时监测ROS含量的水凝胶的应用，应用于保存细胞；
所述的细胞为人宫颈癌细胞Hela、人低分化肺腺癌细胞GLC-82、人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞、人肺癌细胞A549、人肺癌细胞H1299中的一种。
本发明还包括一种所述的低体温保存细胞并能实时监测ROS含量的水凝胶的应用，应用于ROS的实时监测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明所制备的水凝胶可以模拟细胞外基质的三维环境，来保存从组织中取出而不能独立存活的细胞，显著延长细胞保存时间及保存效率，同时又不会影响细胞的正常功能比如细胞增殖、粘附等而影响检测；
(2)由于水凝胶中的硼酸酯键交联位点会被ROS氧化、断裂，因此赋予了水凝胶清除、实时监测ROS的特性。同时，通过ROS响应水凝胶内硼酸酯键的断裂而产生微小溶胀，从而引起凝胶整体电阻的变化，通过外接电源和显示器，实现实时监测电阻变化反映ROS的含量指标；
(3)在低体温条件下进行保存时，依然具有高效细胞保存能力，为许多不能超低温冷冻保存的细胞(如心肌细胞)提供了一种新型、有效的保存方法，并且为在恶劣环境下的细胞运输提供了一种适宜、方便、高效的运输技术；
(4)如果需要从水凝胶中分离出细胞，可以利用水凝胶的葡萄糖响应解离特性，加入葡萄糖溶液温和解离凝胶、无损回收样本细胞用于细胞功能检测分析。
本发明为了解决现有技术中保存以及运输细胞的不足之处，设计合成了兼具ROS响应、葡萄糖解离的新型智能两性离子水凝胶，并开发出基于智能水凝胶的细胞保存新策略，实现低体温条件下细胞成活时间延长以及体系内ROS含量实时监测以在适当时间加入抗氧化剂；保存后，利用水凝胶葡萄糖响应特性解离温和回收细胞进行后续功能分析检测；最后系统揭示新材料延长细胞寿命的具体机制。
本发明可有效延长细胞的寿命，实时监测保存过程中样本体系的ROS含量避免细胞损伤，维持细胞功能用于检测分析，实现细胞保存期的显著延长，为细胞治疗和疗效的实时监控提供有力支持，具有较大的医疗应用价值。生物相容性的水凝胶由于具有模拟组织三维网状结构的性质，因此已被成功应用于模拟组织包裹细胞的组织工程领域中，而本发明利用的正是生物相容性的智能两性离子水凝胶来模拟细胞外基质包裹细胞，使细胞感受到仿佛仍生长于组织的三维包裹环境中，并且在低体温环境下细胞仍能较长时间存活。
本发明所提供的细胞保存的方法是一种长效、简便、无害的方法，基于生物相容性智能两性离子水凝胶构建细胞生存微环境、并且能够实时监测被保存细胞产生的ROS水平的细胞保存方法还未见报道，提出的有效而又简便的低体温保存方式具有迫切的现实意义和应用价值。
另外，本发明的另一个优势是，无论是包裹还是分离出细胞都是温和的方法，此方法无害、高效而又简便，大大优于直接用有毒的化学试剂交联将细胞包裹在水凝胶中来模拟组织的方法；在恶劣环境，不同温度，不同CO2浓度条件下依然对细胞有强大的维持细胞活性能力，以适应不同恶劣环境下的运输条件和检测条件。
本发明所提出的利用智能两性离子水凝胶低体温保存细胞并且实时监测体系ROS含量的方法，角度新颖，具有较高的灵敏度和稳定性，可以显著延长细胞保存时间，在细胞保存、细胞诊断、细胞治疗等方面具有应用前景。
附图说明
图1是智能两性离子水凝胶保存细胞的原理示意图。
图2是本发明所制备的材料的示意图。
图3是以实施例及对比实施例中所制备的水凝胶的体外ROS响应性能。
图4是本发明制备的智能两性离子水凝胶实时监测ROS并添加抗氧化剂GSH的示意图。
图5是以实施例及对比实施例中所制备的水凝胶保存细胞时的ROS响应性能。
图6是以实施例中所制备的智能两性离子水凝胶保存细胞的细胞存活率结果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明提供了一种能低体温保存细胞并实时监测ROS含量的智能两性离子水凝胶的设计与制备。所述智能两性离子水凝胶是由两性离子-苯硼酸聚合物与聚乙烯醇混合而成的，图1是智能两性离子水凝胶保存细胞的原理示意图，两性离子-苯硼酸聚合物与含细胞的聚乙烯醇溶液混合形成硼酸酯键，从而立即凝胶化。在低体温保存过程中，细胞产生的ROS含量不断增加，使水凝胶中的部分硼酸酯键氧化断裂而溶胀，凝胶内部离子浓度降低，从而使整体电阻升高。
图2为本发明所制备的材料分子式，含苯硼酸基团的苯硼酸衍生物可以与聚乙烯醇形成硼酸酯键交联位点，ROS可以氧化部分硼酸酯键断裂，并且由于苯硼酸与葡萄糖的相互作用比与PVA的相互作用强，因此，本发明所制备的智能两性离子水凝胶可以通过加入葡萄糖溶液而解离。
图3为本发明实施例2制备的智能两性离子水凝胶体外ROS响应性能。用H2O2溶液作为ROS模型，随着H2O2浓度和含量增加，智能两性离子水凝胶的电阻增加，而对比例PCBMA水凝胶的电阻几乎没有变化。
图4为本发明实施例2制备的智能两性离子水凝胶实时监测ROS并添加抗氧化剂GSH的示意图。随着细胞保存时间的延长，智能两性离子水凝胶的电阻开始增加，说明细胞产生的ROS水平增加；加入清除过量ROS的抗氧化剂GSH后，水凝胶不再继续溶胀，电阻趋于平衡；当水凝胶电阻再次增加时，表明GSH已耗尽。
图5为本发明实施例2制备的智能两性离子水凝胶保存细胞时的ROS响应性能，智能两性离子的电阻变化情况与图4所描述一致，而对比例PCBMA水凝胶的电阻几乎不变。
图6为智能两性离子水凝胶保存细胞存活率结果图。
对比实施例：将羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯(1g)溶于3mL去离子水中，超声使其完全溶解。随后加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺(交联剂)(0.0125g)、过硫酸铵(热引发剂)(0.005g)和四甲基乙二胺(促进剂)(10μL)，充分搅拌均匀后，超声振荡得到预反应溶液，迅速将预反应溶液加入聚四氟乙烯模具中，60℃条件下聚合6h后将其置于PBS溶液中孵育5天以完全溶胀，使用台式冻干机冷冻干燥以获得前体PCBMA水凝胶。通过将前体PCBMA水凝胶溶解在PBS中，即得到所述不含硼酸酯键的PCBMA水凝胶(10wt％)。
实施例1：利用两性离子材料磺基甜菜碱、含苯硼酸的4-乙烯基苯基硼酸、含羟基的聚乙烯醇制备智能两性离子水凝胶，实时监测体系内ROS含量并在适当时间加入抗氧化剂GSH。
(1)将磺基甜菜碱(1g)、4-乙烯基苯基硼酸(0.1g)溶于水和二甲基亚砜混合溶液(v/v＝1:1)(4.8mL)中，超声使其完全溶解，随后加入过硫酸铵(热引发剂)(0.0011g)和四甲基乙二胺(促进剂)(10μL)，充分搅拌均匀后60℃油浴反应6h得到聚合物溶液。反应结束后，将产物置于透析袋(1kDa)中透析至少4天，最后使用冷冻干燥机将透析溶液冻干，得到白色产物即两性离子-苯硼酸聚合物(以下简称聚合物)。
(2)用PBS作为溶剂，将制备的聚合物和聚乙烯醇分别配制成5wt％的溶液，通过等体积混合两种溶液得到不含细胞的两性离子水凝胶。
用PBS作为溶剂，将制备的聚合物配制成5wt％的溶液，将细胞溶液均匀分散于7.5wt％聚乙烯醇溶液中，使溶液最终浓度达5wt％，通过等体积混合两种溶液得到含细胞的两性离子水凝胶。
(3)将不含细胞的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃，研究其体外ROS响应性能。用H2O2溶液作为ROS模型，结果显示智能两性离子水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似。
(4)将含有人宫颈癌细胞Hela的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃保存。通过LCR数字电桥定期测定水凝胶电阻，结果显示智能两性离子水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似：随着保存时间的延长，智能两性离子水凝胶具有ROS响应性能，而对照组PCBMA水凝胶的电阻几乎没有变化。
(5)将含有人宫颈癌细胞Hela的智能两性离子水凝胶置于冰箱4℃保存。通过荧光染色的方法定期检测水凝胶中的细胞存活率，以此确定细胞的存活状态，24天后，存活率达45％。
实施例2：利用两性离子材料羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯、含苯硼酸的3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸、含羟基的聚乙烯醇制备智能两性离子水凝胶，实时监测体系内ROS含量并在适当时间加入抗氧化剂GSH。
(1)将羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯(1g)、3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸(0.1g)溶于水和二甲基亚砜混合溶液(v/v＝1:1)(4.8mL)中，超声使其完全溶解，随后加入过硫酸铵(热引发剂)(0.0011g)和四甲基乙二胺(促进剂)(10μL)，充分搅拌均匀后60℃油浴反应6h得到聚合物溶液。反应结束后，将产物置于透析袋(1kDa)中透析至少4天，最后使用冷冻干燥机将透析溶液冻干，得到白色产物即聚合物。
(2)用PBS作为溶剂，将制备的聚合物和聚乙烯醇分别配制成5wt％的溶液，通过等体积混合两种溶液得到不含细胞的智能两性离子水凝胶。
用PBS作为溶剂，将制备的聚合物配制成5wt％的溶液，将细胞溶液均匀分散于7.5wt％聚乙烯醇溶液中，使溶液最终浓度达5wt％，通过等体积混合两种溶液得到含细胞的智能两性离子水凝胶。
(3)如图3所示，将不含细胞的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃，研究其体外ROS响应性能。用H2O2溶液作为ROS模型，随着H2O2溶液的浓度和含量增加，智能两性离子水凝胶的电阻增加，而PCBMA水凝胶的电阻几乎没有变化。
(4)将含有人低分化肺腺癌细胞GLC-82的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃保存。通过LCR数字电桥定期测定水凝胶电阻，以此确定水凝胶的ROS响应性能。如图5所示，随着细胞保存时间的延长，智能两性离子水凝胶的电阻开始增加，说明细胞产生的ROS水平增加；加入清除过量ROS的抗氧化剂GSH后，水凝胶不再继续溶胀，电阻趋于平衡；当水凝胶电阻再次增加时，表明GSH已耗尽，以上结果表明智能两性离子水凝胶具有ROS响应性能；而对照组PCBMA水凝胶电阻几乎没有变化。
(5)将含有人低分化肺腺癌细胞GLC-82的智能两性离子水凝胶置于冰箱4℃保存。通过荧光染色的方法定期检测水凝胶中的细胞存活率，以此确定细胞的存活状态，24天后，如图6，存活率达52％，而对照组PBS组几乎无细胞存活。
实施例3：利用两性离子材料磺基甜菜碱、含苯硼酸的3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸、含羟基的聚乙烯醇制备智能两性离子水凝胶，实时监测体系内ROS含量并在适当时间加入抗氧化剂GSH。
(1)将磺基甜菜碱(1g)、3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸(0.1g)溶于水和二甲基亚砜混合溶液(v/v＝1:1)(4.8mL)中，超声使其完全溶解，随后加入过硫酸铵(热引发剂)(0.0011g)和四甲基乙二胺(促进剂)(10μL)，充分搅拌均匀后60℃油浴反应6h得到聚合物溶液。反应结束后，将产物置于透析袋(1kDa)中透析至少4天，最后使用冷冻干燥机将透析溶液冻干，得到白色产物即聚合物。
(2)用PBS作为溶剂，将制备的聚合物和聚乙烯醇分别配制成5wt％的溶液，通过等体积混合两种溶液得到不含细胞的智能两性离子水凝胶。
用PBS作为溶剂，将制备的聚合物配制成5wt％的溶液，将细胞溶液均匀分散于7.5wt％聚乙烯醇溶液中，使溶液最终浓度达5wt％，通过等体积混合两种溶液得到含细胞的智能两性离子水凝胶。
(3)将不含细胞的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃，研究其体外ROS响应性能。用H2O2溶液作为ROS模型，结果显示智能两性离子水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似。
(4)将含有人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃保存。通过LCR数字电桥定期测定水凝胶电阻，结果显示水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似：随着保存时间的延长，智能两性离子水凝胶具有ROS响应性能，而对照组PCBMA水凝胶的电阻几乎没有变化。
(5)将含有人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞的智能两性离子水凝胶置于冰箱4℃保存。通过荧光染色的方法定期检测水凝胶中的细胞存活率，以此确定细胞的存活状态，24天后，存活率达49％。
实施例4：利用两性离子材料羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯、含苯硼酸的2-甲氧基苯基硼酸、含羟基的聚乙烯醇制备智能两性离子水凝胶，实时监测体系内ROS含量并在适当时间加入抗氧化剂GSH。
(1)将羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯(1g)、2-甲氧基苯基硼酸(0.1g)溶于水和二甲基亚砜混合溶液(v/v＝1:1)(4.8mL)中，超声使其完全溶解，随后加入过硫酸铵(热引发剂)(0.0011g)和四甲基乙二胺(促进剂)(10μL)，充分搅拌均匀后60℃油浴反应6h得到聚合物溶液。反应结束后，将产物置于透析袋(1kDa)中透析至少4天，最后使用冷冻干燥机将透析溶液冻干，得到白色产物即聚合物。
(2)用PBS作为溶剂，将制备的聚合物和聚乙烯醇分别配制成5wt％的溶液，通过等体积混合两种溶液得到不含细胞的智能两性离子水凝胶。
用PBS作为溶剂，将制备的聚合物配制成5wt％的溶液，将细胞溶液均匀分散于7.5wt％聚乙烯醇溶液中，使溶液最终浓度达5wt％，通过等体积混合两种溶液得到含细胞的智能两性离子水凝胶。
(3)将不含细胞的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃，研究其体外ROS响应性能。用H2O2溶液作为ROS模型，结果显示智能两性离子水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似。
(4)将含有人肺癌细胞A549的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃保存。通过LCR数字电桥定期测定水凝胶电阻，结果显示水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似：随着保存时间的延长，智能两性离子水凝胶具有ROS响应性能，而对照组PCBMA水凝胶的电阻几乎没有变化。
(5)将含有人肺癌细胞A549的智能两性离子水凝胶置于冰箱4℃保存。通过荧光染色的方法定期检测水凝胶中的细胞存活率，以此确定细胞的存活状态，24天后，存活率达51％。
实施例5：利用两性离子材料羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯、含苯硼酸的3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸、含羟基的聚乙烯醇制备智能两性离子水凝胶，实时监测体系内ROS含量并在适当时间加入抗氧化剂GSH。
(1)将羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯(1g)、3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸(0.1g)溶于水和二甲基亚砜混合溶液(v/v＝1:1)(4.8mL)中，超声使其完全溶解，随后加入过硫酸铵(热引发剂)(0.0011g)和四甲基乙二胺(促进剂)(10μL)，充分搅拌均匀后60℃油浴反应6h得到聚合物溶液。反应结束后，将产物置于透析袋(1kDa)中透析至少4天，最后使用冷冻干燥机将透析溶液冻干，得到白色产物即聚合物。
(2)用PBS作为溶剂，将制备的聚合物和聚乙烯醇分别配制成5wt％的溶液，通过混合两种溶液(v/v＝1:2)得到不含细胞的智能两性离子水凝胶。
用PBS作为溶剂，将制备的聚合物配制成5wt％的溶液，将细胞溶液均匀分散于7.5wt％聚乙烯醇溶液中，使溶液最终浓度达5wt％，通过混合两种溶液(v/v＝1:2)得到含细胞的智能两性离子水凝胶。
(3)将不含细胞的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃，研究其体外ROS响应性能。用H2O2溶液作为ROS模型，结果显示智能两性离子水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似。
(4)将含有人宫颈癌细胞Hela的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃保存。通过LCR数字电桥定期测定水凝胶电阻，结果显示水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似：随着保存时间的延长，智能两性离子水凝胶具有ROS响应性能，而对照组PCBMA水凝胶的电阻几乎没有变化。
(5)将含有人宫颈癌细胞Hela的智能两性离子水凝胶置于冰箱4℃保存。通过荧光染色的方法定期检测水凝胶中的细胞存活率，以此确定细胞的存活状态，24天后，存活率达37％，对照组PBS组几乎无细胞存活。
实施例6：利用两性离子材料羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯、含苯硼酸的3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸、含羟基的聚乙烯醇制备智能两性离子水凝胶，实时监测体系内ROS含量并在适当时间加入抗氧化剂GSH。
(1)将磺基甜菜碱(1g)、3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸(0.1g)溶于水和二甲基亚砜混合溶液(v/v＝1:1)(4.8mL)中，超声使其完全溶解，随后加入过硫酸铵(热引发剂)(0.0011g)和四甲基乙二胺(促进剂)(10μL)，充分搅拌均匀后60℃油浴反应6h得到聚合物溶液。反应结束后，将产物置于透析袋(1kDa)中透析至少4天，最后使用冷冻干燥机将透析溶液冻干，得到白色产物即聚合物。
(2)用PBS作为溶剂，将制备的聚合物和聚乙烯醇分别配制成5wt％的溶液，通过混合两种溶液(v/v＝2:1)得到不含细胞的智能两性离子水凝胶。
用PBS作为溶剂，将制备的聚合物配制成5wt％的溶液，将细胞溶液均匀分散于7.5wt％聚乙烯醇溶液中，使溶液最终浓度达5wt％，通过混合两种溶液(v/v＝2:1)得到含细胞的智能两性离子水凝胶。
(3)将不含细胞的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃，研究其体外ROS响应性能。用H2O2溶液作为ROS模型，结果显示智能两性离子水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似。
(4)将含有人肺癌细胞H1299的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃保存。通过LCR数字电桥定期测定水凝胶电阻，结果显示水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似：随着保存时间的延长，智能两性离子水凝胶具有ROS响应性能，而对照组PCBMA水凝胶的电阻几乎没有变化。
(5)将含有人肺癌细胞H1299的智能两性离子水凝胶置于冰箱4℃保存。通过荧光染色的方法定期检测水凝胶中的细胞存活率，以此确定细胞的存活状态，24天后，存活率达43％，对照组PBS组几乎无细胞存活。
实施例7：利用两性离子材料羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯、含苯硼酸的3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸、含羟基的聚乙烯醇制备智能两性离子水凝胶，实时监测体系内ROS含量并在适当时间加入抗氧化剂GSH。
(1)将羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯(1g)、3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸(0.1g)溶于水和二甲基亚砜混合溶液(v/v＝1:1)(4.8mL)中，超声使其完全溶解，随后加入过硫酸铵(热引发剂)(0.0011g)和四甲基乙二胺(促进剂)(10μL)，充分搅拌均匀后60℃油浴反应6h得到聚合物溶液。反应结束后，将产物置于透析袋(1kDa)中透析至少4天，最后使用冷冻干燥机将透析溶液冻干，得到白色产物即聚合物。
(2)用PBS作为溶剂，将制备的聚合物配制成5wt％的溶液，将聚乙烯醇配制成2.5wt％的溶液，通过等体积混合两种溶液得到不含细胞的智能两性离子水凝胶。
用PBS作为溶剂，将制备的聚合物配制成5wt％的溶液，将细胞溶液均匀分散于5wt％聚乙烯醇溶液中，使溶液最终浓度达2.5wt％，通过等体积混合两种溶液得到含细胞的智能两性离子水凝胶。
(3)将不含细胞的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃，研究其体外ROS响应性能。用H2O2溶液作为ROS模型，结果显示智能两性离子水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似。
(4)将含有人低分化肺腺癌细胞GLC-82的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃保存。通过LCR数字电桥定期测定水凝胶电阻，结果显示水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似：随着保存时间的延长，智能两性离子水凝胶具有ROS响应性能，而对照组PCBMA水凝胶的电阻几乎没有变化。
(5)将含有人低分化肺腺癌细胞GLC-82的智能两性离子水凝胶置于冰箱4℃保存。通过荧光染色的方法定期检测水凝胶中的细胞存活率，以此确定细胞的存活状态，24天后，存活率达39％，对照组PBS组几乎无细胞存活。
实施例8：利用两性离子材料羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯、含苯硼酸的3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸、含羟基的聚乙烯醇制备智能两性离子水凝胶，实时监测体系内ROS含量并在适当时间加入抗氧化剂GSH。
(1)将羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯(1g)、3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸(0.1g)溶于水和二甲基亚砜混合溶液(v/v＝1:1)(4.8mL)中，超声使其完全溶解，随后加入过硫酸铵(热引发剂)(0.0011g)和四甲基乙二胺(促进剂)(10μL)，充分搅拌均匀后60℃油浴反应6h得到聚合物溶液。反应结束后，将产物置于透析袋(1kDa)中透析至少4天，最后使用冷冻干燥机将透析溶液冻干，得到白色产物即聚合物。
(2)用PBS作为溶剂，将制备的聚合物配制成5wt％的溶液，将聚乙烯醇配制成10wt％的溶液，通过等体积混合两种溶液得到不含细胞的智能两性离子水凝胶。
用PBS作为溶剂，将制备的聚合物配制成5wt％的溶液，将细胞溶液均匀分散于20wt％聚乙烯醇溶液中，使溶液最终浓度达10wt％，通过等体积混合两种溶液得到含细胞的智能两性离子水凝胶。
(3)将不含细胞的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃，研究其体外ROS响应性能。用H2O2溶液作为ROS模型，结果显示智能两性离子水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似。
(4)将含有人低分化肺腺癌细胞GLC-82的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃保存。通过LCR数字电桥定期测定水凝胶电阻，结果显示水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似：随着保存时间的延长，智能两性离子水凝胶具有ROS响应性能，而对照组PCBMA水凝胶的电阻几乎没有变化。
(5)将含有人低分化肺腺癌细胞GLC-82的智能两性离子水凝胶置于冰箱4℃保存。通过荧光染色的方法定期检测水凝胶中的细胞存活率，以此确定细胞的存活状态，24天后，存活率达40％，对照组PBS组几乎无细胞存活。
实施例9：利用两性离子材料羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯、含苯硼酸的3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸、含羟基的聚乙烯醇制备智能两性离子水凝胶，实时监测体系内ROS含量并在适当时间加入抗氧化剂GSH。
(1)将羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯(1g)、3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸(0.2255g)溶于水和二甲基亚砜混合溶液(v/v＝1:1)(5.5mL)中，超声使其完全溶解，随后加入过硫酸铵(热引发剂)(0.0012g)和四甲基乙二胺(促进剂)(10μL)，充分搅拌均匀后60℃油浴反应6h得到聚合物溶液。反应结束后，将产物置于透析袋(1kDa)中透析至少4天，最后使用冷冻干燥机将透析溶液冻干，得到白色产物即聚合物。
(2)用PBS作为溶剂，将制备的聚合物和聚乙烯醇分别配制成5wt％的溶液，通过等体积混合两种溶液得到不含细胞的智能两性离子水凝胶。
用PBS作为溶剂，将制备的聚合物配制成5wt％的溶液，将细胞溶液均匀分散于7.5wt％聚乙烯醇溶液中，使溶液最终浓度达5wt％，通过等体积混合两种溶液得到含细胞的智能两性离子水凝胶。
(3)将不含细胞的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃，研究其体外ROS响应性能。用H2O2溶液作为ROS模型，结果显示智能两性离子水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似。
(4)将含有人低分化肺腺癌细胞GLC-82的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃保存。通过LCR数字电桥定期测定水凝胶电阻，结果显示水凝胶电阻变化趋势与实施例2中的结果类似：随着保存时间的延长，智能两性离子水凝胶具有ROS响应性能，而对照组PCBMA水凝胶的电阻几乎没有变化。
(5)将含有人低分化肺腺癌细胞GLC-82的智能两性离子水凝胶置于冰箱4℃保存。通过荧光染色的方法定期检测水凝胶中的细胞存活率，以此确定细胞的存活状态，24天后，细胞存活率达21％，对照组PBS组几乎无细胞存活。
实施例10：利用两性离子材料羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯、含苯硼酸的3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸、含羟基的聚乙烯醇制备智能两性离子水凝胶，实时监测体系内ROS含量并在适当时间加入抗氧化剂GSH。
(1)将羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯(1g)、3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸(0.3895g)溶于水和二甲基亚砜混合溶液(v/v＝1:1)(6.3mL)中，超声使其完全溶解，随后加入过硫酸铵(热引发剂)(0.0014g)和四甲基乙二胺(促进剂)(10μL)，充分搅拌均匀后60℃油浴反应6h得到聚合物溶液。反应结束后，将产物置于透析袋(1kDa)中透析至少4天，最后使用冷冻干燥机将透析溶液冻干，得到白色产物即聚合物。
(2)用PBS作为溶剂，将制备的聚合物和聚乙烯醇分别配制成5wt％的溶液，通过等体积混合两种溶液得到不含细胞的智能两性离子水凝胶。
用PBS作为溶剂，将制备的聚合物配制成5wt％的溶液。将细胞溶液均匀分散于7.5wt％聚乙烯醇溶液中，使溶液最终浓度达5wt％，等体积混合两种溶液得到含细胞的智能两性离子水凝胶。
(3)将不含细胞的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃，研究其体外ROS响应性能。用H2O2溶液作为ROS模型，结果显示智能两性离子水凝胶的电阻几乎没有变化，这是由于所制备的聚合物溶液交联度过高，与PVA溶液等体积混合几乎不再形成硼酸酯键。
(4)将含有人低分化肺腺癌细胞GLC-82的智能两性离子水凝胶外接入电源与显示器并置于冰箱4℃保存。通过LCR数字电桥定期测定水凝胶电阻，随着细胞保存时间的延长，水凝胶的电阻几乎没有变化，这是由于所制备的聚合物溶液交联度过高，与PVA溶液等体积混合几乎不再形成硼酸酯键。
(5)将含有人低分化肺腺癌细胞GLC-82的智能两性离子水凝胶置于冰箱4℃保存。通过荧光染色的方法定期检测水凝胶中的细胞存活率，以此确定细胞的存活状态，6天后，存活率为7％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种水凝胶在低体温保存细胞并实时监测ROS含量的应用，其特征在于，通过ROS响应水凝胶内硼酸酯键的断裂而产生微小溶胀，从而引起凝胶整体电阻的变化，通过外接电源和显示器，实现实时监测电阻变化反映ROS的含量指标；所述的水凝胶包括两性离子-苯硼酸聚合物以及聚乙烯醇；所述的两性离子-苯硼酸聚合物由两性离子材料与含苯硼酸的单体聚合而成；
所述的两性离子材料为羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯；所述的含苯硼酸的单体为3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸或者4-乙烯基苯基硼酸；
所述的水凝胶的制备方法，包括下述步骤：用PBS作为溶剂，将两性离子-苯硼酸聚合物以及聚乙烯醇分别配制成一定浓度的溶液，之后将两种溶液进行混合即可得到所需水凝胶。
2.根据权利要求1所述的水凝胶在低体温保存细胞并实时监测ROS含量的应用，其特征在于，所述的两性离子-苯硼酸聚合物具体采用下述方式制备：将两性离子材料、含苯硼酸的单体溶于水和二甲基亚砜的混合溶液中，超声使其完全溶解，随后加入热引发剂和促进剂，充分搅拌均匀后油浴反应得到聚合物溶液；反应结束后，将产物置于透析袋中透析至少4天，最后使用冷冻干燥机将透析溶液冻干，得到白色产物即两性离子-苯硼酸聚合物。
3.根据权利要求2所述的水凝胶在低体温保存细胞并实时监测ROS含量的应用，其特征在于，所述的两性离子材料、含苯硼酸的单体的质量比为1:0.1-0.2255。
4.根据权利要求1所述的水凝胶在低体温保存细胞并实时监测ROS含量的应用，所述的两性离子-苯硼酸聚合物溶液的浓度为2.5-5 wt%。
5.根据权利要求1所述的水凝胶在低体温保存细胞并实时监测ROS含量的应用，所述的聚乙烯醇溶液的浓度为2.5-10 wt%。
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