CN115154513A - 一种柑橘中精油、纯露、果胶和黄酮类化合物的梯次提取方法 - Google Patents

一种柑橘中精油、纯露、果胶和黄酮类化合物的梯次提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于有机物提取领域，特别是涉及一种柑橘中精油、纯露、果胶和黄酮类化合物的梯次提取方法。本发明提供的提取方法将柑橘果皮与超纯水和氯化钠混合提取得到精油、纯露和沉淀；从沉淀中能够依次提取获得果胶和柑橘黄酮。本发明提供的提取方法能够从柑橘皮中梯次提取获得柑橘精油、纯露、果胶等有效成分，具有绿色，高效，提取成本低，提取工艺简单且稳定可靠的优点。

Description

一种柑橘中精油、纯露、果胶和黄酮类化合物的梯次提取方法
技术领域
本发明属于有机物提取领域，特别是涉及一种柑橘中精油、纯露、果胶和黄酮类化合物的梯次提取方法。
背景技术
柑橘(Citrus reticulata Blanco.)，芸香科柑橘属，是热带、亚热带常绿果树。研究表明柑橘具有多种健康功效，如抗氧化、抗炎、抗癌、降血压、降胆固醇、改善消化和保护视力等功效。事实上，酸甜可口的柑橘果肉只是人们有效利用其营养的一部分，占柑橘总量的20％～40％的柑橘果皮也具有丰富的营养健康成分。柑橘皮含有多种重要的功能活性成分，包括不溶性膳食纤维(占干皮的60％)、果胶(占干皮30％)、香精油(占干皮的3％)、类柠檬苦素(占种子的0.5％～1.0％)、类黄酮(占干皮的0.8％)、多甲氧基黄酮(占鲜皮的0.54％)、辛弗林(占干皮的0.1％～2％)、酚酸类、类胡萝卜素等。
现有技术难以对柑橘皮中的有效成分进行全面利用，从而造成浪费。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种柑橘中精油、纯露、果胶和黄酮类化合物的梯次提取方法。本发明提供的提取方法能够最大程度的从柑橘皮中提取获得有效成分，同时还有简单便捷、快速高效、绿色健康的优势，具有极高的市场化前景。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种柑橘中精油、纯露、果胶和黄酮类化合物的梯次提取方法，所述提取方法包括以下步骤：
(1)将柑橘皮、超纯水和氯化钠混合后进行微波处理得到精油、纯露和皮渣；
所述微波处理时，微波的功率为300W，处理的时间为40～120min，处理时的温度为105℃；
(2)离心皮渣得到柑橘果胶水提物a和沉淀A；
将沉淀A与超纯水混合后依次进行微波和离心处理处理，得到柑橘果胶水提物b和沉淀B；
合并柑橘果胶水提物a和柑橘果胶水提物b后进行纯化处理得到柑橘皮果胶；
所述微波处理时，微波的功率为400W，处理的时间为40min；
(3)将沉淀B与乙醇水溶液混合后依次进行超声波处理和离心处理，得到柑橘黄酮水提物a和沉淀C；
将沉淀C与乙醇水溶液混合后依次进行超声波处理和离心处理，得到柑橘黄酮水提物b；
合并柑橘黄酮水提物a和柑橘黄酮水提物b后进行纯化处理得到柑橘黄酮；
所述超声波处理时，超声波处理的功率为400W，处理的时间为30min。
优选的，其特征在于，所述步骤(1)中柑橘皮与超纯水的固液比为1g：2mL；
柑橘皮与氯化钠的质量比为50：1。
优选的，所述步骤(2)中沉淀A与超纯水的质量体积比为1g：6mL。
优选的，所述步骤(3)中乙醇水溶液的体积浓度为70％。
优选的，所述步骤(3)中沉淀B与乙醇水溶液的质量体积比为1g：3mL。
优选的，所述步骤(2)和步骤(3)中离心的条件为6000g，离心时间为10min。
与现有技术相比，本发明主要具有如下的有益效果：
(1)本发明采用梯次提取法依次从柑橘皮中提取精油、纯露、果胶和黄酮，该方法具有绿色高效，提取效率高，提取成本低，提取时间短，提取工艺简单且稳定可靠，提取能耗低的优点，本发明方法的推广和应用将对柑橘类黄酮产业化发展起到重要的推动作用。
(2)本发明所提供的梯次提取法提取柑橘类黄酮提取物工艺条件的响应面优化方法将为梯次提取法在柑橘类黄酮实际生产中的应用提供可靠的参考，为柑橘类黄酮作为功能性食品的研发提供技术支撑。
附图说明
图1为梯次提取法流程图；
图2为提取时间对柑橘精油提取率的影响图；
图3为料液比对柑橘果胶提取率的影响图；
图4为提取时间对柑橘果胶提取率的影响图；
图5为微波功率对柑橘果胶提取率的影响图；
图6为乙醇浓度对柑橘皮黄酮提取率的影响图；
图7为微波功率对柑橘皮黄酮提取率的影响图；
图8为提取时间对柑橘皮黄酮提取率的影响图；
图9为料液比和提取时间对柑橘果胶提取率的响应面三维图和等高线图；
图10为料液比和微波功率对柑橘果胶提取率的响应面三维图和等高线图；
图11为提取时间和微波功率对柑橘果胶提取率的响应面三维图和等高线图；
图12为乙醇浓度和微波功率对柑皮黄酮提取率的响应面三维图和等高线图；
图13为乙醇浓度和提取时间对柑橘皮黄酮提取率的响应面三维图和等高线图；
图14为提取时间和微波功率对柑橘皮黄酮提取率的响应面三维图和等高线图。
具体实施方式
下文中涉及使用的试剂或器械未注明具体技术或条件者，则按照常规实验条件进行，未明确说明有试剂公司说明书的，则按照说明书所建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
柑橘精油、纯露、果胶和黄酮的梯次提取方法
(1)取新鲜柑橘果皮，切碎，装入密封袋中，置于-20℃保存备用。
(2)准确称量100.0g柑橘皮，按照1:2料液比加入超纯水200mL，2％氯化钠(2.0g)，通过一台XH-300UP电脑微波超声波紫外光组合催化合成仪在105℃下提取柑橘皮中的精油和纯露，设定微波功率为300W，提取的总时长为2h。设备上方接冷凝管，以便收集柑橘皮精油和纯露，上层为精油部分，下层为纯露部分。
在提取过程中，记录柑橘精油得率，以此获得柑橘皮精油的最佳提取时间。
实验结果如图2所示，由图2可知，在提取时间进行到60min时，柑橘精油得率为最大值(1.1mL)，由此确定柑橘精油的最佳提取时间为60min。
(3)将步骤(2)中提取柑橘皮精油和纯露后的皮渣离心(6000g，10min)，获得上清液和沉淀A，上清液为柑橘果胶水提物a。沉淀A进一步采用上述XH-300UP电脑微波超声波紫外光组合催化合成仪进行柑橘果胶的第二遍提取。提取方法为微波提取法：在沉淀A中按照1:6料液比加入超纯水600mL，设置微波功率为400W，提取时间为40min。提取结束后离心(6000g，10min)，获得的上清液为柑橘果胶水提物b，获得的沉淀标记为沉淀B。
将柑橘果胶水提物a和柑橘果胶水提物b混合，使用旋转蒸发仪在80℃旋蒸，浓缩至原体积的1/3。冷却后，将该提取液用三倍体积的95％乙醇醇沉，醇沉步骤在恒温加热式磁力搅拌器上完成，注意逐滴加入95％乙醇，完成该步骤后将样品置于4℃冰箱沉淀过夜；次日，通过4000g离心15min获得柑橘果胶沉淀；接着，沉淀加入30mL 80％的乙醇，摇匀，通过4000g离心15min洗涤沉淀；最后，用60℃超纯水复溶沉淀(若出现无法溶解的沉淀，则需要通过4000g离心15min去除不溶物)。将复溶后的柑橘皮果胶提取物采用透析袋(分子量截留量3.5kDa)作进一步快速纯化，具体方法为：将柑橘皮果胶提取物分装在透析袋中，将透析袋放入透析液(超纯水)中透析，每2h更换一次超纯水，换水前检测透析液的电导率，直至透析前后电导率不再改变。根据实际操作情况得出，大约透析3天可完全透析掉样品中的淀粉水解产物及其他小分子物质；最后，收集透析袋中的样品通过冷冻干燥获得纯化后的柑橘皮果胶，冷冻干燥时间为48h，干燥结束后立即收集样品用分析天平称重。提取率计算公式如下：
提取率＝A/B×100％
其中，A为柑橘皮重量(100g)；B为冻干柑橘皮果胶的重量。
本实施例的柑橘皮果胶提取率为13.92％，果胶产量为13.92g。
(4)将步骤(3)中的沉淀B进一步采用上述XH-300UP电脑微波超声波紫外光组合催化合成仪进行柑橘黄酮的提取。提取方法为超声波提取法：在沉淀B中按照1:3料液比加入300mL 70％乙醇，设置超声波功率为400W，提取时间为30min。提取结束后离心(6000g，10min)，获得的上清液为柑橘黄酮提取物a，获得的沉淀标记为沉淀C。沉淀C采用相同的方法进行第二遍提取，获得柑橘黄酮水提物b。将柑橘黄酮水提物a和柑橘黄酮水提物b混合，使用旋转蒸发仪在50℃旋蒸，浓缩。采用AB-8大孔吸附树脂作进一步快速纯化。最终得到的样品通过冷冻干燥获得最终的柑橘黄酮，冷冻干燥时间为72h，干燥结束后立即收集样品用比色法进行提取率计算。提取率的测定方法如下：
以芦丁为标准品，首先配置500μg/mL的芦丁原液(芦丁标准品1mg与2mL 80％甲醇溶液混匀)。接着，将芦丁原液稀释为100、200、300、400及500μg/mL。准确量取100μL不同浓度芦丁标准液于EP管之中，加入30μL 5％NaNO2，摇匀。6min后加入30μL 10％的Al(NO3)3，摇匀。6min后加入4％NaOH 400μL，混匀反应25min。于510nm处测定吸光度，设置三组平行。最终得到芦丁的标准曲线为：
Y＝2.4687x-0.0249
其中，Y为吸光值，x为芦丁标准液的浓度。
经过计算，本实施例的柑橘类黄酮的提取率为1.14g Rutin/100gWW。
试验例1
柑橘皮果胶的微波提取工艺条件的优化试验
1.单因素多水平实验
根据实施例1的制备柑橘皮果胶的方法，筛选出3个影响柑橘果胶提取率的因素，即：料液比、提取时间、微波功率；以柑橘果胶提取率为参考指标，进行单因素多水平实验。
1.1料液比的单因素实验
选取5个水平进行料液比的单因素实验：固定提取时间为40min，微波功率为400W，测量在料液比(原料：超纯水)分别为1:2，1:4，1:6，1:8，1:10时柑橘果胶的提取率。
料液比对柑橘果胶提取率的影响如图3所示，从试验结果可以看出，柑橘果胶的提取率随着料液比的增加而增加，当料液比为1:8时，柑橘类黄酮的提取率达到最高值，为15.08％。随着料液比的增加，柑橘果胶的提取率又呈现降低趋势，故最佳料液比为1:8。
1.2提取时间的单因素实验
选取5个水平进行提取时间的单因素实验：固定料液比为1:8，微波功率为400W，测量在提取时间分别为20min，30min，40min，50min，60min时柑橘果胶的提取率。
提取时间对柑橘果胶提取率的影响如图4所示，根据该结果可以看出，随着提取时间的增加，柑橘果胶的提取率呈上升的趋势，当提取时间为40min时，柑橘果胶的提取率达到最大值14.48％。随后，柑橘果胶提取率呈现明显降低趋势，故单因素试验确定的最佳提取时间为40min。
1.3微波功率的单因素实验
选取5个水平进行微波功率的单因素实验：固定料液比为1:8，提取时间为40min，测量在微波功率为200W，300W，400W，500W，600W时柑橘果胶的提取率。
微波功率对柑橘果胶提取率的影响的试验结果为图5所示，根据图5可以看出，柑橘果胶的提取率随微波功率的增加呈现先增加后降低的趋势，微波功率为400W时柑橘果胶的提取率最高16.10％，随后呈现轻微下降趋势。故单因素试验确定的最佳微波功率为400W。
2.响应面分析试验
根据上述单因素多水平实验结果，以料液比(X1)、提取时间(X2)、微波功率(X3)为自变量，以柑橘果胶提取率为响应值，采用Box-Behnken中心组合设计法设计三因素三水平的响应面分析试验，响应面试验设计因素与水平如表1所示。
表1响应面试验设计因素与水平
Figure BDA0003731457530000061
根据Box-Behnke试验设计原理，利用响应面设计三因素三水平进一步优化柑橘果胶提取的反应条件，实施17个试验点，其中12个分析因子，5个中心试验以估计误差。表2列出了响应面实验矩阵和实验数据。
表2响应面实验设计与结果
Figure BDA0003731457530000071
采用Design Expert 8.0.6对试验结果进行回归拟合分析生成二阶多项式方程，得到具有编码因子的最终方程如下：
Y＝16.24+0.68X1+0.52X2+0.32X3+0.44X1X2+0.055X1X3-0.42X2 X3-1.10X1 2-0.69X2 2-1.37X3 2
其中，Y是柑橘果胶的提取率；X1、X2和X3分别是料液比、提取时间(min)、微波功率(W)。
表3回归方程方差分析
Figure BDA0003731457530000072
Figure BDA0003731457530000081
注：R2＝0.9959，R2 adj＝0.9221，C.V.＝2.40％，adeq.precision＝12.609；
*显著差异(p<0.05)，**极显著差异(p<0.01)。
表3为回归模型的方差分析表，二次回归模型具有较高的F值(22.05)和较低的P值(P＝0.0002)表明该模型的适用性非常显著。模型的决定系数R2＝0.9959，校正决定系数R2 adj＝0.9221，证明该模型与实际实验过程具有较高的拟合度。因此，该回归模型具有可行性，可以利用该模型对柑橘果胶提取率与单因素水平变化的关系以及数据波动进行预测。
在本实验中，当P<0.05时，表明该因素显著，当P<0.01时，表明该因素极显著。失拟项P值(0.0822，P>0.05)和F值(4.79)表明残差主要有随机误差组成，对优化结果的影响可以忽略不计。此外，C.V.(方程中Y的变异系数)值代表实验的置信度，C.V.值越大，表示实验可靠性低，本试验中C.V.＝2.40％，表明实验操作可信，具有足够的准确性和普遍适用性。此外，参数优化系数表明线性系数(X1，X2，X3)，二次项(X1 2，X2 2，X3 2)和相互作用系数(X1X2，X2X3)对柑橘果胶的提取率有很大影响(P<0.05)。
图9、10、11显示了响应面预测结果的三维响应面图(3D)和等高线图。通常，带有椭圆形轮廓图的响应面表明相应变量之间的相互作用是显著的，而圆形轮廓图表明相应变量之间的相互作用是不显著的。由图9-11可知，料液比(X1)和提取时间(X2)、提取时间(X2)和微波功率(X3)之间的相互作用是显著的。
根据上述步骤构建的回归模型，应用统计学软件Design-Expert 8.0.6对柑橘果胶的微波提取工艺进一步优化，结果显示，在以下最佳反应条件下可以得到最大提取率的柑橘果胶：料液比为1:8.68、提取时间45.39min、微波功率为392.02W，柑橘果胶提取率的预测值为16.49％。考虑实际操作，将以上条件调整为料液比为1:8.7、提取时间45min、微波功率为400W，在料液比为1:8.7、提取时间45min、微波功率为400W的条件下进行三次验证试验，测得柑橘果胶提取率为16.38±0.52％，与理论预测值相差不大，说明Box-Behnken中心组合设计-响应面法优化后的闪式提取法提取柑橘果胶的工艺可行，可推广于产业应用。
试验例2
柑橘皮黄酮的超声波提取工艺条件的优化试验
1.单因素多水平实验
根据实施例1的制备柑橘皮黄酮的方法，筛选出3个影响柑橘皮黄酮提取率的因素，即：乙醇浓度、提取时间、超声功率；以柑橘皮黄酮提取率为参考指标，进行单因素多水平实验。
1.1乙醇浓度的单因素实验
选取5个水平进行乙醇浓度的单因素实验：固定超声功率为400W，提取时间为30min，测量在乙醇浓度(％)分别为50％、60％、70％、80％、90％时柑橘皮黄酮的提取率。
乙醇浓度对柑橘皮黄酮提取率的影响如图6所示，从试验结果可以看出，当乙醇浓度为50％时，柑橘皮黄酮的提取率仅为0.85g Rutin/100gWW，当乙醇浓度为60％时，柑橘皮黄酮的提取率达到了1.52g Rutin/100g WW左右，随着乙醇浓度的增加，柑橘皮黄酮的提取率又呈现明显降低趋势，故最佳乙醇浓度为60％。
1.2超声波功率的单因素实验
选取5个水平进行提取转速的单因素实验：乙醇浓度为60％，提取时间为30min，测量在超声功率为200、300、400、500、600W时柑橘皮黄酮的提取率。
超声波功率对柑橘皮黄酮提取率的影响的试验结果为图7所示，根据图7可以看出，柑橘皮黄酮的提取率随超声波功率的增加呈现先增加后降低的趋势，超声波功率为500W时柑橘皮黄酮的提取率最高1.82g Rutin/100gWW。故单因素试验确定的最佳超声波功率为500W。
1.3提取时间的单因素实验
选取5个水平进行提取时间的单因素实验：固定乙醇浓度为60％，超声波功率为500W，测量在提取时间分别为10、20、30、40、50min时柑橘皮黄酮的提取率。
提取时间对柑橘皮黄酮提取率的影响如图8所示，根据该结果可以看出，当提取时间为20min时，柑橘皮黄酮的提取率达到最大值1.95g Rutin/100gWW。随后，柑橘皮黄酮提取率呈现出明显下降的趋势，故单因素试验确定的最佳提取时间为20min。
2.响应面分析试验
根据上述单因素多水平实验结果，以乙醇浓度(X1)、超声波功率(X2)、提取时间(X3)为自变量，以柑橘皮黄酮提取率为响应值，采用Box-Behnken中心组合设计法设计三因素三水平的响应面分析试验，响应面试验设计因素与水平如表4所示。
表4响应面试验设计因素与水平
Figure BDA0003731457530000101
根据Box-Behnke试验设计原理，利用响应面设计三因素三水平进一步优化柑橘皮黄酮提取的反应条件，实施17个试验点，其中12个分析因子，5个中心试验以估计误差。表5列出了响应面实验矩阵和实验数据。
表5响应面实验设计与结果
Figure BDA0003731457530000102
Figure BDA0003731457530000111
采用Design Expert 8.0.6对试验结果进行回归拟合分析生成二阶多项式方程，得到具有编码因子的最终方程如下：
Y＝2.00+0.01X1-0.12X2+0.059X3+0.24X1X2+0.22X1X3-0.015X2 X3–0.20X1 2-0.20X2 2-0.39X3 2
其中，Y是柑橘皮黄酮的提取率；X1、X2和X3分别是乙醇浓度(％)、超声波功率(W)、提取时间(min)。
表6回归方程方差分析
Figure BDA0003731457530000112
Figure BDA0003731457530000121
注：R2＝0.8725，R2 adj＝0.7085，C.V.＝11.49％，adeq.precision＝6.050；
*显著差异(p<0.05)，**极显著差异(p<0.01)。
表6为回归模型的方差分析表，二次回归模型具有较高的F值(5.32)和较低的P值(P＝0.0192)表明该模型的适用性较显著。模型的决定系数R2＝0.8725，校正决定系数R2 adj＝0.7085，证明该模型与实际实验过程具有较高的拟合度。因此，该回归模型具有可行性，可以利用该模型对柑橘皮黄酮提取率与单因素水平变化的关系以及数据波动进行预测。
在本实验中，当P<0.05时，表明该因素显著，当P<0.01时，表明该因素极显著。失拟项P值(0.0828，P>0.05)和F值(4.77)表明残差主要有随机误差组成，对优化结果的影响可以忽略不计。此外，C.V.(方程中Y的变异系数)值代表实验的置信度，C.V.值越大，表示实验可靠性低，本试验中C.V.＝11.49％，表明实验操作可信，具有足够的准确性和普遍适用性。此外，参数优化系数表明二次项(X3 2)和相互作用系数(X1X2，X1X3)对柑橘皮黄酮的提取率有较大影响(P<0.05)。
图12、13、14显示了响应面预测结果的三维响应面图(3D)和等高线图。通常，带有椭圆形轮廓图的响应面表明相应变量之间的相互作用是显著的，而圆形轮廓图表明相应变量之间的相互作用是不显著的。由图12-14可知，乙醇浓度(X1)和提取时间(X2)、乙醇浓度(X1)和转速(X3)之间的相互作用是较为显著的。
根据上述步骤构建的回归模型，应用统计学软件Design-Expert 8.0.6对柑橘皮黄酮的超声波提取工艺进一步优化，结果显示，在以下最佳反应条件下可以得到最大提取率的柑橘皮黄酮：乙醇浓度为59.72％、超声波功率为458.17W、提取时间为20.24min，柑橘皮黄酮提取率的预测值为2.03g Rutin/100gWW。考虑实际操作，将以上条件调整为乙醇浓度为60％、超声波功率为460W、提取时间为20.2min，在乙醇浓度为60％、超声波功率为460W、提取时间为20.2min的条件下进行三次验证试验，测得柑橘皮黄酮提取率为1.95±0.13g Rutin/100g WW，与理论预测值相差不大，说明Box-Behnken中心组合设计-响应面法优化后的超声波法提取柑橘皮黄酮的工艺可行，可推广于产业应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本发明的发明人来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种柑橘中精油、纯露、果胶和黄酮类化合物的梯次提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：
(1)将柑橘皮、超纯水和氯化钠混合后进行微波处理得到精油、纯露和皮渣；
所述微波处理时，微波的功率为300W，处理的时间为40～120min，处理时的温度为105℃；
(2)离心皮渣得到柑橘果胶水提物a和沉淀A；
将沉淀A与超纯水混合后依次进行微波和离心处理处理，得到柑橘果胶水提物b和沉淀B；
合并柑橘果胶水提物a和柑橘果胶水提物b后进行纯化处理得到柑橘皮果胶；
所述微波处理时，微波的功率为400W，处理的时间为40min；
(3)将沉淀B与乙醇水溶液混合后依次进行超声波处理和离心处理，得到柑橘黄酮水提物a和沉淀C；
将沉淀C与乙醇水溶液混合后依次进行超声波处理和离心处理，得到柑橘黄酮水提物b；
合并柑橘黄酮水提物a和柑橘黄酮水提物b后进行纯化处理得到柑橘黄酮；
所述超声波处理时，超声波处理的功率为400W，处理的时间为30min。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中柑橘皮与超纯水的固液比为1g：2mL；
柑橘皮与氯化钠的质量比为50：1。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中沉淀A与超纯水的质量体积比为1g：6mL。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中乙醇水溶液的体积浓度为70％。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中沉淀B与乙醇水溶液的质量体积比为1g：3mL。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中离心的条件为6000g，离心时间为10min。
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