CN111286044B - 用于保存细胞的双温敏磁性水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞保存领域，具体涉及一种用于保存细胞的双温敏磁性水凝胶及其制备方法和应用。用于保存细胞的双温敏磁性水凝胶的制备方法采用下述步骤：(1)水凝胶材料包埋磁性纳米粒子，得到磁性水凝胶微球；(2)将双温敏高分子聚合物修饰在步骤(1)得到的磁性水凝胶微球表面，得到磁性双温敏水凝胶颗粒。本发明的双温敏磁性水凝胶在冰箱冷藏温度(4℃)以下和室温(25℃)以上的环境温度下自组装成胶，从而模拟细胞外基质的三维结构进行长时、高效保存细胞，同时用简单的物理手段在细胞于材料分离的温度下将细胞回收。该方法有效解决了传统细胞保存方式中出现的温度选择性差、保存剂具有毒性、细胞存活率较低和细胞回收困难等问题。

Description

用于保存细胞的双温敏磁性水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于细胞保存领域，具体涉及一种用于保存细胞的双温敏磁性水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
随着医疗技术的提高，利用细胞进行研究和应用的液体活检、组织培养等新型生物手段随之出现，而这些技术手段的发展前提是细胞的长效高效保存。而传统的细胞保存手段主要是利用超低温度(零下196℃)和溶液保护剂的环境下，细胞进入无代谢或慢代谢状态进而长时间冻存细胞。但由于此方法涉及极端环境、复杂操作、毒性试剂等因素，因此近年来大量的研究人员将精力投入了低体温(0℃-37℃)细胞保存。
在细胞低体温保存中，最为广泛研究的水凝胶作为保护剂的细胞保存手段自提出就引起了较高的关注度：利用具有生物相容性的水凝胶形成细胞外基质模拟环境进而包裹细胞以达到保存细胞的目的。这种方案不仅具有三维细胞培养的优点，同时也能够在一定程度上完成细胞保存时效的要求。但生物相容性水凝胶低体温保存技术中仍然存在有很多问题如：1)水凝胶化学交联过程中会损伤细胞，无法保证细胞的自然形状，同时其交联后形成的孔隙大小无法满足细胞养料的吸收和代谢废物的排出。2)水凝胶保存体系目前只能在4℃(冰箱温度)时维持细胞保存时长的基本水平，无法在常温或其他温度进行长时间保存，保存温度的选择性较差。3)水凝胶交联体系形成后无法简单分离如图1，并且在通过复杂分离手段后，细胞存活率会相应下降。因此，解决以上问题十分重要。目前我们通过开发双温敏高分子材料表面修饰的磁性水凝胶微球，以获得在多环境温度下，长效保存快速分离细胞的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺点，提供一种用于保存细胞的双温敏磁性水凝胶及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于保存细胞的双温敏磁性水凝胶的制备方法，采用下述步骤：
(1)水凝胶材料包埋磁性纳米粒子，得到磁性水凝胶微球；
(2)将双温敏高分子聚合物修饰在步骤(1)得到的磁性水凝胶微球表面，得到磁性双温敏水凝胶颗粒；
所述的水凝胶为具有生物相容性的天然或人工合成材料。
所述的水凝胶为葡聚糖、海藻糖、海藻酸盐、明胶、聚乙二醇、聚羧基甜菜碱、聚磺基甜菜碱、聚磷酸胆碱、聚乳酸、聚乙烯醇、或者聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱中的一种或者组合。
所述的温敏高分子聚合物由N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸二甲氨基酯、壳聚糖、甲基丙烯酸羟丙酯、N,N-二乙基丙烯酰胺、磺酸基甜菜碱、乙烯基吡咯烷酮、N-丙烯酰胺基葡糖酰胺、甲基丙烯酰胺、N-丙烯酰胺基甘氨酰胺、羧基甜菜碱、乙烯基吡咯烷酮、丙烯酸、丙烯腈、聚乙烯醇、聚乙二醇中的两种或两种以上的单体聚合得到。
所述的温敏高分子聚合物同时具有最高临界溶液温度UCST和最低临界溶液温度LCST。
所述的磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子、三氧化二铁纳米粒子、铁酸镍纳米粒子、钴酸镍纳米粒子、铁酸钴纳米粒子中的一种。
本发明还包括一种所述的制备方法得到的用于保存细胞的双温敏磁性水凝胶。
本发明还包括一种所述的用于保存细胞的双温敏磁性水凝胶的应用，采用下述步骤：
(1)选取10μm～1000μm所述的用于保存细胞的双温敏磁性水凝胶；与细胞以任意比例均匀混合并500～2000rpm离心富集保存；
(2)保存完毕后将保存体系分散于溶液中后，再悬浮，利用磁铁将磁性双温敏水凝胶颗粒吸走后获得细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的用于保存细胞的双温敏磁性水凝胶在冰箱冷藏温度(4℃)以下和室温(25℃)以上的环境温度下自组装成胶，从而模拟细胞外基质的三维结构进行长时、高效保存细胞，同时用简单的物理手段在细胞于材料分离的温度下将细胞回收。该方法有效解决了传统细胞保存方式中出现的温度选择性差、保存剂具有毒性、细胞存活率较低和细胞回收困难等问题。
与传统细胞保存技术手段相比，本发明的优点包括:
(1)、相比于传统方法采用的溶液保护剂和水凝胶保存体系，本方案所提出的细胞保存方法首次将温敏材料相转变成胶和磁性分离纯物理手段相结合，原理图2示出。创新性的利用温度控制将该材料作为“细胞外基质模块”组装堆积保存细胞、隔离干扰细胞的接触影响，并利用磁响应实现模块解组装快速回收细胞。整体过程不涉及化学试剂的加入和化学反应的进行，既避免了溶液保存剂的细胞毒性，又避免了水凝胶体系解交联过程中造成的细胞破损，达到了高效、长效和安全地细胞保存目的。
(2)、相较于传统方案中超低温冻存环境或低体温固定温度保存环境，本方案提出了一种具有良好温度选择性的保存方案。利用双温敏体系4℃以下和25℃以上成胶相转变保存细胞的原理，环境温度在0℃-4℃冰箱温度和25℃-37℃常温的常见温度区间均可以长效保存。对于低体温0℃-37℃中任意特殊温度及区间，也可以通过改变温敏材料体系设计制备出其他针对性的温敏水凝胶微球，大大提升了本方案的应用空间。
(3)、传统细胞保存方案中，回收细胞时所涉及的细胞与保存剂分离操作既提升了整体工作量又造成了细胞的大量破坏，大幅限制了传统保存手段的应用场景。本方案利用磁性纳米粒子的磁吸附性质，在分离操作时用磁铁一步分离磁性水凝胶微球和细胞，达到快速物理分离回收细胞的目的。
附图说明
图1：现有技术中水凝胶包裹保存细胞原理示意图；
图2：本发明双温敏水凝胶微球自组装成胶包裹细胞的原理示意图；
图3：本发明磁性双温敏水凝胶微球保存细胞的方法示意图；
图4：本发明实施例2中所制备的磁性双温敏聚乙二醇微球保存细胞的存活率柱状图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
一种温敏磁性水凝胶用于保存细胞的方法，过程如图3所示。采用下述步骤：
(1)水凝胶材料包埋磁性纳米粒子，得到磁性水凝胶微球；
(2)将双温敏高分子聚合物修饰在步骤(1)得到的磁性水凝胶微球表面，得到磁性双温敏水凝胶颗粒；
(3)选取10μm～1000μm所述的用于保存细胞的双温敏磁性水凝胶；与细胞以任意比例均匀混合并500～2000rpm离心富集保存；
(4)保存完毕后将保存体系分散于溶液中后，再悬浮，利用磁铁将磁性双温敏水凝胶颗粒吸走后获得细胞。
对比实施例:利用海藻酸钠水凝胶在4℃保存细胞。
(1)取1ml UW溶液(the University of Wisconsin solution)，向其中加入1％海藻酸钠和106贴壁人肺癌细胞GCL-82细胞的悬浮液500μL，通过添加10％CaCl2使体系交联形成水凝胶包裹细胞。交联完成后，立即用荧光染色的方法测细胞存活率，发现存活率为83％。
将含有保存体系的离心管置于生物用冰箱4℃恒温培养。通过荧光染色的方法定期检测离心管中细胞的存活率，以此确定细胞的存活状态，2天后，存活率70％；5天后，存活率为54％。
(2)解交联分离细胞：向体系中添加1％的交联溶解剂(柠檬酸钠)，溶解4小时后经过2000rpm离心分离水凝胶和细胞，通过荧光染色法测定此时细胞存活率为45％。
实施例1(1)利用温敏材料甲基丙烯酸二甲氨基酯和磺酸基甜菜碱制备双温敏高分子，表面接枝改性包埋磁性粒子聚磷酸胆碱微球，在25℃保存细胞。
将500mg磷酸胆碱、100mg四氧化三铁纳米粒子溶于去离子水中，同时将6g司盘80、10mgKPS溶于120ml己烷中。将两者混合后，在氮气保护下40℃搅拌4小时得到磁性磷酸胆碱微球。将3.5g甲基丙烯酸二甲氨基酯和1.5g磺酸基甜菜碱、15mgAIBN、30mgAMSD溶于甲醇溶液后，在氮气保护下25℃搅拌6小时得双温敏高分子聚合物。将微球和温敏高分子混合后，向体系加入50mgEDC和200mgDCC，在氮气保护下60℃搅拌1小时得到双温敏磁性水凝胶微球。
选取30mg双温敏磁性水凝胶微球，用RPMI-1640培养基分散放入15mL无菌离心管中，取106个贴壁人脐静脉内皮细胞HUVEC的细胞悬液500μL分散到离心管内，与微球振荡混合并800rpm离心富集后，立即用荧光染色的方法测细胞存活率，发现存活率100％。
将含有保存体系的离心管在置于二氧化碳培养箱中25℃恒温培养。通过荧光染色的方法定期检测离心管中细胞的存活率，以此确定细胞的存活状态，15天后，存活率为82％。
(2)通过磁分离回收细胞
将保存体系置于20℃环境下至体系形成溶液状混合物，用磁铁分离出磁性微球，将剩余的细胞悬液取走重新获得细胞，通过荧光染色法测定此时细胞存活率为80％。
实施例2:(1)利用温敏材料N-异丙基丙烯酰胺和磺酸基甜菜碱制备双温敏高分子，表面接枝改性磁性聚羧基甜菜碱微球，在4℃保存细胞：
将500mg羧基甜菜碱、100mg四氧化三铁纳米粒子溶于去离子水中，同时5mgBPO和6g吐温80溶于120ml己烷中。将两者混合后，在氮气保护下45℃搅拌4小时得到聚羧基甜菜碱微球。将7gN-异丙烯丙烯酰胺、1.5g磺酸甜菜碱、20mgAPS、30mgIOMP溶于甲醇溶液后，在氮气保护下40℃搅拌4小时得双温敏高分子聚合物。将微球和温敏高分子混合后，向体系加50mgEDC和200mgDCC在氮气保护下60℃搅拌1小时得到双温敏磁性水凝胶微球。
选取100mg双温敏磁性水凝胶微球用DMEM培养基分散放入15mL无菌离心管中，取107个半贴壁人肾表皮细胞293t细胞的悬浮液500μL分散到离心管内与微球混合均匀并1500rpm离心富集。混合后立即用荧光染色的方法测细胞存活率，发现存活率100％。
将含有保存体系的离心管置于生物用冰箱4℃恒温培养。通过荧光染色的方法定期检测离心管中细胞的存活率，以此确定细胞的存活状态，15天后，如图4所示，存活率高达87.69％。
(2)通过磁分离回收细胞
将保存体系置于20℃环境下至体系形成溶液状混合物，用磁铁分离出磁性微球，将剩余的细胞悬液取走重新获得细胞，通过荧光染色法测定此时细胞存活率为86％。
实施例3:(1)利用温敏材料甲基丙烯酸羟丙酯和羧基甜菜碱制备的双温敏高分子，接枝改性磁性聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱微球，在4℃保存细胞：
将400mg2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、100mg四氧化三铁纳米粒子溶于去离子水中，同时5mgAIBN和6g司盘80溶于120ml己烷中。将两者混合后，在氮气保护下45℃搅拌4小时得到磁性聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱微球。将5g甲基丙烯酸羟丙酯、1.7g羧基甜菜碱、20mgBPO、30mgASMD溶于甲醇溶液后，在氮气保护下40℃搅拌5小时得双温敏高分子聚合物。将微球和温敏高分子混合后，向体系加入50mgEDC和200mgDCC，在氮气保护下60℃搅拌1小时得到双温敏磁性水凝胶微球。
选取100mg双温敏磁性水凝胶微球用DMEM培养基分散放入15mL无菌离心管中，取107个半贴壁人肾表皮细胞293t细胞的悬浮液500μL分散到离心管内与微球混合均匀并1500rpm离心富集。混合后立即用荧光染色的方法测细胞存活率，发现存活率100％。
将含有保存体系的离心管置于生物用冰箱4℃恒温培养。通过荧光染色的方法定期检测离心管中细胞的存活率，以此确定细胞的存活状态，15天后，存活率70％。
(2)通过磁分离回收细胞
将保存体系置于20℃环境下至体系形成溶液状混合物，用磁铁分离出磁性微球，将剩余的细胞悬液取走重新获得细胞，通过荧光染色法测定此时细胞存活率为68％。
实施例4:
(1)利用温敏材料甲基丙烯酰胺和乙烯基吡咯烷酮制备双温敏高分子，表面接枝包埋磁性粒子聚丙烯酸微球，在常温25℃保存细胞。
将700mg丙烯酸、100mg四氧化三铁纳米粒子、5mgKPS和6g吐温80溶于120ml去离子水中。在氮气保护下45℃搅拌4小时得到磁性聚丙烯酸微球。将7g甲基丙烯酰胺、1.5g乙烯基吡咯烷酮、20mgAIBN、30mgIOMP溶于甲醇溶液后，在氮气保护下25℃搅拌6小时得双温敏高分子聚合物。将微球和温敏高分子混合后，向体系加入30mgEDC和175mgDCC，在氮气保护下60℃搅拌30分钟得到双温敏磁性水凝胶微球。
选取40mg双温敏磁性水凝胶微球，用RPMI-1640培养基分散放入15mL无菌离心管中，取106贴壁人肺癌细胞GCL-82细胞的悬浮液500μL分散到离心管内与微球混合均匀并1000rmp离心富集。混合后立即用荧光染色的方法测细胞存活率，发现存活率100％。
将含有保存体系的离心管置于二氧化碳培养箱中25℃恒温培养。通过荧光染色的方法定期检测离心管中细胞的存活率，以此确定细胞的存活状态，15天后，存活率为75％。
(2)通过磁分离回收细胞：将保存体系置于20℃环境下至体系形成溶液状混合物，用磁铁分离出磁性微球，将剩余的细胞悬液取走重新获得细胞，通过荧光染色法测定此时细胞存活率为73％。
实施例5:
(1)利用温敏材料N-异丙基丙烯酰胺、磺酸基甜菜碱和羧基甜菜碱制备双温敏高分子，表面接枝包埋磁性粒子聚丙烯酸微球，在常温25℃保存细胞。
将700mg丙烯酸、100mg四氧化三铁纳米粒子、5mgKPS和6g吐温80溶于120ml去离子水中。在氮气保护下45℃搅拌4小时得到磁性聚丙烯酸微球。将5gN-异丙基丙烯酰胺、1g磺酸基甜菜碱、1.5g羧基甜菜碱、20mgAIBN、30mgIOMP溶于甲醇溶液后，在氮气保护下25℃搅拌6小时得双温敏高分子聚合物。将微球和温敏高分子混合后，向体系加入30mgEDC和175mgDCC，在氮气保护下60℃搅拌30分钟得到双温敏磁性水凝胶微球。
选取40mg双温敏磁性水凝胶微球，用RPMI-1640培养基分散放入15mL无菌离心管中，取106贴壁人肺癌细胞GCL-82细胞的悬浮液500μL分散到离心管内与微球混合均匀并1000rmp离心富集。混合后立即用荧光染色的方法测细胞存活率，发现存活率100％。
将含有保存体系的离心管置于二氧化碳培养箱中25℃恒温培养。通过荧光染色的方法定期检测离心管中细胞的存活率，以此确定细胞的存活状态，15天后，存活率为79％。
(2)通过磁分离回收细胞：将保存体系置于20℃环境下至体系形成溶液状混合物，用磁铁分离出磁性微球，将剩余的细胞悬液取走重新获得细胞，通过荧光染色法测定此时细胞存活率为78％。
所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种用于保存细胞的双温敏磁性水凝胶的制备方法，其特征在于，采用下述步骤：
将500mg羧基甜菜碱、100mg四氧化三铁纳米粒子溶于去离子水中，同时5mgBPO和6g吐温80溶于120ml己烷中；将两者混合后，在氮气保护下45℃搅拌4小时得到聚羧基甜菜碱微球；
将7gN-异丙烯丙烯酰胺、1.5g磺酸甜菜碱、20mgAPS、30mgIOMP溶于甲醇溶液后，在氮气保护下40℃搅拌4小时得双温敏高分子聚合物；
将微球和温敏高分子混合后，向体系加50mgEDC和200mgDCC在氮气保护下60℃搅拌1小时得到双温敏磁性水凝胶微球。
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TW202139837A (zh) * 2020-02-21 2021-11-01 日商Ｊｂｍ股份有限公司 生物材料的保存用組成物
CN111995769B (zh) * 2020-07-30 2022-06-10 东南大学 一种可调控双温敏水凝胶及其制备方法
CN115181381B (zh) * 2022-06-02 2023-11-17 天津大学 低体温保存细胞并实时监测ros含量的水凝胶及制备和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1212124C (zh) * 2003-12-12 2005-07-27 天津大学 可注射温敏性凝胶栓塞材料的制备方法
CN102125535B (zh) * 2011-01-24 2013-01-23 莆田学院 一种双重磁响应温敏微胶囊及其制备方法
CN103214625A (zh) * 2013-04-26 2013-07-24 华南理工大学 一种具有抗蛋白质吸附的温敏性接枝水凝胶及其制备方法
CN103409361A (zh) * 2013-06-24 2013-11-27 上海瀚正生物技术服务有限公司 温敏微载体及其制备工艺和使用方法
CN104920339B (zh) * 2015-06-04 2017-11-03 天津大学 利用生物相容性颗粒保存细胞的方法

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