SE441802B - Magnetiska polymerpartiklar, sett att framstella dessa och anvendning derav - Google Patents

Description

712-6 10 15 20 25 30 35' ”häfta vid varandra i ett magnetfält. Slumpvisa kolli- _ i polymerpartiklarna enligt uppfinningen. Lämpligt mate- šïíüï :enelmulfie 2 stansen avsättes i polymerpartiklarnas porer eller nätverk, varefter de bildade magnetiska polymerpartik- larna associeras med den farmaceutiskt aktiva substansen om denna inte redan är associerad med polymerpartik- larna.

Dessutom omfattar uppfinningen användning vid affinitetskromatografi, immunoadsorbans eller för kvarhållande av en aktiv substans inom ett begränsat område av magnetiska polymerpartiklar med uppburen biologiskt aktiv substans, vilka partiklar omfattar en porös polymer i vars porer eller nätverk är avsatt magnetiskt material, varvid polymerpartiklarna är associerade med den biologiskt aktiva substansen.

Som polymer kan t ex användas en polysackarid, företrädesvis agaros eller stärkelse. En annan lämplig polymer är akrylpolymer. Polymeren bör vara biokompa- tibel. En särskild fördel vid användning vid behandling av däggdjur erhålles om polymeren är bionedbrytbar, såsom stärkelse som nedbrytes enzymatiskt i organismen. Éolymerer som bildar alltför små gitter är ej lämpliga.

Det magnetiska materialet användes i form av partiklar eller en kolloidal lösning, företrädesvis kolloidal ferrit. Kolloidal ferrit finns kommersiellt till- gänglig som ultramikroskopiska (ca 100 Å) ferritpartiklar omgivna av ett tunt skikt (ca 25 Å) av en polymer.

Genom detta polymerskikt hindras partiklarna från att' sioner (Brownska rörelser) med bärarvätskans molekyler kvarhåller partiklarna i kolloidal lösning. Såsom nämnts kan även partikelformigt magnetiskt material införlivas rial är därvid partikelformig ferrit, Fe3O4 eller nickel.

Enligt föreliggande uppfinning framställes de mag- netiska polymerpartiklarna som innehåller kolloidalt magnetiskt material på ett mycket fördelaktigt sätt genom att bringa redan bildad porös polymer, 10 15 20 25 30 35 PÜÛR\ QUALITY 7900712-6 att eventuellt har associerade biologiska ligander, i kontakt med en kolloidal lösningav magnetiskt material.

Efter eventuellt avlägsnande av det magnetiska materialets lösningsmedium kvarstannar det magnetiska materialet i polymeren, troligen genom utfällning i polymerens porer eller nätverk, varigenom polymeren får magnetiska egen- skaper. På detta sätt kan redan framställda polymer- partiklar i efterhand göras magnetiska. Polymerer som redan är substituerade med biologiska ligander finns kommersiellt tillgängliga, vilket gör denna metod ytter- ligt fördelaktig. Om polymeren som sålunda gjorts mag- netisk inte redan har associerade ligander bringas den därefter i kontakt med en biologiskt aktiv substans, vilken därvid associeras med polymeren som tjänar som bärare för substansen.

Genom en annan utföringsform av framställningssättet enligt uppfinningen framställes magnetiska polymerpar- tiklar genom polymerisation av exempelvis akrylmonomerer i närvaro av en kolloidal lösning av magnetiskt material, varvid det magnetiska materialet kommer att kvarstanna i det bildade polymera nätverket. Ett annat sätt är att bringa exempelvis akrylmonomerer i samtidig kontakt med den kolloidala lösningen av magnetiskt material och agaros, varvid akrylmonomererna bringas att polymerisera. De så- lunda bildade magnetiska polymerpartiklarna kan sedan asso- cieras med biologiska ligander, t ex genom den s k BrCN-metoden.

Genom ytterligare en utföringsform av framställninga- sättet enligt uppfinningen framställes polymerpartiklarna genom polymerisation av en monomer i samtidig närvaro av en bryggbildare, en kolloidal lösning av magnetiskt material och den farmaceutiskt aktiva substansen. Härvid blir både det magnetiska materialet och den farmaceutiskt aktiva substansen inlästa i polymergittret. Att därvid f/Ffiíí” ”m” i uuA "Yi l0 15 20 25 30 4 arbeta med en kolloidal lösning av det magnetiska mate- " rialet i stället för partikulärt magnetiskt material är mycket lämpligt. Detta sätt kan t ex genomföras genom polymerisation av akrylmonomerer i närvaro av bryggbildare, enzym (t ex trypsin) och Ferrofluid (kolloidal lösning av ferritpartiklar, varumärke).

Magnetiska polymerpartiklar kan även framställas genom att partikelformigt magnetiskt material bringas i kontakt med polymeriserbara monomerer eller en lösning av en polysackarid, såsom agaros eller stärkelse, varvid de magnetiska polymererna kommer att införlivas i poly- merens nätverk. Dessa magnetiska polymerpartiklar bringas därefter i kontakt med den biologiskt aktiva substansen, 'varigenom den biologiskt aktiva substansen blir asso- cierad med de magnetiska polymerpartiklarna.

De magnetiska polymerpartiklarna enligt uppfinningen, som innehåller kolloidalt magnetiskt material, kan t ex användas vid s k affinitetskromatografi, t ex för att separera enzymer ur en blandning av flera olika enzymer.

Därvid associeras exempelvis en enzyminhibitor, som an- tingen kan vara en specifik inhibitor eller en generell inhibitor eller cofaktor, med de magnetiska polymer- partiklarna; Med en specifik inhibitor menas en inhibitor, som är specifik för endast ett enzym, och så är fallet med de flesta inhibitorer, medan en generell inhibitor däremot kan inhibera flera olika enzymer. När man sätter' dessa polymerpartiklar med därtill associerade inhibitorer till en lösning av flera olika enzymer, kommer inhibi- torerna att binda enzymerna, och efter en tids omröring kan man utskilja det eller de avsedda enzymerna genom att applicera ett magnetiskt fält i eller utanför lös- ningen. De magnetiska partiklarna kommer därvid att samlas vid magneten och resten av lösningen kan avlägsnas. favo/Gill NJAUTV 10 15 20 25 30 7900712-6 5 Enzymerna kan därefter skiljas från de till den magne- tiska bäraren bundna inhibitorerna genom för fackmannen välkända metoder. Exempel på detta användningsområde är eftermagnetiserad Sepharose (från Pharmacia, Sverige) vartill adsorberats den generella inhibitorn adenosin- monofosfat (AMF). Vidare har med framgång använts andra enzymsystem, såsom glukos-6-fosfatdehydrogenas som ad- sorberats till eftermagnetiserad 2',5'-ADP-Sepharose (från Pharmacia, Sverige).

De magnetiska polymerpartiklarna enligt uppfinningen kan vidare användas vid immunoadsorbans. Därvid associeras antikroppar mot humant serumalbumin med Sepharose (från Pharmacia, Sverige) och eftermagnetiseras genom behandling med en kolloidal lösning av magnetiskt mate- rial. Med hjälp av de så på magnetisk bärareuppburna antikropparna kan humant serumalbumin uppfångas.

Såsom nämnts ovan kan det magnetiska materialet an- vändas antingen i form av partiklar eller en kolloidal lösning, alltefter vad som är lämpligt vid olika använd- ningar. Särskilda fördelar erhålles dock vid användning av en kolloidal lösning, bl a genom att, såsom även nämnts ovan, redan bildade polymerer kan eftermagnetiseras.

Genom föreliggande uppfinning åstadkommas även ett mycket fördelaktigt sätt att kvarhâlla en biologiskt, företrädesvis farmaceutiskt aktiv substans inom ett avgränsat område, varvid en mycket mindre mängd av den aktiva substansen behöver insättas än som skulle varit fallet vid samma substans utan användning av sättet enligt uppfinningen.

Ett exempel på detta användningsområde är behandling av blodproppar. Proteolytiska enzymer, såsom plasmin, är kända för sin förmåga att upplösa olika substrat, däribland fibrin (blodproppar). Genom att enligt före- liggande uppfinning associera dessa proteolytiska enzymer 712- 10 _15 20 25 30 35 6 6 till eller innesluta dem i de magnetiska polymerpartik- larna kan enzymerna anrikas och kvarhållas på plats in vivo med hjälp av ett yttre eller inre magnetfält. Man får härvid en lokal koncentration av den verksamma sub- stansen vid behandling av blodproppar, vilket gör att dosen av det proteolytiska enzymet kan avsevärt minskas i förhållande till dosen vid hittills kända metoder.

På analogt sätt som vid behandling av blodproppar kan allmän lokal läkemedelsbehandling âs adkommas, var- vid den aktiva substansen, t ex ettCYt0StatikUmf antingen kopplas via en reversibel svag bindning till bäraren och därefter frigöres på platsen där den skall verka, eller kopplas fast till bäraren där den verkar i bundet skick. På detta sätt erhålles en hög koncentration av den aktiva substansen på den önskade lokalen samtidigtd som man undviker skadliga effekter av den aktiva sub- I stansen i övriga delar av organismen.

Ett annat medicinskt användningsområde är vid s k slow-release av depåer av aktiv substans. Stora fördelar kan uppnås genom tillförsel t ex av insulin eller ste- roider, bundna till eller inneslutna i magnetiska polymer- partiklar enligt uppfinningen, som depâer, varvid de aktiva ämnena kvarhålles i organismen genom anbringande -av ett magnetfält och långsamt får diffundera ut.

Ytterligare ett område inom vilket man kan använda de magnetiska partiklarna enligt föreliggande uppfinning är vid allmänna kemiska, särskilt organisk-kemiska reak- ttioner, varvid de ämnen som skall bringas att reagera med varandra först associeras med en magnetisk bärare enligt föreliggande uppfinning, varefter man genom an- bringande av ett magnetiskt fält åstadkommer en mycket intim kontakt mellan de med bäraren associerade ämnena.

Man får därvid en hög specifik reaktion utan sidoreak- tioner, dvs en mycket hög verkningsgrad, och kan arbeta vid låga koncentrationer. Vidare kan man forcera en interaktion mellan två eller flera komponenter genom anbringandet av ett magnetfält. 10 15 20 25 30 35 7900712-6 7 Vid en annan mycket lovande tillämpning av före- liggande uppfinning har levande mikrober framgångsrikt bakats in i geler av polymera material, såsom poly- sackarider, tillsammans med en kolloidal ferritlösning (Ferrofluid). Härvid erhålles magnetiska immobiliserade mikrober.

Genom att behandla röda blodkroppar med en kolloidal ferritlösning erhålles i högsta mening biokompatibla bärare av biologisk substans. Till dessa kan sedan kopp- las de önskade substanserna. Härvid blir de från början "njurformade" blodkropparna runda. Även liposomer kan behandlas med den kolloidala ferritlösningen, varvid denna tränger in i de lökskalsformade skikten av fett- syror och vatten i liposomerna.

Som illustration till ett förfarande enligt upp- finningen för framställning av magnetiska polymerpartik- lar lämnas nedanstående utföringsexempel, vilka inte skall betraktas som begränsande för uppfinningen. Som framgår för fackmannen kan talrika ändringar och modi- fikationer åstadkommas utan att man avlägsnar sig från uppfinningstanken, sådan den framgår av föreliggande beskrivning och patentkrav.

EXEMPEL 1 l g fuktig 5'-AMP-(eller 2',5'-ADP)-Sepharose 4 B (Pharmacia) som först svällts i O,lM natriumfosfatbuffert, pH 7,5, och tvättats med vatten packades i en kolonn.

Därefter pumpades 6,5 ml'Ferrofluid"(bas, H20, magnetisk mättnad 2OOG, varumärke A05 från Ferrofluidics Corpo- ration, Burlington, Mass.) genom kolonnen och cirku- lerades i 4 h med en flödeshastighet av 50 ml h_l (vanligen vid rumstemperatur). Efter tvättning med l liter H20 på glasfilter genomfördes en inkubering över natten vid 4°C med 100 mg buljongserumalbumin i O,lM Tris-HCl buffert, pH 7,6, 5mM i EDTA och 1 mM 2-merkaptoetanol, följd av tvättning med 200 ml l M NaCl och 200 ml av samma buffert. De mörkbruna gelpärlorna var därefter magnetiska och klara för användning. 0712~6 lO 'IS 20 '25 30 8 Om ferritpartiklarna helt enkelt adsorberar gelen eller faller ut i det inre av pärlorna återstår att fast- ställa. (I detta sammanhang skall det noteras att inne- slutning av ferrofluid i polyakrylamidgittret lätt kan åstadkommas.) I vilket fall som helst kvarstår de mag- netiska egenskaperna oförändrade efter intensiv tvättning med buffert (inte ens tvättning med t ex etanol eller 40% etylenglykol avlägsnade ferritpartiklarna) och upp- repad användning i magnetfält. De magnetiska egenskaperna är tillräckligt starka för att medge snabb sedimentering * även vid anbringande av svaga permanenta magneter. i ExEMPEn 2 Framställning av mikrosfärer 10 ml vatten blandades med 6 g stärkelse och 5 g karbonyl-järn i.en bägare. Uppslamningen värmdes under mild omröring och fick koka några sekunder för full- ständig upplösning av stärkelsen. Vid 90°C hälldes upp- slamningen av stärkelse-karbonyl-järn långsamt i 100 ml omrörd toluen vid rumstemperatur innehållande den lösta emulgatorn "Gafac PE-510" i en koncentration av l %.

Omröringshastigheten justerades tills den önskade stor- leken på mikrosfärerna erhållits (t ex gav 6000 r/min pärlor med en diameter av 3-15 pm). Omedelbart därefter kyldes blandningen i ett isbad under fortsatt omröring till lO°C. De erhållna magnetiska mikrosfärerna tvätta- des upprepade gånger med aceton och därefter med vatten.

Förfarandet upprepades med undantag av att 10 g pulverformig magnetit användes i stället för karbonyl- -järn och av att efter kokning av uppslamningen behand- lades den med ljudvågor för fullständig âtersuspen- dering av aggregerade magnetitpartiklar.

K_Kovalent koppling av substanser till mikrosfärerna 35 Aktivering enligt CNBr-metoden gjordes i 7 min vid pH ll med användning av 500 mg CNBr i l5 ml vatten och med l ml magnetiska.mikrosfärer (karbonyl-järn), 10 15 20 25 30 35 7900712-6 9 storlek 2-15 pm (ej siktade). Kopplingen fortskred över natten vid rumstemperatur i totalt 2 ml 0,1 M NaHCO3 innehållande l mg etanolamin (55 pg l4C-etanol- amin).

Motsvarande kopplingar genomfördes med albumin och plasmin.

EXEMPEL 3 Humanserumalbumin (HSA, 20 mg i 3 ml 0,1 M kalium- fosfatbuffert, pH 7,0 innehållande 0,5 M NaCl) koppla- des till CNBr-aktiverad Sepharose 43; gelen (1 g torr vikt) fick återigen svälla, tvättades, omsattes med HSA och behandlades därefter med l M etanolamin (för att blockera eventuellt oreagerade grupper). HSA- -Sepharose 4B-gelen tvättades därefter med 0,1 M kaliumfosfat, pH 7,0 innehållande 0,5 M NaCl och med 0,1 M natriumacetatbuffert, pH 4,0 innehållande 0,5 M NaCl. Gelen magnetiserades därefter sålunda: 1 ml Sepharose-gel, tidigare svälld i 0,1 M natrium- fosfatbuffert, pH 7,5 och tvättad med H20, packades i en kolonn. Därefter pumpades 6,5 ml "Ferrofluid" genom kolonnen och cirkulerades i 4 h vid en flödeshastighet av 50 ml h_l (vanligen vid rumstemperatur). Efter tvätt- ning med l liter H20 på glasfilter tvättades pärlorna med 200 ml l M NaCl och 200 ml av bufferten. De mörk- bruna gelpärlorna var därefter klara att användas.

EXEMPEL 4 Bindning av antikroppar l ml magnetisk albumingel sattes till 2,5 ml 0,1 M kaliumfosfatbuffert, pH 7,0, innehållande 0,5 ml NaCl och 0,5 ml outspätt kaninserum tillsattes därefter.

Inkubering av blandningen fick äga rum i l h vid 4°C under periodisk skakning och gelen tvättades därefter 3 ggr med samma fosfatbuffert. Desorption av anti-HSA- -antikroppar åstadkoms genom att behandla den magnetiska gelen antingen med 0,1 M glycerin-HCl-buffert, pH 3,0, eller med 2 M natriumtiocyanat i 30 min vid 4°C.

IÛ712-6 10 15 20 25 30' 35 *av glukos-6-fosfatdehydrogenas från hemolysat av humana EXEMPEL G ii vilket 0,5 M glukos eller 0,5 m glukos + närings- ”ämnen matades kontinuerligt till preparationerna i 105 EXEMPEL 5 g p Magnetisk 2',5'-ADP Sepharose användes för rening röda blodkroppar. Den magnetiska affinitetsgelen inku- berades med hemolysat och gelen tvättades med 0,1 M Tris-HCl buffert, pH 7,6, innehållande 1 mM EDTA och l mM merkaptoetanol. Enzymet desorberades ur gelen efter inkubering med 0,5 mM NADP+ i samma buffert.

Genom detta satsförfarande uppnåddes en renhet som var ca ll 000 ggr vad som tidigare uppnåtts.

Framställning av magnetiska immobiliserade jästceller 100 ml 4 % (vikt/volym) natriumalginatlösning blan- dades noga med lOO ml av en suspension av 50 g jäst- celler (våt vikt; 5 000 x g) och 2 g magnetitpulver (kornstorlek <50 pm) i vatten. Blandningen (30°C) pumpades genom en injektionsnål och de bildade drop- parna fick falla ner i ett bad med 0,05 M CaCl2.

De resulterande pärlorna (ø 2 mm) fick härda i l h och lagrades därefter i 0,025 M CaCl2 vid 4°C tills de användes. 7 5 Immobiliserade jästceller kan på motsvarande sätt göras magnetiska genom behandling med en kolloidal ferritsuspension,f"Ferrofluid".

På detta sätt framställdes magnetisk immobiliserad jäst med en magnetithalt av 0,5-10 % (vikt/volym) resp med en "Ferrofluid"-halt av l-10 % (v/V).

Magnetisk och omagnetisk immobiliserad jäst jäm- fördes i ett 3-veckorsförsök för etanolframställning, små reaktorer vid 28°C. Med intervaller uttogs prepa- rationerna ur reaktorerna, deras aktivitet undersöktes och de återfördes till respektive reaktor. Någon skillnad i aktivitet mellan magnetiserad och omagne- tiserad jäst kunde inte påvisas, varken vad gäller 79ÛÛ712-6 ll etanolproduktionshastighet eller utbyte, vilket visar att magnetiseringen inte negativt påverkar den immo- biliserade jästen.

Claims (10)

1. I0g712-6 lO . míkrob. 15 20 25 30 * tiklarna är associerade med den biologiskt aktiva sub- *med uppburen PATENTKRAV l. Magnetiska polymerpartiklar med uppburen bio- logiskt, företrädesvis farmaceutiskt, aktiv substans, k ä n n e t e c k n a d e' av att de omfattar partik- lar av en porös polymer i vars porer eller nät~_ verk är avsatt magnetiskt material, varvid polymerpar- stansen. _

2. Magnetiska polymerpartiklar enligt krav l, k ä n n e t e c k n a d e av att den biologiskt aktiva substansen utgöres av en enzyminhibitor, ett enzym, såsom ett proteolytiskt enzym, ett cytostatikum, en radionukleotid, insulin, en steroid eller en levande

3. Magnetiska polymerpartiklar enligt krav l, k ä~n n e t e c k n a d e av att polymeren utgöres av en akrylpolymer- och/eller en polysackarid, såsom agaros eller stärkelse. I V

4. Magnetiska polymerpartiklar enligt något av kraven l-3, k ä n n e t e c k n a d e av att det mag- netiska materialet är partikelformigt eller kolloidalt, företrädesvis kolloidal ferrit.

5. Sätt att framställa magnetiska polymerpartiklar biologiskt, företrädesvis farmaceutiskt, aktiv substans, k ä n n e t e c k n a t av att porösa _ polymerpartiklar, som eventuellt uppbär den biologiskt i I aktiva substansen, och/eller polymeriserbara monomerer bringas i kontakt med en kolloidal lösning av ett mag- netiskt material och eventuellt biologiskt aktiv substans, de eventuellt närvarande monomererna polymeriseras, lösningsmedlet eventuellt avlägsnas, varvid det magne- tiska materialet och eventuellt närvarande biologiskt aktiv substans avsättes i polymerpartiklarnas porer eller nätverk, varefter de bildade magnetiska polymerpartik- larna associeras med den biologiskt aktiva substansen 10 15 20 7900712-6 13 om denna inte redan är associerad med polymerpartiklarna.

6. Sätt enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av att de magnetiska polymerpartiklarna associeras med, som biologiskt aktiv substans, en enzyminhibitor, ett enzym, såsom ett proteolytiskt enzym, ett cytostatikum, en nukleotid, insulin, en steroid eller en levande mikrob.

7. Sätt enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av att som polymerpartiklar användes partiklar av en akrylpolymer och/eller en polysackarid, såsom agaros eller stärkelse.

8. Sätt enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av att som polymeriserbar monomer insättes en akrylmonomer.

9. Sätt enligt något av kraven 5-8, k ä n n e t e c k- n a t av att som magnetiskt material användes kolloidal ferrit.

10. Användning vid affinitetskromatografi, immuno- adsorbans eller för kvarhâllande av en aktiv substans inom ett begränsat omrâde av magnetiska polymerpartiklar med uppburen biologiskt aktiv substans, vilka partiklar omfattar en porös polymer i vars porer eller nätverk är avsatt magnetiskt material, varvid polymerpartiklarna är associerade med den biologiskt aktiva substansen.