CN108383837B - 一种氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物或其可用盐及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物或其可用盐及其制备方法与应用。该化合物或其可用盐具有如下结构通式
或
，其中R1、R2为C1‑5烷基或氨基；R3与N组成5‑6个环成员的杂环基，所述杂环基为含氮、含烷基取代氮或含氧的杂环基。该类化合物或其可药用盐具有强效的PARP1抑制活性，可用于治疗疾病或癌症的药物中用于预防和/或治疗与PARP1相关疾病。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物制备领域，具体涉及一种氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物或其可用盐及其制备方法与应用。
背景技术
聚二磷酸腺苷核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]是一种与单链DNA损伤修复密切相关的核酶，包括18种亚型，其中PARP-1在真核细胞内含量最高，其功能研究也最为深入。PARP-1基因位于1号染色体q41-42区，长度为47400个碱基对。PARP-1蛋白由1014个氨基酸组成的单条肽链构成，按功能可划分为DNA结合区(DBD)、自主修饰区(AMD)和C端催化区(CD)等3部分，其通过DBD结合于DNA断裂端，形成PARP-1-ADP核糖寡聚体，参与细胞核内DNA损伤修复。DBD包含3个锌指结构，其中ZnⅠ和ZnⅡ参与识别DNA单链损伤，然后介导PARP-1与损伤DNA结合，而ZnⅢ参与调节DBD的活性。AMD是酶活性调节中心；CD是催化中心，含有形成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的结合位点和合成聚腺苷二磷酸核糖的催化位点。受体内外物理、化学或生物因素的影响，DNA产生单链或双链损伤时，PARP-1很快被激活，并以NAD+为底物，将聚腺苷二磷酸核糖基转移到受体蛋白，启动DNA的损伤修复过程；但当DNA严重损伤时，PARP-1在催化受体蛋白聚腺苷二磷酸核糖化的过程中，会耗尽细胞内的NAD+和ATP，进而导致细胞凋亡。另有研究表明，PARP-1也参与调控线粒体内DNA损伤修复以及DNA损伤的其他修复途径，如核苷酸切除修复(NER)、错配修复(MMR)、同源重组(HR)和非同源末端连接修复(NHEJ)。
PARP1还可作为转录因子调控DNA损伤应答基因的表达，已有的研究结果提出了PARP-1参与的基因转录调控可能有四种模式。第一种情况是PARP-1通过结合到核小体上，修饰组蛋白结构或组成，PARP-1通过与组蛋白H1竞争与核小体的结合或者是使组蛋白H1发生PAR化修饰来阻断组蛋白H1与启动子的结合。第二种是PARP-1作为隔离子中成分发挥功能，PARP-1能够阻止异染色质的延伸或者阻断增强子在启动子上的作用。PARP-1也能在核基质和DNA甲基化过程中发挥隔离子作用。第三种情况是PARP-1通过把ADP核糖多聚体转移到转录因子上或者是形成转录复合体来实现对其调控作用。在这个模式中，PARP-1促进抑制子的释放，在信号调解转录反应的时候招募刺激因子。但是PARP-1在不同的组织细胞中，对各种转录因子的调控作用是不同的。已有的研究表明，PARP-1作为关键的炎症相关转录调节因子NF-κB、AP-1的共活化子发挥作用，并且PARP-1可以与NF-κB相互作用，通过调节NF-κB表现出促炎作用。第四种模式是PARP-1作为增强子结合因子以一种类似于DNA结合子或者抑制子的方式发挥功能，在这种模式中，PARP-1能结合到DNA的特殊结构或者序列上。PARP-1结合到发夹结构上是PARP-1调控自身基因的基础，CXCL1和BCL6是PARP-1的靶基因，PARP-1能结合到CXCL1的特定序列启动子和BCL6内含子的第一个序列，通过阻断NF-κB与邻近元件的结合来实现对基因转录的抑制。
在正常情况下，细胞主要通过碱基切处修复或同源重组来修复DNA损伤。PARP和BRCA分别是碱基切除修复和同源重组修复的主要参与酶。在多数卵巢癌和三阴性乳腺癌病人中，BRCA的两个亚型BRCA1和BRCA2往往发生突变而失去修复DNA损伤的能力，细胞修复主要通过PARP酶参与的碱基切补修复实现损伤修复，若阻断PARP修复DNA损伤的功能，将引起癌细胞的凋亡，使癌症得到有效治疗。据统计，在乳腺癌高发家族中BRCA1基因突变率达45％，在乳腺癌与卵巢癌均高发的家族中BRCA1基因突变率高达90％，部分散发性乳腺癌也有BRCA1基因突变。此外，BRCA1/2突变还见于卵巢癌等其它实体瘤。2005年Bryant和Framer分别报道了对BRCA1/2介导的同源重组修复功能缺失的细胞单独使用PARP抑制剂，从而对PARP介导的碱基切除修复(base excision repair,BER)通路产生抑制作用，最终导致肿瘤细胞协同致死(synthetic lethality)。这暗示着PARP抑制剂可能存在单独用于治疗某些肿瘤的可能，这一研究成果迅速引起了医药公司和学术界的广泛关注，由此开启了以PARP抑制剂作为高选择性抗肿瘤药物研发的新时代。目前，PARP1已成为近年来抗肿瘤药物研究的前沿分子靶标。
阿斯利康制药公司开发的AZD2281(olaparib/KU-59436)是一种口服PARP小分子抑制剂，在与顺铂、卡铂、紫杉醇等药物联用治疗卵巢癌、乳腺癌和实体瘤的研究中显示了良好的开发前景，目前已经上市。然而，化合物AZD2281对PARP1的选择性和抑制活性较弱，在细胞水平的抑制活性的有效剂量在200nM，体内剂量在100mg以上才显示明显的抗肿瘤活性。临床上每日剂量也高达400mg(50mg胶囊，8粒)，体内作用时间和半衰期较短(<1小时)，生物利用率也较低(<15％)。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物或其可用盐及其制备方法与应用。
一种氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物或其可用盐，具有如下结构通式
其中R1、R2为C1-5烷基或氨基；R3与N组成5-6个环成员的杂环基，所述杂环基为含氮、含烷基取代氮或含氧的杂环基。
作为改进的是，还包括氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物的可用盐。
作为改进的是，所述C1-5氨基为二乙氨基、二正丙氨基、二正丁氨基或N,N,N'-三甲基乙二氨基；所述5-6个环成员的杂环基为吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、N-甲基哌嗪基或N-乙基哌嗪基。
作为改进的是，所述结构式为(2-(1-甲基-哌嗪基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
(2-(1-哌啶基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
(2-(1-N,N,N'-三甲基乙二基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
(2-吗啉基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
(2-吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
(2-二正丁胺-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
(2-二乙胺-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
(2-二正丙胺-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
或(2-1-乙基-哌嗪基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
上述氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物的制备方法，将5-[(3,4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酸与2-氯-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶盐酸盐在缩合剂的作用下得2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮；然后将2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮在碱性条件下与胺反应，即可。反应式如下：
作为改进的是，所述缩合剂为碳化二亚胺EDCI和1-羟基苯并三唑HOBt的混合物。
一种PARP1抑制剂，其包含氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物或其可用盐，以及可药用的赋形剂。
上述氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物或PARP1抑制剂在用于预防和/或治疗与PARP1相关疾病的药物中的用途。
所述与PARP1相关疾病包括缺血性的疾病、神经退行性疾病或癌症。
所述缺血性的疾病包括大脑、脐带、心脏、消化管或视网膜缺血性疾病；所述神经退行性疾病包括帕金森氏症、阿尔兹海默病或肌肉萎缩症；所述癌症包括乳腺癌、卵巢癌、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌或胃癌。
有益效果
本发明所述化合物具有强效的PARP1抑制活性，在体内测试中也表现较强的裸鼠移植瘤增殖抑制活性，可以用于预防及治疗由于PARP1异常引起的疾病，由PARP1介导的疾病包括缺血性的疾病、神经退行性疾病及癌症；其中，所述缺血性的疾病包括大脑、脐带、心脏、消化管、视网膜缺血性疾病、所述神经退行性疾病包括帕金森氏正、阿尔兹海默症、肌肉萎缩症。所述癌症包括乳腺癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、胃癌和其他实体瘤。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明的发酵方法进行详细描述和说明。其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。
1H-NMR用Bruker Advance Ⅲ型核磁共振仪测定；
MS用Agilent 6410Triple Quad LC/MS测定，熔点用上海仪电物光WRS-1B数字熔点仪测定。
实施例1 2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮的制备
5-[(3,4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酸购自上海博邦医药科技有限公司，2-氯-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶盐酸盐的合成参考文献European Journalof Medicinal Chemistry.2014,79,399-412。
将2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯甲酸0.05g(0.1508mmol)溶于5ml二氯甲烷中，依次加入EDCI 0.0516g(0.268mmol)和HOBT 0.0362g(0.268mmol)，滴加若干滴DMF起到助溶作用。室温搅拌1h后，加入DIEA(1.88ml，13,4mmol)，再加2-氯-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶盐酸盐0.551g(0.268mmol)，继续室温搅拌24h。反应液依次用20ml的2mol/l的HCl溶液、2mol/l的NaOH溶液、水洗涤3次，无水硫酸钠干燥。柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)得白色固体26.789mg。产率40％。Mp:222.7-223.3℃。纯度95％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ11.85(s,1H),8.51–8.40(m,1H),8.39–8.03(m,1H),7.80–7.72(m,2H),7.49(dt,J＝25.8,7.2Hz,1H),7.42–7.31(m,2H),7.06(dt,J＝14.4,6.9Hz,1H),4.72(s,2H),4.40–4.20(m,2H),4.15–3.51(m,2H),3.18–2.77(m,2H).MS(ESI),[M-H]-448.2。
实施例2
(2-(1-甲基-哌嗪基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮的制备
将2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮(50mg 0.111mmol 449)溶于10ml无水THF中(加2mlDMF助溶剂)，加入N-甲基哌嗪(22.29mg 0.22mmol 100.1)和三乙胺(0.046ml 0.33mmol 101.19)，60℃下反应过夜。反应液旋干后分散于20ml乙酸乙酯中，依次用20ml水、饱和氯化钠溶液洗涤，乙酸乙酯层无水硫酸钠干燥。柱层析：(石油醚：乙酸乙酯＝1:2)，得白色固体12.5mg。产率22％。Mp:154.5-156。1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.37(tt,1H),8.20(s,1H),8.02–7.78(m,4H),7.51(dtd,1H),7.42(dd,J＝6.4,2.3Hz,1H),7.24–7.13(m,1H),4.74(s,1H),4.44–4.30(m,3H),3.82(dd,J＝6.5,3.8Hz,4H),3.57(t,J＝6.0Hz,1H),2.86(t,J＝6.2Hz,1H),2.69(t,J＝6.1Hz,2H),2.50(td,J＝5.2,2.8Hz,4H),2.35(d,J＝1.6Hz,3H)。MS(ESI),[M+H]+514.3。
实施例3
(2-(1-哌啶基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮的制备
本品由2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮(50mg 0.111mmol 449)和哌啶(18.9mg 0.22mmol 85.15)制得，制备方法同实验例2，得白色固体28.3mg。产率51％。Mp:119.9-121.1℃。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ11.20(d,J＝9.2Hz,1H),8.49(q,J＝4.2,3.8Hz,1H),8.14(s,1H),8.05–7.55(m,3H),7.58–7.17(m,2H),7.07(d,J＝3.4Hz,1H),4.74(s,1H),4.31(d,J＝7.1Hz,2H),4.27–3.83(m,1H),3.77(t,J＝5.3Hz,3H),3.57(t,J＝5.9Hz,1H),2.88(s,2H),2.00(d,J＝46.1Hz,2H),1.77–1.50(m,4H),1.53–0.62(m,2H).MS(ESI),[M+H]+499.3。
实施例4
(2-(1-N,N,N'-三甲基乙二基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮的制备
本品由2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮(50mg 0.111mmol 449)和N,N,N'-三甲基乙二胺(22.68mg0.22mmol102.18)制得，制备方法同实验例2，得白色固体11.6mg产率20％。Mp:108.9-110.8℃.1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.37(ddd,J＝7.1,5.3,1.6Hz,1H),8.21(d,J＝15.8Hz,1H),8.03-7.92(m,1H),7.86(dddd,J＝13.6,8.8,7.2,3.9Hz,3H),7.51(ddt,J＝9.3,6.6,3.3Hz,1H),7.39(ddt,J＝15.1,8.7,4.3Hz,1H),7.19(qd,J＝8.6,2.2Hz,1H),4.74(d,J＝3.8Hz,1H),4.45-4.29(m,3H),4.11(td,J＝7.8,7.3,3.9Hz,1H),3.81(td,J＝7.2,3.3Hz,1H),3.56(tt,J＝10.5,4.8Hz,2H),3.26(d,J＝2.3Hz,3H),3.21(d,J＝4.0Hz,1H),3.15(d,J＝4.0Hz,2H),2.88(dt,J＝12.2,6.3Hz,1H),2.75-2.59(m,3H),2.38(d,J＝1.8Hz,3H).MS(ESI),[M+H]+516.3。
实施例5
(2-吗啉基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮的制备
本品由2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮(50mg 0.111mmol)和吗啉(19.32mg 0.22mmol)制得，制备方法同实验例2，得白色固体29.6mg产率52％。Mp:198.2-198.7℃。纯度92％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.59(s,1H),8.32(s,1H),8.27(d,J＝7.8Hz,1H),7.99(t,J＝9.5Hz,1H),7.91(t,J＝6.9Hz,1H),7.84(t,J＝7.6Hz,1H),7.44(d,J＝6.5Hz,2H),7.26(q,J＝8.4Hz,1H),4.66(s,1H),4.34(d,J＝9.2Hz,2H),4.29(s,1H),3.91(s,1H),3.66(d,J＝5.3Hz,8H),3.48(t,J＝6.0Hz,1H),2.65(s,2H)。MS(ESI),[M+H]+545.3。
实施例6
(2-吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮的制备
本品由2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮(50mg 0.111mmol 449)和吡咯烷(15.78mg 0.22mmol71.07)制得，制备方法同实验例2，得白色固体29.3mg。产率54.4％。Mp:250.0-252.8℃。纯度96％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.59(s,1H),8.27(d,J＝9.5Hz,1H),8.05–7.79(m,3H),7.52–7.16(m,4H),4.64(s,2H),4.34(d,J＝9.4Hz,2H),4.27(s,1H),3.90(s,1H),3.45(s,4H),2.70(d,J＝43.9Hz,2H),1.96(d,J＝34.3Hz,4H).MS(ESI),[M+H]+485.2。
实施例7
(2-二正丁胺-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮的制备
本品由2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮((50mg 0.111mmol 449)和二正丁胺(28.6713 0.22mmol129.15)制得，制备方法同实验例2，得白色固体31mg。产率51％。Mp:185.2-188.5℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.60(s,1H),8.37–8.16(m,1H),8.11–7.91(m,2H),7.91–7.59(m,2H),7.54–7.33(m,2H),7..25(q,J＝8.6Hz,1H),4.63(s,1H),4.34(d,J＝8.7Hz,2H),4.26(s,1H),4.19–3.56(m,2H),3.49(dt,J＝11.1,5.9Hz,4H),2.78–2.42(m,2H),1.53–1.47(m,2H),1.35–1.17(m,6H),0.90(td,J＝7.5,2.8Hz,6H).MS(ESI),[M+H]+543.3。
实施例8
(2-二乙胺-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮的制备
本品由2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮(50mg 0.111mmol 449)和二乙胺(16.28mg 0.22mmol73.14)制得，制备方法同实验例2，得白色固体30mg。产率55％。Mp:217.7-218.2℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.59(s,1H),8.42–8.09(m,2H),8.09–7.75(m,3H),7.55–7.12(m,3H),4.63(s,1H),4.34(d,J＝8.6Hz,2H),4.08(d,J＝146.1Hz,2H),3.56(p,J＝6.7Hz,4H),3.47(t,J＝5.9Hz,1H),2.68(d,J＝46.7Hz,2H),1.10(td,J＝7.0,4.5Hz,6H).MS(ESI),[M+H]+487.3。
实施例9
(2-二正丙胺-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮的制备
本品由2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮(50mg 0.111mmol 449)和二正丙烷(22.46mg 0.22mmol101.19))制得，制备方法同实验例2，得白色固体28.3mg。产率50％。Mp:215.0-218.2℃。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ11.16(d,J＝9.3Hz,1H),8.49(d,J＝7.1Hz,1H),7.91–7.66(m,3H),7.61–7.17(m,3H),7.07(s,1H),4.74(s,1H),4.31(d,J＝7.1Hz,3H),3.52(td,J＝12.3,9.7,4.4Hz,6H),3.00–2.51(m,2H),1.98(s,2H),1.63(q,J＝7.3Hz,4H),0.92(t,J＝7.4Hz,6H).MS(ESI),[M+H]+515.4。
实施例10
(2-1-乙基-哌嗪基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮的制备
本品由2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮(50mg 0.111mmol 449)和N-乙基-哌嗪基(25.42mg0.22mmol 114.19)制得，制备方法同实验例2，得白色固体20.35mg。产率30％。Mp:148.0-150.8℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.59(s,1H),8.54–8.03(m,2H),8.08–7.92(m,1H),7.96–7.75(m,2H),7.53–7.31(m,2H),7.25(q,J＝8.7Hz,1H),4.64(s,2H),4.47–4.14(m,4H),3.47(t,J＝6.0Hz,2H),2.77(dt,J＝18.2,9.3Hz,4H),2.68–2.38(m,2H),1.70(d,J＝12.8Hz,2H),1.29–1.11(m,3H),1.10–0.80(m,2H).MS(ESI),[M+H]+528.5。
实施例11体外细胞增殖抑制实验
细胞株：MCF-7(来源于上海细胞库)，SKBR3(来源于上海细胞库)，MDA-MB-231(来源于上海细胞库)，MX-1(BRCA1-/-)(来源于北京北纳创联生物技术研究院),HCC1937(BRCA1-/-)(来源于上海细胞库)。
实验方法：MTT法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越小，细胞活性越弱，则表示药物毒性越大。
具体方法如下：取对数生长期的肿瘤细胞按MCF-7细胞4000个/孔，SKBR3细胞8000个/孔，MDA-MB-231细胞10000个/孔，MX-1(BRCA1-/-)细胞2000个/孔,HCC1937(BRCA1-/-)细胞8500个/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔180μL。培养过夜后，加入不同浓度(终浓度从100uM开始，2倍稀释6个梯度)的药物作用48h，每个浓度设置三个复孔，并设相应浓度的二甲亚砜(DMSO)溶媒对照及无细胞调零孔。作用结束后，加入实验组分别加入不同浓度的目标化合物，对照组不加药，每组设3个平行孔，37℃培养48h。加入5mg/mL MTT溶液20μL/孔，37℃继续培养4小时后，弃上清，加入150μL DMSO，震荡使甲贊溶解，酶标仪测定OD570值。
按照以下公式计算药物对细胞增殖抑制程度：
抑制率(％)＝(OD对照-OD给药孔)/OD对照孔×100％
并据此按Logit法计算达到50％抑制率时的药物浓度，即IC50值。实验重复三次，计算平均值。5号为2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮，7号，8号，9号，10号，12号，13号，14号，15号，16号分别为(2-(1-甲基-哌嗪基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮、(2-(1-哌啶基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮、(2-(1-N,N,N'-三甲基乙二基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮、(2-吗啉基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮、(2-吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮、(2-二正丁胺-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮、(2-二乙胺-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮、(2-二乙胺-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮、(2-1-乙基-哌嗪基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮。
表1不同药物对细胞增殖的抑制程度
体外细胞增殖抑制实验表明:本发明化合物对人乳腺癌细胞株MX-1(BRCA1-/-)、HCC1937(BRCA1-/-)具有良好的抑制活性，而对BRCA无缺陷的人乳腺癌细胞株MCF-7、SKBR3、MDA-MB-231抑制活性较弱，表明所设计化合物对BRCA缺陷的细胞具有高度的选择性。
实施例12
利用无细胞PARP1酶促反应体系检测
利用PARP1活性检测试剂盒构建无细胞PARP1酶促反应体系，该反应体系能在体外环境中激活PARP1酶的活性。
实施例中使用的PARP1活性检测试剂盒购自Trevigen公司，产地美国，型号为4677-096-K。PARP1活性检测试剂盒包括缓冲液、PARP1重组蛋白、NAD+、单链断裂DNA、重组蛋白1(Histone H1)。
按照PARP1活性检测试剂盒进行配置无细胞PARP1酶促反应体系，具体操作步骤如下：在缓冲液中加入50ng PARP1重组蛋白(PARP protein)、终浓度为10mmol/L NAD+、终浓度为20mg/ml单链断裂DNA。配置完成后，于室温共孵育60min。
在上述无细胞PARP1酶促反应体系中，选用重组组蛋白1(Histone H1)作为目标蛋白(所述Histone H1为PARP1重组蛋白的目标蛋白，能被多聚ADP核糖化修饰)，选用3-氨基苯甲酰胺(3-AB)和奥拉帕尼(Olaparib)作为PARP1抑制剂并同时作为阳性对照药物。
在向反应体系加入NAD+前，先加入终浓度为10mmol/L的3-氨基苯甲酰胺(3-AB)预孵育5分钟后，再按上述无细胞PARP1酶促反应体系进行多聚ADP核糖化反应。待检测药物组则分别加入不同浓度梯度的10号、12号、13号、14号、15号、16号化合物，进行多聚ADP核糖化反应。体系孵育完成后，开始进行PARP1酶活性检测。
采用PARP1活性检测试剂盒测定PARP1活性，具体检测步骤参见PARP1活性检测试剂盒的说明书。其中，以3-AB和Olaparib(10mmol/L)作为阳性对照。
表2部分化合物在分子水平对PARP1酶活性的抑制作用。
从表中我们可以看到，部分化合物在分子水平对PARP1酶表现出高亲和力，对PARP1表现出显著抑制活性，化合物抑制率浓度为纳摩尔级(＜30nM),部分化合物对PARP1的抑制活性强于阳性化合物3-AB。因此，本发明的化合物可以作为强效新型的PARP-1抑制剂，用于预防和治疗与PARP(核糖多聚ADP-核糖聚合酶)相关疾病，如缺血性疾病，神经退行性疾病以及癌症。
Claims (9)
1.一种氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物，其特征在于，具有如下结构通式
其中R1、R2为C1-5烷基；R3与N组成5-6个环成员的杂环基，所述杂环基为含氮、含烷基取代氮或含氧的杂环基；上述化合物的制备方法，将5-[(3,4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酸与2-氯-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶盐酸盐在缩合剂作用下得2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮；然后将2-氯5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮在碱性条件下与胺反应，即可。
2.根据权利要求1所述的氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物的可用盐。
3.根据权利要求1所述的氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物，其特征在于，所述5-6个环成员的杂环基为吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、N-甲基哌嗪基或N-乙基哌嗪基。
4.一种氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物为：
(2-(1-甲基-哌嗪基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
(2-(1-哌啶基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
(2-(1-N,N,N'-三甲基乙二基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
(2-吗啉基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
(2-吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
(2-二正丁胺-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
(2-二乙胺-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
(2-二正丙胺-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
或(2-1-乙基-哌嗪基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶基)-(2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢二氮杂萘-1-基)甲基]苯基)甲酮
5.根据权利要求1所述的一种氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物，其特征在于，所述缩合剂为碳化二亚胺EDCI和1-羟基苯并三唑HOBt的混合物。
6.一种PARP1抑制剂，其包含权利要求1中所定义的化合物以及可药用的赋形剂或权利要求2所述氨基取代四氢吡啶并嘧啶类化合物的可用盐以及可药用的赋形剂。
7.基于权利要求1所述的化合物或权利要求6所述的PARP1抑制剂在制备用于预防和/或治疗与PARP1相关疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述与PARP1相关疾病包括缺血性的疾病、神经退行性疾病或癌症。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述缺血性的疾病包括大脑、脐带、心脏、消化管或视网膜缺血性疾病；所述神经退行性疾病包括帕金森氏症、阿尔兹海默病或肌肉萎缩症；所述癌症包括乳腺癌、卵巢癌、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌或胃癌。
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