CN115160294B - 一种G9a/GLP共价抑制剂及其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种G9a/GLP共价抑制剂及其制备方法和应用。该G9a/GLP共价抑制剂为如式(Ⅰ)所示结构的化合物及其盐：本发明提供的G9a/GLP共价抑制剂特异性好，药效强，对组蛋白甲基转移酶G9a/GLP高选择性，可用于制备抑制G9a/GLP的药物、预防和/或治疗肿瘤或癌症的药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，特别涉及一种G9a/GLP共价抑制剂及其制备方法及应用。
背景技术
组蛋白的翻译后修饰在各种人类疾病的发生发展中起着重要作用，组蛋白甲基转移酶G9a(KMT1C或EHMT2)以及GLP(KMT1D或EHMT1)，是一类密切相关的甲基转移酶。GLP的SET结构域与G9a具有80％的序列同源性；GLP同时能够与G9a形成异源二聚体，共同发挥生理功能。G9a/GLP除了催化H3K9的单甲基化和二甲基化外，还可将肿瘤抑制基因p53的赖氨酸373残基二甲基化，导致p53转录失活并增加癌细胞增殖，G9a/GLP已被证明参与机体的许多种生理和病理进程，在包括白血病，前列腺癌，肝细胞癌和肺癌在内的各种人类癌症中过度表达。因此，近年来，G9a/GLP已经成为多个疾病研究的热门靶点。
目前开发的G9a/GLP抑制剂普遍存在药效低的缺陷、目前尚无进入临床研究阶段的候选化合物，所以急需要开发具有新的作用模式的抑制剂来解决这一问题。截止目前，所有已被报道的G9a/GLP抑制剂均为非共价可逆抑制剂(Cao H,Li L,Yang D,et al.Recentprogress in histone methyltransferase(G9a)inhibitors as anticancer agents.EurJ Med Chem.2019；179:537-546.)，尚无共价抑制剂被发明报道。共价抑制剂在与靶标蛋白结合的同时，能够与其结合位点附近靶标蛋白上的亲电性氨基酸残基生成共价键，所以相比于非共价抑制剂，共价抑制剂具有作用时间长、药效强、给药剂量低等一系列的优点。而在G9a/GLP的催化口袋内就存在具有亲电性质的半胱氨酸残基(G9a-Cys1098、GLP-1186)，满足开发共价抑制剂的条件。
基于此，设计开发一种具有药效强、成药性特点的G9a/GLP共价抑制剂有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服G9a/GLP共价抑制剂的缺乏，提供一种G9a/GLP共价抑制剂。本发明提供的G9a/GLP共价抑制剂特异性好，药效强，对组蛋白甲基转移酶G9a/GLP高选择性，可用于制备抑制G9a/GLP的药物、预防和/或治疗肿瘤或癌症的药物。
本发明的另一目的在于提供上述G9a/GLP共价抑制剂的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述G9a/GLP共价抑制剂在制备抑制G9a/GLP的药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种G9a/GLP共价抑制剂，为如式(Ⅰ)所示结构的化合物及其盐：
其中，n1、n2、n3、n4独立地选自0～2的整数；
n5为0～4的整数；
X为CH或N；
R1选自氢、C1-C6烷基及其氘代物、C3-C6环烷基、C3-C6杂环烷基；所述烷基及其氘代物、环烷基任选地被卤素、氰基、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基、C1-C6烷基、氨基、C1-C6烷基氨基、双C1-C6烷基氨基、4-12元杂环基的一种或多种基团取代；
R2为
R3选自氢、三氟甲基、取代或非取代的C1-C6烷基、取代或非取代的C3-C8的环烷基、取代或非取代的C3-C8的杂环烷基、取代或非取代的芳基、取代或非取代的C5-C6杂芳基；所述取代是指至少1个位点被以下取代基取代：卤素、氰基、氨基、硝基、羟基、三氟甲基、甲硫基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8的环烷基、C1-C6烷基氨基、C3-C8杂环基；C3-C8的环烷氧基、C3-C8的环烷胺基、芳基、C5-C6杂芳基；
R4选自氢、卤素、氰基、羟基、甲氧基或三氟甲氧基；
R5选自取代或非取代的C1-C6烷基、取代或非取代的C3-C8的环烷基、取代或非取代的C3-C8的杂环烷基、取代或非取代的芳基、取代或非取代的C5-C6杂芳基、取代或非取代的C1-C6烷氧基、取代或非取代的C1-C6烷氨基、取代或非取代的C3-C8环烷基氧基、取代或非取代的C3-C8环烷基氨基、取代或非取代的C3-C8环胺基，所述取代是指至少1个位点被以下取代基取代：卤素、氰基、氨基、硝基、羟基、三氟甲基、甲硫基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8的环烷基、C1-C6烷基氨基、C3-C8杂环基；C3-C8的环烷氧基、C3-C8的环烷胺基、芳基、C5-C6杂芳基；Ra选自氢、卤素或Rd；
Rb、Rc独立地选自氢或Rd；
Rd选自取代或非取代的C1-C6烷基、取代或非取代的C2-C6烯基、取代或非取代的C2-C6炔基、取代或非取代的C3-C6环烷基、取代或非取代的4-12元杂环基；
或者Ra、Rb与它们相连的碳原子一起形成含0或1个额外杂原子的3-5元杂环基或取代3-5元杂环基；
Y选自卤素。
本发明以喹唑啉及喹啉作为成药骨架，喹唑啉及喹啉具有良好的成药性，并且该骨架类抑制剂在与G9a的发生作用的结合口袋附近，存在一个半胱氨酸残基，与喹唑啉C-2位距离较近，方向和距离适合添加亲电活性基团即共价弹头，其可以与结合口袋附近的半胱氨酸残基发生亲电加成反应生成共价键，从而达到持久的抑制作用，并进行特定取代后得到的G9a/GLP共价抑制剂特异性好，药效强，对组蛋白甲基转移酶G9a/GLP高选择性，可用于制备抑制G9a/GLP的药物、预防和/或治疗肿瘤或癌症的药物。
优选地，n1为0或1。
优选地，n2为0或1。
优选地，n3为1。
优选地，n4为0～3的整数。
优选地，R1选自氢或C1-C6烷基。
优选地，R2选自
其中：
Rd中的取代基为一个或多个-J-T基团；Ra、Rb中的取代的3-5元杂环基中的取代基为一个或多个-J1-T1基团；
J选自一个键或取代的C1-C6亚烷基；
T选自氢、卤素、氰基、羟基、-NRfRg、-C(O)Rf、-ORf、-C(O)O-Rf、-C(O)NRfRg、-NRfC(O)Rg、-NRhC(O)NRfRg、-NRfC(O)ORh或Ri；
Rf、Rg、Rh分别独立地选自氢或Rj，Rj选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、4-12元杂环基、5元或6元杂芳基、芳基，Rj被一个或多个-J1-T1基团取代；
或者Rf、Rg与它们相连的N原子一起形成含0或1个额外杂原子的4-12元杂环基，所述4-12元杂环基被一个或多个-J1-T1基团取代；
Ri选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、4-12元杂环基、5-10元杂芳基、芳基，Ri被一个或多个-J1-T1基团取代；
J1选自一个键或取代的C1-C6亚烷基；
T1选自氢、卤素、氰基、羟基、-NRkRl、-C(O)Rk、-ORk、-C(O)O-Rk、-C(O)NRkRl、-NRkC(O)Rl、-NRoC(O)NRkRl、-NRkC(O)ORo或Rp；
Rk、Rl、Ro各自独立的选自氢或Rq，Rq选自取代的如下基团：C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、4-12元杂环基、5元或6元杂芳基、芳基；
或者Rk、Rl与它们相连的N原子一起形成含0或1个额外杂原子的4-12元杂环基，所述杂环基任选被选自卤素、羟基、氧代、C1-C6烷基、ORx、-NRxRy、-C(O)Rx、-O(CH2)nORx的一种或多种基团取代；
Rp选自C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、4-12元杂环基、5至6元杂芳基、芳基；
Rx、Ry各自独立地选自氢或Rz，Rz选自如下基团或取代的如下基团：C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、4-12元杂环基、芳基、5元或6元杂芳基；Rz被卤素、羟基、5元或6元芳杂基、芳基或取代的5元或6元杂芳基中的一种或多种基团取代，
或者Rx、Ry与它们相连的N原子一起形成含0或1个额外杂原子的4-12元杂环基；
或者-J1-T1是氧代基；
或者-J-T是氧代基；
优选地，R3选自氢、芳基、C1-C6烷基、C3-C8的杂环烷基或被C3-C8的杂环烷基取代的C1-C6烷基。
优选地，R5选自C1-C6烷基或C3-C8的杂环烷基。
优选地，所述G9a/GLP共价抑制剂为如下编号所示结构及其盐：
本发明中的盐为药学上可接受的盐。
优选地，所述盐为盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、甲基硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氨基硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、羟基乙酸盐、苯基乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、异丁酸盐、戊酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、丙烯酸盐、延胡索酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、水杨酸盐、对氨基水杨酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、庚酸盐、邻苯二甲酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、邻乙酰氧基苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟苯酸盐、甲氧基苯甲酸盐、扁桃酸盐、丹宁酸盐、甲酸盐、硬脂酸盐、抗坏血酸盐、棕榈酸盐、油酸盐、丙酮酸盐、双羟奈酸盐、丙二酸盐、月桂酸盐、戊二酸盐、谷氨酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐(estolate)、甲磺酸盐、乙磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、苯磺酸盐、对氨基苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐(甲苯磺酸盐)或萘-2-磺酸盐。
上述G9a/GLP共价抑制剂的制备方法的制备方法，包括如下步骤：
式(1)所示的化合物与酸在缩合剂、有机碱的条件下发生缩合反应，即得式(Ⅰ)所示结构的化合物。
优选地，式(1)所示化合物与酸、缩合剂和有机碱的摩尔比为1:(1.2～1.5):(1.2～1.4):(2～3)。
优选地，所述酸为丙酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、2-丁烯酸、2-丁炔酸、氯乙酸、氰乙酸、1-氰基-1-环丙烷羧酸或(E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酸中的一种或几种。
优选的，所述缩合剂为酰氯。
优选地，所述有机碱为DIPEA。
优选地，所述溶剂为超干二氯甲烷。
优选地，所述缩合反应的反应温度为0℃到室温(例如0℃～26℃)，反应时间为1～2小时。
优选地，式(1)所示化合物通过如下过程制备得到：式(2)所示的化合物与式(3)所示的化合物在碱性物质和溶剂存在条件下发生取代反应生成式(4)所示的中间体，然后式(4)所示的中间体与甲胺加热条件下发生取代反应，即得式(1)所示化合物；
优选地，所述式(2)所示化合物与式(3)所示化合物、碱性物质的摩尔比为1:(1.5～2):(2.5～3)。
优选地，所述碱性物质为K2CO3。
优选地，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
优选地，式(2)所示的化合物与式(3)所示的化合物发生取代反应的反应温度为0℃到室温(例如0℃～26℃)，反应时间为3～4小时。
优选地，式(4)所示的中间体与甲胺发生取代反应的条件为：甲胺溶液为溶剂，反应温度120℃，反应时间为8小时。
上述G9a/GLP共价抑制剂在制备抑制G9a/GLP的药物中的应用也在本发明的保护范围内。
研究表明，G9a/GLP共价抑制剂可抑制G9a/GLP的表达，可预防和/或治疗与G9a/GLP相关的细胞异常增殖、形态变化以及运动功能亢进，及可治疗和/或预防肿瘤生长与转移。
优选地，所述药物为预防和/或治疗与G9a/GLP相关的细胞异常增殖、形态变化以及运动功能亢进的疾病的药物。
优选地，所述药物为治疗和/或预防肿瘤生长与转移的药物。
更为优选地，所述肿瘤为癌症或良性肿瘤中的一种或几种。癌症可为胰腺癌、乳腺癌、肺癌、骨癌、胃癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、脑癌、垂体腺瘤、表皮样癌、T细胞淋巴瘤、慢性和急性白血病、大肠癌、肾癌、食道癌、乳房癌、宫颈癌、膀胱癌、纤维肉瘤、食道癌、膀胱癌、造血系统癌、淋巴瘤、髓母细胞瘤、成神经管细胞瘤、直肠腺癌、结肠癌、肝癌、腺样囊性癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、脑癌、肝细胞癌、黑色素瘤、少突神经胶质瘤、胶质母细胞癌、卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性囊腺癌、甲状腺癌、多发性骨髓瘤(AML)、套细胞淋巴瘤、三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌。
相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：
本发明提供的G9a/GLP共价抑制剂特异性好，药效强，对组蛋白甲基转移酶G9a/GLP高选择性，可用于制备抑制G9a/GLP的药物、预防和/或治疗肿瘤或癌症的药物。
附图说明
图1为G9a与化合物14质谱共价结合验证。
图2(A)为化合物14与G9a蛋白预测结合模式，图2(B)为化合物14与GLP蛋白预测结合模式；
图3为化合物14、26的甲基化抑制洗脱实验；
图4为化合物14、26抑制MDA-MB-231和PANC1的克隆形成；
图5为化合物14、26的甲基化抑制实验。
图6为化合物14的体内抗肿瘤活性实验。
具体实施方式
以下结合实施例和附图进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1 N-(6-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹唑啉-2-基)甲基)丙烯酰胺
将原料1a(100mg，0.23mmol)加入到反应瓶中，加入超干二氯己烷10ml，在0℃加入HATU(114.07mg，0.30mmol)和丙烯酸(19.20ul，0.28mmol)，DIPEA(120.19ul，0.69mmol)，之后室温下搅拌，TLC检测反应进程，2h反应结束，乙酸乙酯萃取，合并有机相，使用无水硫酸钠干燥，之后过滤并旋干溶剂，粗品柱层析分离纯化，得到目标化合物1，为白色固体。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.23(s,1H),7.16(s,1H),6.91(s,1H),6.35–6.31(m,1H),5.69(dd,J＝9.2,2.5Hz,1H),5.47(d,J＝7.4Hz,1H),4.59(d,J＝4.3Hz,2H),4.22(t,J＝6.7Hz,3H),3.98(s,3H),2.93(d,J＝11.5Hz,2H),2.71(d,J＝7.4Hz,2H),2.59(d,J＝5.9Hz,4H),2.35(s,3H),2.24–2.12(m,6H),1.84–1.80(m,4H),1.69(dd,J＝11.9,3.6Hz,2H).HRMS(ESI)calcd for C26H38N6O3(M+H+):483.3078；found 483.3078.
实施例2 N-(6-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹唑啉-2-基)甲基)甲基丙烯酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的甲基丙烯酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例1，得白色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.49(s,1H),7.15(s,1H),6.89(s,1H),5.90(s,1H),5.40(s,2H),4.58(d,J＝4.2Hz,2H),4.22(t,J＝6.8Hz,3H),3.97(s,3H),2.90(d,J＝11.2Hz,2H),2.66(t,J＝7.3Hz,2H),2.55(d,J＝5.8Hz,4H),2.33(s,3H),2.22–2.14(m,6H),2.09(s,3H),1.84–1.76(m,4H),1.71–1.61(m,2H).HRMS(ESI)calcd for C27H40N6O3(M+H+):497.3235；found 497.3235.
实施例3 6-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-氨基)-7-(3-吡咯烷-1-基)丙氧基喹唑啉-2-基)甲基丁-2-烯酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的2-丁烯酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例1，得白色固体。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.17(s,1H),7.06(d,J＝4.4Hz,1H),6.89(q,J＝7.6,7.0Hz,2H),6.01(dd,J＝15.2,2.0Hz,1H),5.42(d,J＝7.3Hz,1H),4.58(d,J＝4.3Hz,2H),4.23(t,J＝6.8Hz,3H),3.97(s,3H),2.90(d,J＝11.5Hz,2H),2.66(t,J＝7.3Hz,2H),2.54(d,J＝5.9Hz,4H),2.33(s,3H),2.16(dd,J＝14.6,7.0Hz,6H),1.89(dd,J＝6.8,1.6Hz,3H),1.83–1.77(m,4H),1.65(dt,J＝11.3,5.6Hz,2H).HRMS(ESI)calcd forC27H40N6O3(M+H+):497.3235；found 497.3234.
实施例4 N-(6-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹唑啉-2-基)甲基)丁-2-炔酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的2-丁炔酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例1，得白色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.34(t,J＝4.6Hz,1H),7.20(s,1H),6.89(s,1H),5.40(d,J＝7.4Hz,1H),4.55(d,J＝4.5Hz,2H),4.24(t,J＝6.7Hz,3H),4.00(s,3H),2.92(d,J＝11.3Hz,2H),2.67(t,J＝7.3Hz,2H),2.56(q,J＝3.2Hz,4H),2.34(s,3H),2.22–2.14(m,6H),2.00(s,3H),1.83–1.79(m,4H),1.67(dd,J＝11.8,3.8Hz,2H).HRMS(ESI)calcd for C27H38N6O3(M+H+):495.3078；found 495.3078.
实施例5 4-(二甲基氨基)-N-(6-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)-7-(3-(吡咯石-1-基)丙氧基)喹唑啉-2-基)甲基)丁-2-烯酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的4-二甲基氨基丁烯酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例1，得白色固体。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.20(t,J＝4.3Hz,1H),7.17(s,1H),6.93–6.81(m,2H),6.16(d,J＝15.5Hz,1H),5.37(d,J＝7.5Hz,1H),4.58(d,J＝4.3Hz,2H),4.22(q,J＝6.7Hz,3H),3.99(s,3H),3.10(d,J＝6.1Hz,2H),2.90(d,J＝11.5Hz,2H),2.67(t,J＝7.3Hz,2H),2.55(d,J＝5.9Hz,4H),2.33(s,3H),2.28(s,6H),2.19–2.13(m,6H),1.82–1.78(m,4H),1.69–1.61(m,2H).HRMS(ESI)calcd for C29H45N7O3(M+H+):540.3657；found540.3657.
实施例6 2-氯-N-(6-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)-7-(3-吡咯烷-1-基)丙氧基喹唑啉-2-基甲基)乙酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的氯乙酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例1，得白色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.23(s,1H),7.16(s,1H),6.84(s,1H),5.29(d,J＝7.5Hz,1H),4.56(d,J＝4.2Hz,2H),4.27(dd,J＝7.5,3.9Hz,1H),4.23(t,J＝6.7Hz,2H),4.18(s,2H),4.00(s,3H),2.92(d,J＝11.3Hz,2H),2.69–2.64(m,2H),2.59–2.52(m,4H),2.34(s,3H),2.23–2.12(m,6H),1.83–1.77(m,4H),1.71–1.62(m,2H).HRMS(ESI)calcdfor C25H37N6O3Cl(M+H+):505.2688；found 505.2688.
实施例7 2-氰基-N-(6-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)-7-(3-吡咯烷-1-基)丙氧基喹唑啉-2-基)甲基)乙酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的氰乙酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例1，得白色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.86(s,1H),7.18(s,1H),6.87(s,1H),5.37(d,J＝7.7Hz,1H),4.55(d,J＝3.7Hz,2H),4.32(s,1H),4.24(t,J＝6.6Hz,2H),4.01(s,3H),3.51(s,2H),2.91(d,J＝11.6Hz,2H),2.68(t,J＝7.3Hz,2H),2.58(d,J＝5.9Hz,4H),2.35(s,3H),2.20(d,J＝19.4Hz,6H),1.97–1.77(m,4H),1.70(d,J＝12.4Hz,2H).HRMS(ESI)calcd for C26H37N7O3(M+H+):496.3031；found 496.3032.
实施例8 1-氰基-N-(6-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)-7-(3-(吡咯石-1-基)丙氧基)喹唑啉-2-基)甲基)环丙烷-1-甲酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的1-氰基-1-环丙烷羧酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例1，得白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.32(t,J＝5.3Hz,1H),7.63(s,1H),7.61(s,1H),7.01(s,1H),4.29(d,J＝5.3Hz,2H),4.23–4.17(m,1H),4.13(t,J＝6.4Hz,2H),3.90(s,3H),2.84(d,J＝10.8Hz,2H),2.57(t,J＝7.2Hz,2H),2.46(d,J＝5.8Hz,4H),2.20(s,3H),2.09–2.02(m,2H),1.98–1.91(m,4H),1.72–1.64(m,6H),1.62(d,J＝3.6Hz,2H),1.55(t,J＝3.6Hz,2H).HRMS(ESI)calcd for C28H39N7O3(M+H+):522.3187；found522.3186.
实施例9 N-((6-甲氧基-4-((1-甲基哌啶-4-基)氨基)-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹啉-2-基)甲基)丙烯酰胺
将原料9a(100mg，0.23mmol)加入到反应瓶中，加入超干二氯己烷10ml，在0℃加入HATU(114.07mg，0.30mmol)和丙烯酸(19.20ul，0.28mmol)，DIPEA(120.19ul，0.69mmol)，之后室温下搅拌，TLC检测反应进程，2h反应结束，乙酸乙酯萃取，合并有机相，使用无水硫酸钠干燥，之后过滤并旋干溶剂，粗品柱层析分离纯化，得到目标化合物9，白色固体。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.43(t,J＝4.7Hz,1H),7.31(s,1H),6.92(s,1H),6.37–6.29(m,3H),5.66(dd,J＝9.5,2.2Hz,1H),4.80(d,J＝7.2Hz,1H),4.62(d,J＝4.6Hz,2H),4.23(d,J＝6.9Hz,2H),3.97(s,3H),3.52–3.46(m,1H),2.88(d,J＝11.4Hz,2H),2.66(d,J＝7.3Hz,2H),2.54(d,J＝5.8Hz,4H),2.33(s,3H),2.17(d,J＝14.2Hz,6H),1.79(q,J＝3.8,3.3Hz,4H),1.70–1.63(m,2H).HRMS(ESI)calcd for C27H39N5O3(M+H+):482.3126；found 482.3125.
实施例10 2-氯-N-((6-甲氧基-4-((1-甲基哌啶-4-基)氨基)-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹啉-2-基)甲基)乙酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的氯乙酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例9，得淡黄色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.12(s,1H),7.33(s,1H),6.85(s,1H),6.33(s,1H),4.58(dd,J＝10.9,5.9Hz,3H),4.27(t,J＝6.7Hz,2H),4.16(s,2H),4.02(s,3H),3.52(s,1H),2.91(d,J＝11.5Hz,2H),2.71(d,J＝7.4Hz,2H),2.57(d,J＝5.9Hz,4H),2.36(s,3H),2.25–2.16(m,6H),1.86–1.65(m,6H).HRMS(ESI)calcd for C26H38N5O3Cl(M+H+):504.2736；found 504.2736.
实施例11(E)-N-(6-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹啉-2-基)甲基)丁-2-烯酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的2-丁烯酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例9，得淡黄色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.33(s,1H),7.18(t,J＝4.8Hz,1H),6.89(q,J＝7.6,7.0Hz,2H),6.33(s,1H),6.00(dd,J＝15.2,1.9Hz,1H),4.74(d,J＝7.3Hz,1H),4.61(d,J＝4.7Hz,2H),4.24(t,J＝6.8Hz,2H),3.99(s,3H),3.54–3.41(m,1H),2.96–2.85(m,2H),2.67(t,J＝7.4Hz,2H),2.58–2.50(m,4H),2.34(s,3H),2.22–2.11(m,6H),1.88(dd,J＝6.8,1.7Hz,3H),1.81(p,J＝3.0Hz,4H),1.66(q,J＝10.1Hz,2H).HRMS(ESI)calcd forC28H41N5O3(M+H+):496.3282；found 496.3282.
实施例12 N-(6-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹啉-2-基)甲基)甲基丙烯酰胺
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将丙烯酸换成等摩尔量的甲基丙烯酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例9，得白色固体。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.52(s,1H),6.90(s,1H),6.33(s,1H),5.86(s,1H),5.38(s,1H),4.73(d,J＝7.7Hz,1H),4.60(d,J＝4.6Hz,2H),4.23(t,J＝6.8Hz,2H),3.98(s,3H),3.56–3.47(m,1H),2.89(d,J＝11.5Hz,2H),2.66(t,J＝7.3Hz,2H),2.54(d,J＝5.1Hz,4H),2.33(s,3H),2.22–2.14(m,6H),2.06(s,3H),1.79(q,J＝4.1,3.6Hz,4H),1.69–1.63(m,2H).HRMS(ESI)calcd for C28H41N5O3(M+H+):496.3282；found 496.3282.
实施例13 N-(6-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹啉-2-基)甲基)丁-2-炔酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的2-丁炔酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例9，得白色固体。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.41(t,J＝4.9Hz,1H),7.33(s,1H),6.85(s,1H),6.29(s,1H),4.59(dd,J＝26.7,6.0Hz,3H),4.24(t,J＝6.7Hz,2H),4.00(s,3H),3.50(d,J＝11.1Hz,1H),2.89(d,J＝11.5Hz,2H),2.68(t,J＝7.4Hz,2H),2.57(d,J＝6.3Hz,4H),2.34(s,3H),2.23–2.13(m,6H),1.98(s,3H),1.81(t,J＝3.8Hz,4H),1.70–1.62(m,2H).HRMS(ESI)calcd for C28H39N5O3(M+H+):494.3126；found 494.3125.
实施例14 N-(6-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹唑啉-2-基)-N-甲基丙烯酰胺
步骤1：将化合物14a(300mg，0.84mmol)加入到反应瓶中，加入DMF溶剂使其溶解，加入1-甲基哌啶-4-氨基(158.11ul，1.26mmol)在0℃下缓慢加入K2CO3(348.29mg，2.52mmol)，之后室温搅拌，TLC检测反应进程，3h反应结束，乙酸乙酯萃取，有机层用盐水洗涤，合并有机相，使用无水硫酸钠干燥，之后过滤并旋干溶剂，粗品柱层析分离纯化，得到化合物14b。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.00(d,J＝7.6Hz,1H),7.66(s,1H),7.03(s,1H),4.13(t,J＝6.4Hz,2H),4.07–4.01(m,1H),3.90(s,3H),2.86–2.80(m,2H),2.54(d,J＝7.2Hz,2H),2.43(td,J＝4.8,4.2,2.0Hz,4H),2.19(s,3H),2.00–1.87(m,6H),1.68(td,J＝6.8,3.5Hz,6H).
步骤2：将上一步的产物(200mg，0.46mmol)加入到封管中，加入甲胺溶液(3ml)，120℃加热过夜，反应结束后，旋干溶剂，乙酸乙酯萃取，有机层用盐水洗涤，合并有机相，使用无水硫酸钠干燥，之后过滤并旋干溶剂，无需纯化，直接进行下一步反应，将粗品加入到反应瓶中，加入超干DMF 10ml，温度降低到0℃，快速加入丙烯酰氯(119.90ul，1.38mmol)和三乙胺(191.82ul，1.38mmol)，之后室温下搅拌，TLC检测反应进程，2h反应结束，乙酸乙酯萃取，合并有机相，使用无水硫酸钠干燥，之后过滤并旋干溶剂，粗品柱层析分离纯化，得到目标化合物14，为淡黄色固体。1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.61(s,1H),7.05(s,1H),4.23(q,J＝4.3,3.7Hz,1H),4.18(t,J＝6.0Hz,2H),3.97(s,3H),3.36(s,3H),3.00–2.93(m,2H),2.78–2.73(m,2H),2.68–2.62(m,4H),2.54(q,J＝7.5Hz,2H),2.33(s,3H),2.24–2.17(m,2H),2.15–2.04(m,4H),1.84(d,J＝3.5Hz,4H),1.78(dd,J＝12.1,3.4Hz,2H),1.11(t,J＝7.5Hz,3H).HRMS(ESI)calcd for C26H38N6O3(M+H+):483.3078；found 483.3077.
实施例15 N-(6-甲氧基-4-(1-丙基哌啶-4-基)氨基)-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹唑啉-2-基)-N-甲基丙烯酰胺
将4-氨基-1-甲基哌啶换成等摩尔量的4-氨基-1-丙基哌啶，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例14，得白色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.12(s,1H),6.91(s,1H),6.76(dd,J＝16.8,10.3Hz,1H),6.36(dd,J＝16.9,2.0Hz,1H),5.59–5.47(m,2H),4.23(t,J＝6.7Hz,2H),4.18(dd,J＝7.4,3.8Hz,1H),4.00(s,3H),3.56(s,3H),3.02(d,J＝11.8Hz,2H),2.70(t,J＝7.4Hz,2H),2.62–2.54(m,4H),2.40–2.35(m,2H),2.15(q,J＝6.9,6.4Hz,6H),1.82(t,J＝3.6Hz,4H),1.71(dd,J＝12.0,3.5Hz,2H),1.58–1.52(m,2H),0.93(t,J＝7.4Hz,3H).HRMS(ESI)calcd for C28H42N6O3(M+H+):511.3391；found 511.3391.
实施例16 N-(4-(1-异丙基哌啶-4-基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹唑啉-2-基)-N-甲基丙烯酰胺
将4-氨基-1-甲基哌啶换成等摩尔量的4-氨基-1-异丙基哌啶，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例14，得白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79(d,J＝7.6Hz,1H),7.63(s,1H),6.99(s,1H),6.75(dd,J＝16.8,10.2Hz,1H),6.11(dd,J＝16.9,2.3Hz,1H),5.53(dd,J＝10.2,2.3Hz,1H),4.13(t,J＝6.5Hz,2H),4.05–3.99(m,1H),3.89(s,3H),3.37(s,3H),2.85(d,J＝11.0Hz,2H),2.72(p,J＝6.6Hz,2H),2.55(d,J＝7.1Hz,1H),2.44(d,J＝5.5Hz,4H),2.19–2.13(m,2H),1.96–1.89(m,4H),1.69(t,J＝3.6Hz,4H),1.62–1.55(m,2H),0.98(d,J＝6.5Hz,6H).HRMS(ESI)calcd for C28H42N6O3(M+H+):511.3391；found511.3391.
实施例17 N-(4-(1-环己基哌啶-4-基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹唑啉-2-基)-N-甲基丙烯酰胺
将4-氨基-1-甲基哌啶换成等摩尔量的4-氨基-1-环己基哌啶，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例14，得白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.85(d,J＝7.6Hz,1H),7.66(s,1H),6.99(s,1H),6.75(dd,J＝16.9,10.2Hz,1H),6.11(d,J＝16.8Hz,1H),5.53(d,J＝10.5Hz,1H),4.14(t,J＝6.4Hz,2H),4.03(s,1H),3.89(s,3H),3.44(s,3H),3.36(s,2H),3.17(s,1H),2.91(d,J＝11.4Hz,2H),2.68–2.55(m,4H),2.25(d,J＝44.4Hz,4H),1.94(t,J＝13.9Hz,4H),1.82–1.67(m,8H),1.58(d,J＝13.6Hz,2H),1.27–1.18(m,4H).HRMS(ESI)calcd for C31H46N6O3(M+H+):551.3704；found 551.3703.
实施例18 N-(4-(1-苄基哌啶-4-基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹唑啉-2-基)-N-甲基丙烯酰胺
将4-氨基-1-甲基哌啶换成等摩尔量的4-氨基-1-苄基哌啶，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例14，得淡黄色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.35(d,J＝4.3Hz,5H),7.13(s,1H),6.85(s,1H),6.76(dd,J＝16.8,10.3Hz,1H),6.36(dd,J＝16.9,2.0Hz,1H),5.54(dd,J＝10.3,2.0Hz,1H),5.37(d,J＝7.6Hz,1H),4.23(t,J＝6.7Hz,2H),4.17(d,J＝4.2Hz,1H),4.00(s,3H),3.57(s,2H),3.56(s,3H),2.95(d,J＝11.6Hz,2H),2.71(t,J＝7.4Hz,2H),2.61(p,J＝3.8Hz,4H),2.16(ddd,J＝19.8,16.1,11.1Hz,6H),1.88–1.78(m,4H),1.67(dd,J＝11.9,3.7Hz,2H).HRMS(ESI)calcd for C26H38N6O3(M+H+):559.3391；found 559.3391.
实施例19 N-(6-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)甲基氨基)-7-(3-(吡咯烷-1-基)丙氧基)喹唑啉-2-基)-N-甲基丙烯酰胺
将4-氨基-1-甲基哌啶换成等摩尔量的(1-甲基-4-哌啶-)甲胺，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例14，得淡黄色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.11(s,1H),7.00(s,1H),6.77(dd,J＝16.9,10.3Hz,1H),6.37(d,J＝2.0Hz,1H),6.04(t,J＝6.0Hz,1H),5.55(dd,J＝10.3,2.0Hz,1H),4.21(t,J＝6.7Hz,2H),3.97(s,3H),3.53(d,J＝9.9Hz,5H),2.87(d,J＝11.1Hz,2H),2.64(d,J＝7.4Hz,2H),2.56–2.51(m,4H),2.27(s,3H),2.13(t,J＝7.1Hz,2H),1.95–1.89(m,2H),1.79(t,J＝3.7Hz,4H),1.76–1.75(m,1H),1.39(dt,J＝18.3,11.1Hz,4H).HRMS(ESI)calcd for C27H40N6O3(M+H+):497.3235；found 497.3235.
实施例20 N-(6，7-二甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)喹唑啉-2-基甲基)丙烯酰胺
将化合物20a(100mg，0.30mmol)加入到反应瓶中，加入超干二氯己烷10ml，在0℃加入HATU(88.31mg，0.23mmol)和丙烯酸(24.68ul，0.36mmol)，DIPEA(157.88ul，0.91mmol)，之后室温下搅拌，TLC检测反应进程，2h反应结束，乙酸乙酯萃取，合并有机相，使用无水硫酸钠干燥，之后过滤并旋干溶剂，粗品柱层析分离纯化，得到目标化合物20。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.38(s,1H),7.57(d,J＝29.8Hz,2H),7.04(s,1H),6.40(t,J＝9.0Hz,1H),6.12(d,J＝17.0Hz,1H),5.62(d,J＝10.2Hz,1H),4.42–4.25(m,2H),4.12(s,1H),3.97–3.81(m,6H),2.82(d,J＝11.2Hz,3H),2.19(s,3H),2.04–1.88(m,4H),1.61(d,J＝12.6Hz,2H).HRMS(ESI)calcd for C20H27N5O3(M+H+):386.2187；found 386.2187.
实施例21 2-氯-N-(6，7-二甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)喹唑啉-2-基)甲基)乙酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的氯乙酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例20，1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.22(s,1H),7.16(s,1H),6.89(s,1H),5.42(d,J＝7.6Hz,1H),4.58(d,J＝4.3Hz,2H),4.29(dtd,J＝11.3,7.2,3.8Hz,1H),4.19(s,2H),4.02(d,J＝1.3Hz,6H),2.92(d,J＝11.4Hz,2H),2.34(s,3H),2.18(d,J＝11.1Hz,4H),1.74–1.63(m,2H).HRMS(ESI)calcd for C19H26N5O3Cl(M+H+):408.1797；found 408.1797.
实施例22 N-(6，7-二甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)喹唑啉-2-基甲基)甲基丙烯酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的甲基丙烯酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例20，得白色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.12(s,1H),6.97(s,1H),5.91(s,1H),5.41(s,1H),4.58(s,2H),4.23(t,J＝10.7Hz,1H),3.99(d,J＝5.5Hz,6H),2.92(d,J＝11.2Hz,2H),2.33(s,3H),2.17(t,J＝12.3Hz,4H),2.09–1.93(m,3H),1.70(q,J＝12.8Hz,2H).HRMS(ESI)calcd for C21H29N5O3(M+H+):400.2343；found 400.2342.
实施例23 N-((6，7-二甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基)氨基)喹唑啉-2-基)甲基)丁-2-炔酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的2-丁烯酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例20，得白色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.15(s,1H),7.01(d,J＝4.7Hz,1H),6.91(s,1H),6.00(dd,J＝15.1,1.8Hz,1H),5.47(d,J＝7.3Hz,1H),4.59(d,J＝4.4Hz,2H),4.20(tt,J＝7.1,3.6Hz,1H),4.00(d,J＝5.0Hz,6H),2.91(d,J＝12.2Hz,2H),2.34(s,3H),2.19(ddd,J＝17.8,12.9,5.6Hz,4H),1.89(dd,J＝6.8,1.7Hz,3H),1.71–1.59(m,2H).HRMS(ESI)calcd for C21H27N5O3(M+H+):398.2187；found 398.2187.
实施例24 6，7-二甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基氨基)喹唑啉-2-基甲基)-4-二甲氨基丁-2-烯酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的4-二甲基氨基丁烯酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例20，得白色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.30(s,1H),7.11(d,J＝1.5Hz,1H),4.51(d,J＝1.5Hz,2H),4.28(dd,J＝10.6,5.7Hz,1H),4.01(d,J＝3.9Hz,6H),2.97(d,J＝11.6Hz,2H),2.37(d,J＝3.1Hz,3H),2.26–2.19(m,2H),2.13–2.03(m,3H),1.66(dd,J＝12.2,3.8Hz,2H).HRMS(ESI)calcd for C23H34N6O3(M+H+):443.2765；found443.2765.
实施例25 6,7-二甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基氨基)喹唑啉-2-甲基丁-2-烯酰胺
将丙烯酸换成等摩尔量的2-丁烯酸，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例20，得白色固体。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.16(s,1H),6.92(s,1H),6.16(dt,J＝15.4,1.6Hz,1H),5.49(d,J＝7.4Hz,1H),4.60(d,J＝4.4Hz,2H),4.27–4.15(m,1H),4.02(d,J＝3.4Hz,6H),3.11(dd,J＝6.1,1.6Hz,2H),2.92(d,J＝12.2Hz,2H),2.35(s,3H),2.29(s,6H),2.18(s,2H),1.67(tt,J＝12.0,6.2Hz,2H),1.27(t,J＝5.9Hz,2H).HRMS(ESI)calcd for C21H29N5O3(M+H+):400.2343；found 400.2342.
共价验证实验以及生物活性评价部分
实施例1～25制备得到的最终目标产物分别记为化合物1～15。
为便于更加直观的进行共价验证，我们设计并合成了化合物14的非共价对照化合物26，两者具有相似的物理化学性质，但是化合物26不具备进行共价结合的能力。
化合物26通过如下过程制备得到：将丙烯酰氯换成等摩尔量丙酰氯，其余所需原料、试剂以及制备方法同实施例14，得白色固体。1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.61(s,1H),7.05(s,1H),4.23(q,J＝4.3,3.7Hz,1H),4.18(t,J＝6.0Hz,2H),3.97(s,3H),3.36(s,3H),3.00–2.93(m,2H),2.78–2.73(m,2H),2.68–2.62(m,4H),2.54(q,J＝7.5Hz,2H),2.33(s,3H),2.24–2.17(m,2H),2.15–2.04(m,4H),1.84(d,J＝3.5Hz,4H),1.78(dd,J＝12.1,3.4Hz,2H),1.11(t,J＝7.5Hz,3H).HRMS(ESI)calcd for C26H40N6O3(M+H+):485.3235；found 485.3280.
1.共价验证:质谱
实验方法如下：G9a蛋白与化合物14进行孵育，之后采用电喷雾飞行时间质谱进行验证，已知的氨基酸序列和G9a蛋白的质谱，G9a的分子量为59.62KD,在对化合物和蛋白G9a进行孵育以后，质谱数据显示，与G9a蛋白空白质谱数据相比，小分子处理的图谱在59.62KD附近出现了新的峰，分子量等于G9a蛋白与化合物14复合物的分子量，通过对比G9a-化合物14复合物峰对应的分子量与G9a蛋白的峰对应分子量之间差值数据(60397-59915＝482，化合物14的分子量为482.63)，质谱直接证明了化合物14与G9a是共价结合的，如图1所示。
2.共价验证：分子对接实验
为了进一步研究化合物的作用模式，通过进行分子对接模拟实验，模拟将化合物14对接至G9a复合体(PDBcode:3K5K)以及GLP复合体(PDBcode:5TUZ)中，结合模式图分别为图2(A)和图2(B)。从结合模式图可以看出，喹唑啉2位侧链上的丙烯酰基与G9a复合体中的半胱氨酸残基Cys1098以及GLP复合体中的Cys1186非常接近，可以与半胱氨酸发生共价结合，形成C-S键。这些结果表明，化合物14可以进入此结合口袋，并与半胱氨酸残基共价结合，进一步验证了共价。
而式(Ⅰ)所示的化合物的C-2位，均含有亲电活性基团，即共价弹头，故均可与靶标蛋白结合口袋附近的半胱氨酸残基发生迈克尔加成反应，生成共价键，达到共价结合的目的。
3.共价验证：组蛋白甲基化洗脱实验
实验方法如下：待MDA-MB-231细胞密度达到90％左右且细胞状态良好，将细胞消化并计数后，以12万/孔的密度接种到六孔板中，放置在培养箱培养过夜。种板第二天，将化合物14和非共价对照化合物26按10μM的终浓度加入孔内，并设一个与10μM孔所含DMSO相同的孔作为对照，继续培养48h。取出六孔板，抽去培养基，用PBS轻轻洗2遍，将48h处理的细胞收集后放-80℃冻存，剩下的孔加入完全培养基继续培养，并在24h、48h和72h后分别收集相应处理的细胞，作为洗脱后24h、48h、72h。将所有收集得的细胞按细胞数多少加入60-200μLRIPA细胞裂解液(含体积比100:1的磷酸酶抑制剂A、磷酸酶抑制剂B和PMSF)，待细胞在冰上充分裂解后，15000rpm、4℃离心15min。取上清用BCA法进行蛋白定量，根据定量结果将蛋白浓度调齐，加入5x上样缓冲液在100℃金属浴煮10min进行变性。根据蛋白分子量配制相应SDS-PAGE凝胶，将准备好的蛋白样品依次上样，进行电泳分离。电泳参数设定为：浓缩胶恒压70V跑40min；分离胶120V跑60-80min，直至想要的条带充分分离开。之后进行湿法转膜，恒流235mA转90-150min。转膜完成后将PVDF膜用5％脱脂牛奶室温封闭1h。用TBST将膜洗干净后，孵育相应的一抗过夜。第二天，用TBST洗膜5次，每次4min后，室温孵育二抗1h，再用TBST洗膜5次，每次4min。最后，用化学发光液避光处理膜后，在Bio-Rad化学发光成像仪曝光成像。
实验结果分析：如图3所示，在化合物26、14作用48h后，相比于DMSO组，H3K9me2都受到显著抑制，但在洗脱掉化合物后24h，化合物14的共价作用使H3K9me2的抑制一直延续，而化合物26的则恢复。此外，化合物14、26对H3K9me2的抑制作用不依赖于G9a蛋白表达的抑制，而是改变了其酶活性。
4.分子水平组蛋白甲基转移酶G9a活性抑制实验
实验方法如下：准备1x检测缓冲液(改良的Tris缓冲液)。化合物系列稀释：在100％DMSO中通过Echo将化合物转移到测定板。制备酶溶液：在1x检测缓冲液中制备酶溶液。制备底物混合溶液：在1x检测缓冲液中制备底物混合溶液，将5μL的酶溶液转移到检测板或用于低控制转移5μL的1x检测缓冲液，在室温下孵育15分钟，每孔加入5μL底物混合溶液开始反应，G9a在室温下孵育60分钟。然后准备1x Alphalisa缓冲液，在1xAlphalisa缓冲液中制备受体和供体珠混合溶液。加入15μL受体和供体珠混合溶液，室温孵育60分钟，弱光条件，使用Envision或EnSpire使用Alpha模式读取端点。然后进行数据处理，使用等式(1)在Excel中拟合数据以获得抑制值，等式(1)：Inh％＝(Max-Signal)/(Max-Min)*100，使用等式(2)拟合XL-Fit中的数据以获得IC50值，Equation(2):Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+(IC50/X)*HillSlope)，Y是抑制百分比，X是化合物浓度，本发明化合物抑制剂G9a体外酶活性结果见下表1。
表1化合物对G9a酶抑制活性
5.化合物抑制人胰腺癌、乳腺癌细胞增殖实验
采用细胞活力测定的方法测试化合物的细胞活性抑制作用，实验方法如下：待细胞密度达到90％左右且细胞状态良好，消化细胞，进行计数，以每孔1500个/100μL的浓度接种于96孔板，放培养箱中过夜。第二天观察细胞状态是否良好，若良好则先配制药物，将化合物用完全培养基按等比稀释，再以每个浓度三个复孔加入孔内，每孔50μL，将板放回培养箱继续培养96h。96h后，在显微镜下观察细胞，每孔避光加入10μL CCK-8，放入培养箱中孵育1-2h。去除孔内气泡，用酶标仪测定450nm处OD值，使对照组OD值位于0.7-1.5之间。按以下公式计算细胞活力：细胞活力(％)＝(实验组OD值-空白对照组OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值)*100％。最后用GraphPad Prism 8软件进行非线性回归得到对应的半数抑制浓度(IC50)。其中，非共价对照化合物对于Panc-1细胞的抑制活性为14.78±0.07μm，对Mda-mb-231细胞的抑制活性为9.734±0.04μm，而共价化合物14对Panc-1细胞的抑制活性为2.68±0.15μm，对Mda-mb-231细胞的抑制活性为2.88±0.64μm，相比于化合物26，化合物14具有更为显著的药效，也能证明化合物14与G9a实现了共价结合。
6.化合物的克隆形成实验
实验方法如下：将MDA-MB-231和PANC-1细胞消化并计数后，分别以1200个/孔和800个/孔的密度接种到六孔板中，放置在培养箱培养过夜。种板第二天，将化合物14和其非共价对照的化合物26按1.25、2.5、5μM的终浓度加入孔内，并设一个与5μM孔所含DMSO相同的孔作为对照，每个处理设置3个复孔，将板放回培养箱继续培养15天，每隔三天换一次完全培养基，并加入相应浓度的化合物14和非共价对照化合物26。15天后，对照组的细胞克隆大小已长到肉眼可见，抽去培养基，用PBS洗3次，每孔加入800μL 4％多聚甲醛，固定15min。抽掉固定液，再用PBS洗3次，每孔加入800μL结晶紫染液，避光染色30min。回收结晶紫染液，用超纯水洗去多余的染液，将6孔板放置通风橱晾干。用打印机扫描6孔板，并用Image J统计细胞克隆数量。
实验结果分析：结果如图4所示，化合物14、26以浓度依赖的方式使PANC-1细胞和MDA-MB-231细胞的克隆能力降低，相比于非共价对照化合物26，共价化合物14能更显著抑制细胞的克隆形成，克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
7.化合物H3K9甲基化抑制活性评价
实验方法如下：待MDA-MB-231细胞密度达到90％左右且细胞状态良好，将细胞消化并计数后，以12万/孔的密度接种到六孔板中，放置在培养箱培养过夜。种板第2、3、4、5天，分别将化合物14按10μM的终浓度加入孔内，让药物分别作用96h、72h、48h、24h，并设置与10μM孔所含DMSO相同的孔作为对照。在铺板后第6天，取出六孔板，抽去培养基，用PBS轻轻洗2遍。按照文献提取组蛋白，并用Bradford试剂盒进行蛋白定量，根据定量结果将蛋白浓度调齐，加入5x上样缓冲液在100℃金属浴煮10min进行变性。配制15％的SDS-PAGE凝胶，将准备好的蛋白样品依次上样，进行电泳分离。电泳参数设定为：浓缩胶恒压70V跑40min；分离胶120V跑60-80min，直至想要的条带充分分离开。之后进行湿法转膜，恒流235mA转90min。转膜完成后将PVDF膜用5％脱脂牛奶室温封闭1h。用TBST将膜洗干净后，孵育相应的一抗过夜。第二天，用TBST洗膜5次，每次4min后，室温孵育二抗1h，再用TBST洗膜5次，每次4min。最后，用化学发光液避光处理膜后，在Bio-Rad化学发光成像仪曝光成像。
实验结果分析：如图5所示，在MDA-MB-231细胞中，相比于化合物26，化合物14具有更强的抑制G9a甲基化的效力，在10μM的作用浓度下，作用24h就能显著抑制H3K9me2，并且具有时间依赖性和浓度依赖性。
8.化合物的体内抗肿瘤活性实验
实验方法如下：首先将扩增好的状态良好、处于对数生长期的PANC-1细胞消化、离心并计数后，用预冷的PBS重悬洗两次，最后用PBS：Matrigel＝1:1混合液重悬，得到3×106个/100μL的细胞悬液，插冰上备用，然后在每只Balb/c nu/nu的腹背两侧各皮下注射100μL细胞悬液，待肿瘤体积长至50mm3左右，随机分成2组(n＝5)，对照组(记为Vehicle)给予药物助溶剂，实验组(记为14-2mg/kg)给予2mg/kg的化合物14，给药方式均为腹腔注射，一周给药5次，连续给药三周。每隔两天记录小鼠的体重和肿瘤体积，肿瘤体积计算公式为：V(mm3)＝π/6×(长×宽2)，给药结束后，将小鼠安乐死，剥离皮下肿瘤，称重并拍照，并取主要脏器拍照，取部分肿瘤和脏器存放于组织固定液，另一部分冻于液氮，用于后续实验。
实验结果如图6：在胰腺癌细胞PANC-1皮下移植瘤模型的动物实验中，共价抑制剂14能显著抑制PANC-1皮下移植瘤的生长，且对小鼠主要脏器没有明显毒性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
9.酶选择性试验
采用建立的AlphaLISA和HTRF法进一步考察化合物14在分子水平对多个其它组蛋白修饰酶的抑制作用，以确定该化合物对组蛋白修饰酶的选择性。化合物对组蛋白修饰酶PRMT1，PRMT4，PRMT5的分子水平活性的抑制检测均采用AlphaLISA技术进行。使用HTRF测定法评估对EZH2,MLL1,MLL4,DNMT1的选择性。
酶选择性试验结果(表2)表明化合物14对蛋白质G9a/GLP有良好的选择性，是一类特异性靶向G9a/GLP的抑制剂。
表2化合物14对G9a酶抑制活性
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Claims (6)
1.一种G9a/GLP共价抑制剂，其特征在于，为如式(Ⅰ)所示结构的化合物及其盐：
其中，n1、n2、n3、n4独立地选自0～2的整数；
n5为0～4的整数；
X为CH或N；
R1选自氢或C1-C6烷基；
R2为
R3选自C1-C6烷基或C3-C8的环烷基；
R4选自甲氧基；
R5选自C1-C6烷基或C3-C8的杂环烷基；
Ra选自氢、卤素或Rd；
Rb、Rc独立地选自氢或Rd；
Rd选自C1-C6烷基、C2-C6烯基或C3-C6环烷基；
Y选自卤素。
2.一种G9a/GLP共价抑制剂，其特征在于，所述G9a/GLP共价抑制剂为如下编号所示结构及其盐：
3.权利要求1所述G9a/GLP共价抑制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
式(1)所示的化合物与酸在缩合剂、有机碱的条件下发生缩合反应即得式(Ⅰ)所示结构的化合物。
4.权利要求1～2任一所述G9a/GLP共价抑制剂在制备抑制G9a/GLP的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述药物为预防和/或治疗与G9a/GLP相关的细胞异常增殖、形态变化以及运动功能亢进的疾病的药物。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述药物为治疗和/或预防肿瘤生长与转移的药物。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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