CN111743940B - 一种提取树莓干果黄酮的方法 - Google Patents

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Abstract

一种提取树莓干果黄酮的方法，将经过人工去蒂的树莓干果放入粉碎机中粉碎，重复粉碎多次后将树莓干果粉末样品放入密封袋保存；称取3g树莓干果粉末样品，放入烧杯中，在30：1液料比的条件下加入2mg/mL的果胶酶，再将溶液置入50℃的恒温水浴锅中静置40min；将溶液取出放入闪式提取器中，在提取时间25S、提取功率75V的条件下进行2次提取处理；提取完毕后再将溶液均分在两个离心试管中，配平后在转速3500r、离心时间15min的条件下进行离心处理，将离心后的上清液进行抽滤，把所得滤液转移至烧杯中，用60％体积分数的乙醇溶液定容至100mL容量瓶中，得到提取液。该方法能够快速有效地从树莓中提取黄酮。

Description

一种提取树莓干果黄酮的方法
技术领域
本发明属于天然提取物技术领域，具体涉及一种提取树莓干果黄酮的方法。
背景技术
黄酮类化合物又称黄酮体或者黄碱素，种类丰富，是以2个苯环(A环与B环)通过C3连接成一系列化合物，形成C6－C3－C6结构，是植物在光合作用过程中的一类非常重要的天然有机化合物。黄酮类化合物在抗氧化能力，抑菌和抗病毒上有不错的发挥。黄酮最突出的功效是它的抗氧化能力。黄酮类化合物在清除体内细胞的DPPH·自由基、羟基自由基和ABTS+自由基上有很强的能力。这些自由基在细胞体内中极其不稳定，他们会通过氧化细胞，破坏细胞内的组织结构，来获得能量使自身达到稳定状态。黄酮类化合物会与这些自由基发生一系列的化学反应，从而减缓细胞的衰老和失去生命活性。除此之外黄酮还具有改善血液循环、降低人体内的胆固醇含量和改善睡眠的功效。
很多天然果实中虽然含有大量的黄酮物质，但是由于黄酮的组织结构复杂且复合物种类繁多，在大多溶解剂中溶解度不高，所以黄酮类化合物提取率一向不是很高。常见的提取黄酮的方法有醇提取法、膜分离提取法、酶解法和微波提取法等。醇提取法是利用了黄酮类化合物在极性强的有机溶剂中溶解度大的原理。常见的提取黄酮有机溶剂有乙醇、甲醇和乙酸乙酯等。其中经常使用的有机溶剂是乙醇，因为乙醇在有机溶剂中极性较强且经济实惠。根据相关实验表明，为了在提取过程中提高黄酮类化合物的纯度，可以在用乙醇溶液提取之前加入正己烷或者石油醚进行脱脂和脱色。膜分离法也是提取黄酮的常用方法之一，其中在黄酮类化合物的提取和分离上更是广泛使用超滤法。操作方法简便、不破坏细胞内的组织结构、用时较短和不用进行加热能耗较少都是超滤在提取和纯化黄酮类化合物上的优势。并且超滤装置还可以重复多次使用，进一步降低了实验成本。在大多数提取黄酮的方法中，几乎都会选用酶解法作为辅助提取黄酮的方法。因为在实验过程中使用酶进行辅助提取，可以极大的增加黄酮的提取率。但是酶具有专一性，所以选择适合实验物质的酶就极为重要。微波提取法是将待提取溶液放入反应器中，通过反应器释放的高频率的电磁波进入待提取物质的内部。高频率的电磁波会在细胞内释放大量的热量，从而使细胞内的压强快速上升。当细胞的压力超过细胞可以承受的临界值时，细胞的组织结构就会破裂，细胞内的有效成分也随之分离出来。使用此方法提取操作简便、所需能量较少、没有相关副产品的产出也就没有污染，并且微波提取法可以适应大多物质的特性，可以被广泛的使用。
树莓一般种植第二年即可收获，生长周期较短，繁殖能力较强。我国大部分土壤都适合树莓的生长繁殖，产量可观。树莓的果实饱满，色泽红润，可以直接采摘食用，口感酸甜，并且营养价值较高。树莓中除了含有丰富的氨基酸、矿物质、维生素之外，还含有黄酮类化合物、鞣花酸、花色苷、水杨酸、树莓酮等多种功能性成分；具有除黄褐斑、改善记忆障碍、治疗骨质疏松症和治疗妇科疾病等多种生物学功效，有着“生命之果”的美誉。
由于植物的呼吸作用，果实在采摘之后细胞会分解体内储存的营养物质进行代谢。导致果实失水收缩和腐败变质，极大的影响其外观及食用价值。而树莓果实的呼吸强度与其他类果实相比更强，因此树莓鲜果在采摘之后需要及时地进行预处理，并且要一套相对完整的冷链才可以将其运输到加工工厂或者消费市场。但是这样处理的树莓鲜果货架期也较短，成本也较高。而将树莓鲜果进行加工后的干果易贮藏和运输，还可以保证树莓的营养价值。并且树莓干果可以药食两用，其中的黄酮含量较大，营养价值高，有很好的抗氧化活性和抑菌活性，具有很高的科学研究价值。因此对树莓干果进行研究与开发，既有效利用了树莓所含的营养价值，也可以推动树莓产业的发展。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种提取树莓干果黄酮的方法，该方法工艺简单，能够有效地从树莓中提取黄酮，且其提取效率高，用时短，提取速度快。
为了实现上述目的，本发明提供一种提取树莓干果黄酮的方法，包括以下步骤：
S1：将经过人工去蒂的树莓干果，放入粉碎机中粉碎，重复粉碎多次后将粉末放入密封袋保存，得到树莓干果粉末样品；
S2:准确称取3g树莓干果粉末样品，放入烧杯中，在30：1液料比的条件下加入2mg/mL的果胶酶，再将溶液置入50℃的恒温水浴锅中静置40min；
S3:将溶液取出，放入闪式提取器中，在提取时间25S、提取功率75V的条件下进行2次提取处理；
S4:提取完毕后再将溶液均分在两个离心试管中，配平后在转速3500r、离心时间15min的条件下用离心机进行离心处理，将离心后的上清液进行抽滤，把所得滤液转移至烧杯中，用60％体积分数的乙醇溶液定容至100mL容量瓶中，得到提取液。
作为一种优选，在步骤一中，所述粉碎机为FZ102微型粉碎机。
作为一种优选，在步骤二中，所述恒温水浴锅为HH-2型数显恒温水浴锅。
作为一种优选，在步骤三中，所述闪式提取器为ZHBE-50T闪式提取器。
作为一种优选，在步骤四中，所述离心机为TDL-80-2B离心机。
本发明工艺简单，采用了酶辅闪式的提取方法对树莓黄酮进行提取，可以快速有效地对树莓中的黄酮进行高效的提取。因为在极性越强的有机溶剂中黄酮的溶解度越大，并且乙醇作为中性溶剂几乎不会破坏树莓的营养价值，所以采取乙醇作为溶剂，再使用酶辅闪式的提取方法，可以有效地提取树莓中的黄酮。果胶酶是一类复合酶，它可以分解植物中果胶质，将其细胞组织结构破坏，分离出细胞内的有效成分。使用果胶酶处理不仅可以缩短提取时间，减少溶剂用量，还可以有效地提高有效成分的提取率和物料的过滤速度。使用闪式提取器可以快速、有效地破坏细胞组织结构，搅拌棒的高速搅拌，可以让提取物质充分溶解于溶剂中。
附图说明
图1是芦丁标准曲线；
图2是酶浓度对树莓黄酮提取率的影响曲线图；
图3是酶解温度对树莓黄酮提取率的影响曲线图；
图4是液料比对树莓黄酮提取率的影响曲线图；
图5是乙醇体积分数对树莓黄酮提取率的影响曲线图；
图6是酶解时间对树莓黄酮提取率的影响曲线图；
图7是提取功率对树莓黄酮提取率的影响曲线图；
图8是提取时间对树莓黄酮提取率的影响曲线图；
图9是提取次数对树莓黄酮提取率的影响；
图10是酶浓度与酶解温度的交互作用对黄酮提取影响的等高线图；
图11是酶浓度与酶解温度的交互作用对黄酮提取影响的响应曲面图；
图12是酶浓度与液料比的交互作用对黄酮提取影响的等高线图；
图13是酶浓度与液料比的交互作用对黄酮提取影响的响应曲面图；
图14是酶浓度与提取次数的交互作用对黄酮提取影响的等高线图；
图15是酶浓度与提取次数的交互作用对黄酮提取影响的响应曲面图；
图16是酶解温度与液料比的交互作用对黄酮提取影响的等高线图；
图17是酶解温度与液料比的交互作用对黄酮提取影响的响应曲面图；
图18是酶解温度与提取次数的交互作用对黄酮提取影响的等高线图；
图19是酶解温度与提取次数的交互作用对黄酮提取影响的响应曲面图；
图20是液料比与提取次数的交互作用对黄酮提取影响的等高线图；
图21是液料比与提取次数的交互作用对黄酮提取影响的响应曲面图；
图22是不同质量浓度样品的ABTS+自由基清除率的曲线图；
图23是不同质量浓度样品的羟基自由基清除率的曲线图；
图24是不同质量浓度样品的DPPH·自由基清除率的曲线图；
图25是不同质量浓度样品的还原能力的曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明提供了一种提取树莓干果黄酮的方法，包括以下步骤：
S1：将经过人工去蒂的树莓干果，放入粉碎机中粉碎，重复粉碎多次后将粉末放入密封袋保存，得到树莓干果粉末样品；
S2:准确称取3g树莓干果粉末样品，放入烧杯中，在30：1液料比的条件下加入2mg/mL的果胶酶，再将溶液置入50℃的恒温水浴锅中静置40min；
S3:将溶液取出，放入闪式提取器中，在提取时间25S、提取功率75V的条件下进行2次提取处理；
S4:提取完毕后再将溶液均分在两个离心试管中，配平后在转速3500r、离心时间15min的条件下用离心机进行离心处理，将离心后的上清液进行抽滤，把所得滤液转移至烧杯中，用60％体积分数的乙醇溶液定容至100mL容量瓶中，得到提取液。
作为一种优选，在步骤一中，所述粉碎机为FZ102微型粉碎机。
作为一种优选，在步骤二中，所述恒温水浴锅为HH-2型数显恒温水浴锅。
作为一种优选，在步骤三中，所述闪式提取器为ZHBE-50T闪式提取器。
作为一种优选，在步骤四中，所述离心机为TDL-80-2B离心机。
实验方法：
一、标准曲线绘制：
采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法绘制标准曲线，具体步骤如下；
A1：准确称量5mg芦丁标准品放入烧杯中，用60％体积分数的乙醇溶液溶解并定容到50mL容量瓶中，得到0.1mg/mL芦丁标准液；
A2：取6支带有刻度的10mL试管，在试管中分别加入0.1mg/mL的芦丁标准液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，再向6支试管中均加入0.3mL 10％亚硝酸钠溶液与6mL 60％乙醇溶液充分摇匀，静置6min；
A3：向每支试管中加入0.3mL 10％硝酸铝溶液，摇匀并静置6min；
A4：向每支试管中加入2mL 8％氢氧化钠溶液，静置15min；
A5：用60％体积分数的乙醇溶液作为溶剂将每支试管中的混合液定容到10mL容量瓶中；
A6：在510nm波长处测定吸光值并记录相关数据；以横坐标为芦丁标准品的浓度，纵坐标为测得的吸光值，并计算标准回归方程；利用Excel软件把实验数据绘制成芦丁标准曲线；
二、黄酮的测定：
在10mL试管中加入提取液0.3mL，进行吸光值的测定。将测定的吸光值代入芦丁标准曲线中计算出提取液中的黄酮浓度，再公式(2-1)计算出黄酮得率。
黄酮得率＝CV/M (2-1)
式中，C表示提取液中黄酮的浓度，mg/mL；
V表示提取液体积，mL；
M表示树莓干果粉末质量，g。
三、单因素实验：
将提取功率、酶解温度、提取次数、酶解时间、液料比、酶浓度、提取时间和乙醇体积分数作为研究对象，以黄酮得率为指标进行单因素实验。
1、酶浓度对树莓干果黄酮提取率的影响
准确称取3g树莓干果粉粉末样品5份，分别放入5个烧杯中。在液料比30:1的条件下加入酶浓度分别为0mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL的果胶酶。在50℃的恒温水浴锅中酶解40min。然后将溶液在提取功率75V，提取时间25S的闪式提取器中提取2次。再将提取液进行离心，抽滤后用60％乙醇溶液定容至100mL容量瓶中。最后测定提取液的吸光值并计算黄酮浓度和得率，得不同酶浓度对黄酮提取的影响。
2、酶解温度对树莓干果黄酮提取率的影响
准确称取3g树莓干果粉粉末样品5份，分别放入5个烧杯中。在液料比30:1的条件下加入酶浓度2mg/mL的果胶酶。在温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的恒温水浴锅中酶解40min。然后将溶液在提取功率75V，提取时间25S的闪式提取器中提取2次。再将提取液进行离心，抽滤后用60％乙醇溶液定容至100mL容量瓶中。最后测定提取液的吸光值并计算黄酮浓度和得率，得不同酶解温度对黄酮提取的影响。
3、酶解时间对树莓干果黄酮提取率的影响
准确称取3g树莓干果粉粉末样品5份，分别放入5个烧杯中。在液料比30:1的条件下加入酶浓度2mg/mL的果胶酶。在50℃的恒温水浴锅中分别酶解20min、30min、40min、50min、60min。然后将溶液在提取功率75V，提取时间25S的闪式提取器中提取2次。再将提取液进行离心，抽滤后用60％乙醇溶液定容至100mL容量瓶中。最后测定提取液的吸光值并计算黄酮浓度和得率，得不同酶解时间对黄酮提取的影响。
4、液料比对树莓干果黄酮提取率的影响
准确称取3g树莓干果粉粉末样品5份，分别放入5个烧杯中。在液料比分别为20:1、25:1、30:1、35:1、40:1的条件下加入酶浓度2mg/mL的果胶酶。在50℃的恒温水浴锅中酶解40min。然后将溶液在提取功率75V，提取时间25S的闪式提取器中提取2次。再将提取液进行离心，抽滤后用60％乙醇溶液定容至100mL容量瓶中。最后测定提取液的吸光值并计算黄酮浓度和得率，得不同液料比对黄酮提取的影响。
5、乙醇体积分数对树莓干果黄酮提取率的影响
准确称取3g树莓干果粉粉末样品5份，分别放入5个烧杯中。在液料比30:1的条件下加入酶浓度2mg/mL的果胶酶。在50℃的恒温水浴锅中酶解40min。然后将溶液在提取功率75V，提取时间25S的闪式提取器中提取2次。再将提取液进行离心，抽滤后用体积分数分别为40％、50％、60％、70％、80％乙醇溶液定容至100mL容量瓶中。最后测定提取液的吸光值并计算黄酮浓度和得率，得不同乙醇体积分数对黄酮提取的影响。
6、提取功率对树莓干果黄酮提取率的影响
准确称取3g树莓干果粉粉末样品5份，分别放入5个烧杯中。在液料比30:1的条件下加入酶浓度2mg/mL的果胶酶。在50℃的恒温水浴锅中酶解40min。然后将溶液在提取功率分别为25V、50V、75V、100V、125V，提取时间25S的闪式提取器中提取2次。再将提取液进行离心，抽滤后用60％乙醇溶液定容至100mL容量瓶中。最后测定提取液的吸光值并计算黄酮浓度和得率，得不同提取功率对黄酮提取的影响。
7、提取次数对树莓干果黄酮提取率的影响
准确称取3g树莓干果粉粉末样品5份，分别放入5个烧杯中。在液料比30:1的条件下加入酶浓度2mg/mL的果胶酶。在50℃的恒温水浴锅中酶解40min。然后将溶液在提取功率75V，提取时间25S的闪式提取器中分别提取1、2、3、4、5次。再将提取液进行离心，抽滤后用60％乙醇溶液定容至100mL容量瓶中。最后测定提取液的吸光值并计算黄酮浓度和得率，得不同提取次数对黄酮提取的影响。
8、提取时间对树莓干果黄酮提取率的影响
准确称取3g树莓干果粉粉末样品5份，分别放入5个烧杯中。在液料比30:1的条件下加入酶浓度2mg/mL的果胶酶。在50℃的恒温水浴锅中酶解40min。然后将溶液在提取功率75V，提取时间分别为10s、20s、25s、30s、35s的闪式提取器中分别提取2次。再将提取液进行离心，抽滤后用60％乙醇溶液定容至100mL容量瓶中。最后测定提取液的吸光值并计算黄酮浓度和得率，得不同提取时间对黄酮提取的影响。
四、Plackett-Burman实验：
综合分析单因素实验结果,利用Plackett-Burman软件设计实验，筛选出影响树莓干果黄酮提取率的重要因素。用X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8分别代表酶浓度(mg/mL)、酶解温度(℃)、酶解时间(min)、液料比、乙醇浓度(％)、提取功率(W)、提取次数(次)、提取时间(S)。每个因素取2个水平，详见表2-3。
表2-3 Plackett-Burman实验因素编码及水平
Figure BDA0002558478340000081
五、最陡爬坡实验：
通过最陡爬坡试验使重要因素的取值逼近最优区域,建立有效的响应面拟合方程。根据Plackett-Burman试验结果,设计各重要因素的爬坡方向和步长,确定各重要因素的最佳取值。
六、Box-Behnken响应面实验：
采用Box-Behnken响应面优化法。根据PB实验结果和爬坡实验的各主要影响因子的最优取值。选取4个主要影响因子，即酶浓度、提取次数、液料比和酶解温度进行响应面优化实验。将实验所得数据进行回归拟合，建立数学模型。使用软件对相关数据进行方差分析并且绘制出各因素交互作用的等高线图和响应面曲线图。再预测当黄酮得率达到最大值时，各因素的最佳工艺条件并进行验证实验。用A、B、C、D分别代表酶浓度(mg/mL)、酶解温度(℃)、液料比和提取次数(次)。每个因素取3个水平，详见表2-4。
表2-4 Box-Behnken实验因素编码及水平
Figure BDA0002558478340000082
Figure BDA0002558478340000091
七、树莓干果黄酮体外抗氧化活性测定：
1、提ABTS+自由基清除能力的测定
ABTS工作液的制备：称取一定量的ABTS固体配制成浓度为7.4mmol/mL ABTS溶液。称取一定量的过硫酸钾固体配制成浓度为2.6mmol/mL过硫酸钾溶液。在烧杯中加入50mL7.4mmol/mL ABTS溶液和0.88mL 2.6mmol/mL过硫酸钾溶液充分混匀，静置12小时。将静置后的溶液用蒸馏水稀释，直至溶液在波长734nm处的吸光值为0.7±0.02。
在比色皿中分别加入0.2mL浓度分别为0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL的样品溶液。再分别加入1mL ABTS工作液，混匀，于避光环境中静置6min。在波长734nm处测定吸光值。用无水乙醇代替样品溶液作空白实验。用Vc作阳性对照。按公式(2-2)计算ABTS+自由基清除率。
ABTS+自由基清除率＝(A0-A)/A0×100％ (2-2)
式中，A0表示用无水乙醇代替样品溶液测得的吸光值；
A表示样品溶液测得的吸光值。
2、羟基自由基清除能力的测定
在试管中加入1mL浓度分别为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL的样品溶液。再分别加入1mL 6mmol/L过氧化氢溶液和1mL 6mmol/L硫酸亚铁溶液，混匀之后静置10min。然后后加入1mL 6mmol/L水杨酸溶液，混匀，静置30min。在510nm处测定吸光值。用蒸馏水代替样品溶液作空白；用蒸馏水代替水杨酸溶液作对照；用Vc作阳性对照。按公式(2-3)计算羟基自由基清除率。
羟基自由基清除率＝(1-(A1-A2)/A0)×100％ (2-3)
式中，A表示用蒸馏水代替样品溶液作空白测得的吸光值；
A1表示样品溶液测得的吸光值；
A2表示用蒸馏水代替水杨酸溶液作对照测得的吸光值。
3、DPPH·自由基清除能力的测定
在试管中加入2mL浓度分别为0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL的样品溶液。再分别加入2mL 0.04mg/mL DPPH溶液，混匀，避光条件下静置30min。在波长517nm处测定吸光值。用蒸馏水代替样品溶液作空白；用无水乙醇代替DPPH溶液作对照；用Vc作阳性对照。按公式(3-4)计算DPPH·自由基清除率。
DPPH·自由基清除率＝(1-(A1-A2)/A0)×100％ (2-4)
式中，A0表示用蒸馏水代替样品溶液作空白测得的吸光值；
A1表示样品溶液测得的吸光值；
A2表示用无水乙醇代替DPPH溶液作对照测得的吸光值。
4、还原能力的测定
采用普鲁士蓝还原法，在试管中加入1mL浓度分别为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL的样品溶液。再分别加入1mL 1g/100mL铁氰化钾溶液，混匀，在50℃的恒温水浴锅中水浴20min，然后加入1mL 10％三氯乙酸和0.4mL 0.1g/100mL氯化铁溶液和2mL蒸馏水，混匀，静置5min。于波长700nm处测定吸光值。用Vc作阳性对照。
结果与分析：
一、芦丁标准曲线的绘制
根据标准曲线绘制方法进行实验，得到相关实验数据。利用Excel软件将实验数据绘制成标准曲线图并计算标准回归方程，如图1所示。由图可知，标准回归方程为：y＝12.168x+0.0138，R2＝0.9956。在实验过程中由于称取药品难度高，操作不当且没有进行多组实验，导致回归方程的精确度未能无限趋近于1。
二、单因素实验结果与分析
1、酶解温度对树莓干果黄酮提取率的影响
不同酶浓度与树莓黄酮提取率的关系见图2。由图可知，果胶酶在浓度1.0mg/mL～2.0mg/mL时，黄酮提取率呈上升趋势。因为果胶酶的加入，可以分解植物细胞中的果胶质，破坏其细胞组织结构，使有效成分充分浸提出来并溶于溶剂之中。果胶酶在浓度2.0mg/mL～4.0mg/mL时，黄酮提取率呈下降趋势。酶浓浓度在2.0mg/mL时，黄酮提取率达到最大为1.23mg/g。所以在PB实验中选择酶浓度1mg/mL作为实验低水平，选择3mg/mL作为实验高水平。
2、酶解温度对树莓干果黄酮提取率的影响
不同酶解温度与树莓黄酮提取率的关系见图3。由图可知，酶解温度在40℃～45℃时，黄酮提取率呈上升趋势。因为果胶酶有最佳酶解温度，此时酶活性最强，可以充分提取细胞中的有效成分。酶解温度在45℃～60℃时，黄酮提取率直线下降。因为温度过高使果胶酶变性失活，失去提取作用，降低黄酮得率。酶解温度在45℃时，黄酮提取率达到最大为1.06mg/g。所以在PB实验中选择酶解温度40℃作为实验低水平，选择50℃作为实验高水平。
3、液料比对树莓干果黄酮提取率的影响
不同液料比与树莓黄酮提取率的关系见图4。由图可知，随着液料比的增大，黄酮提取率也随之增大。因为使用一定量的乙醇作为溶剂可以增加溶质和溶液的浓度差，使有效成分更容易分离出来，但是过多的溶剂会影响有效成分的析出。所以使用适量的乙醇溶液作为提取剂有利于黄酮物质的溶出。当液料比在35:1时，黄酮提取率达到最大为1.06mg/g。所以在PB实验中选择液料比30:1作为实验低水平，选择40:1作为实验高水平。
4、乙醇体积分数对树莓干果黄酮提取率的影响
不同乙醇体积分数与树莓黄酮提取率的关系见图5。由图可知，乙醇体积分数在40％～70％时，黄酮提取率总体变化不大。而乙醇体积分数超过70％后，黄酮提取率直线下降。因为浓度过高的乙醇溶剂会分离出其他杂质，从而影响黄酮得率`。乙醇体积分数在50％时，黄酮提取率达到最大为1.30mg/g。所以在PB实验中选择乙醇体积分数40％作为实验低水平，选择60％作为实验高水平。
5、酶解时间对树莓干果黄酮提取率的影响
不同酶解时间与树莓黄酮提取率的关系见图6。由图可知，酶解时间在20min～40min时，黄酮提取率呈上升趋势。因为果胶酶的催化作用需要一定时间来进行，随着时间的增加，果胶酶可以溶出更多的有效成分，黄酮提取率也随之上升。酶解时间在40min～60min时，黄酮提取率有所下降。酶解时间为40min时，黄酮提取率达到最大为1.01mg/g。所以在PB实验中选择提取时间30min作为实验低水平，选择提取时间50min作为实验高水平。
6、提取功率对树莓干果黄酮提取率的影响
不同提取功率与树莓黄酮提取率的关系见图7。由图可知，提取功率在25W～50W时，黄酮提取率增大。因为随着闪式提取器功率的增加，搅拌棒的转速也随之增快。带有刀口的搅拌棒的高速旋转，可以有效的破坏细胞组织结构，使细胞内的有效成分溶出。提取功率在50W～125W时，黄酮提取率呈直线下降。提取功率为50W时，黄酮提取率达到最大为1.07mg/g。所以在PB实验中选择提取功率25W作为实验低水平，选择75W作为实验高水平。
7、提取时间对树莓干果黄酮提取率的影响
不同提取时间与树莓黄酮提取率的关系见图8。由图可知，提取时间在10S～20S时，黄酮提取率有明显的增幅。因为使用闪式提取器进行提取，提取时间越长，搅拌棒的高速搅拌状态维持越久，可以使更多黄酮物质溶出，提取效率越高。提取时间在20S～30S时，黄酮提取率有所降低。提取时间为20S时，黄酮提取率达到最大为1.18mg/g。所以在PB实验中选择提取时间15S作为实验低水平，选择25S作为实验高水平。
8、提取次数对树莓干果黄酮提取率的影响
不同提取次数与树莓黄酮提取率的关系见图9。由图可知，提取次数在1～3次时，黄酮提取率升高。因为使用闪式提取器进行提取，提取次数越多，越有利于黄酮物质的溶出，提取效率越高。提取次数在3～5次时，提取率明显下降。提取次数为3次时，黄酮提取率达到最大为1.23mg/g。所以在PB实验中选择提取次数2次作为实验低水平，选择4次作为实验高水平。
三、Plackett-Burman实验结果与分析
根据2.2.5实验设计，进行12组实验，得到相关实验数据，见表3-1。使用软件对表3-10的数据进行方差分析，并进行显著性实验，得到相关实验数据，见表3-2。
对表3-1和表3-2综合分析可得：模型系数R2为0.9776，调整系数R2为0.9177，表明该模型可以很好地解释91.77％的变量。液料比效应极显著，其P值为0.005，表明液料比的用量可以极大的影响黄酮的提取率。酶浓度、酶解温度和提取次数效应显著，其P值分别为0.035、0.011、0.021，表明液料比、提取次数、酶浓度和酶解温是影响黄酮提取率的主要因素。其中酶浓度对黄酮提取的影响为负效应。而酶解时间、提取功率、乙醇体积分数和提取时间对黄酮得率的影响不大，根据相关实验结果得到了这些因素的最适水平，即酶解时间40min、乙醇体积分数50％、提取功率50W、提取时间25S。
表3-1 Plackett-Burman实验设计及结果
Figure BDA0002558478340000131
表3-2Plackett-Burman实验变量方差
Figure BDA0002558478340000132
注：*表示差异显著(p＜0.05)，**表示差异极显著(p＜0.01)。
四、最陡爬坡实验结果与分析
根据2.2.6实验设计，进行5组实验，得到相关实验结果如表3-3所示。分析表3-3可知，在第4组实验条件下，黄酮提取率达到最大值1.48mg/g，因此选择第4组实验条件作为实验中心点进行响应面优化实验，即酶浓度1.5mg/mL、提取次数3次、酶解温度48℃、液料比38:1。
表3-3最陡爬坡试验设计及结果
Figure BDA0002558478340000141
五、响应面实验结果与分析
1、响应面实验结果
根据2.2.7实验设计，进行29组实验，得到相关实验结果如表3-4所示。对表3-4的数据进行计算并使用软件进行预测和处理，得到与4个主要影响因子有关的二次多项式方程，Y＝1.40+2.500E-003A+0.024B+0.013C+8.333E-003D+0.035AB-0.047AC+0.055BC+0.018BD-2.500E-003CD-0.11A2-0.12B2-0.066C2-0.064D2。
通过Design-Expert软件对该回归方程进行显著性及方差分析结果见表3-5。分析表3-5可知，此方程的模型P值＜0.0001极显著，失拟项P值0.1631＞0.05不显著，表明本实验测得的黄酮提取率与软件的预测值误差不大，可信程度高。模型的系数R2＝0.9403，信噪比为13.487，表明用该模型来进行预测与分析树莓黄酮的最佳提取工艺条件有较高的准确度。方程中的单因素项B显著，P值为0.0126。单因素项A、C、D均不显著，P值分别为0.7716、0.1368、0.3406。即酶解温度对黄酮提取影响较大，提取次数、液料比和酶浓度对黄酮提取影响较小。4个主要影响因子对黄酮得率的影响从大到小为B(酶解温度)、C(液料比)、D(提取次数)、A(酶浓度)。
表3-4响应面实验结果
Figure BDA0002558478340000142
Figure BDA0002558478340000151
表3-5回归方程进行显著性及方差分析
Figure BDA0002558478340000152
Figure BDA0002558478340000161
注：*表示差异显著(p＜0.05)，**表示差异极显著(p＜0.01)。
为继续研究4个主要影响因子和两两因子的交互作用对黄酮提取率的具体影响。根据响应面优化实验结果，使用Design-Expert软件做出每2个因素的交互作用对黄酮提取的影响的等高线图和响应曲面图，具体分别如图10和图11、图12和图13、图14和图15、图16和图17、图18和图19、图20和图21所示。
分析图10和图11可知，酶浓度与酶解温度交互作用所得的等高线图坡度变化不大，响应曲面图呈现的图形较为接近圆形。表明酶浓度与酶解温度的交互作用一般。
分析图12和图13可知，酶浓度与液料比交互作用所得的等高线图坡度变化十分明显，响应曲面图呈现的图形近乎为椭圆状。表明酶浓度与液料比的交互作用较为明显。
分析图14和图15可知，酶浓度与提取次数交互作用所得的等高线图坡度没有明显变化，响应曲面图呈现的图形近乎为圆状。表明酶浓度与提取次数的交互作用较小。
分析图16和图17可知，酶解温度与液料比交互作用所得的等高线图坡度变化明显，响应曲面图呈现的图形较为接近椭圆状。表明酶解温度与液料比的交互作用较大。
分析图18和图19可知，酶解温度与提取次数交互作用所得的等高线图坡度变化显著，响应曲面图呈现的图形呈椭圆状。表明酶解温度与提取次数的交互作用比较明显。
分析20和图21可知，液料比与提取次数交互作用所得的等高线图坡度几乎没有改变，响应曲面图呈现的图形呈圆状。表明酶浓度与提取次数的交互作用十分不显著。
所以综合可知对黄酮提取影响最大的是酶浓度与液料比的交互作用，对黄酮提取影响最小的是液料比与提取次数的交互作用。
2、最佳工艺条件的确定
通过使用软件进行预测，得到酶辅闪式提取树莓黄酮的最佳工艺条件：提取次数3次、酶浓度1.5mg/mL、液料比38:1、酶解温度48℃、提取时间25S、乙醇体积分数50％、酶解时间40min、提取功率50W，此时黄酮提取预测值为1.40mg/g。使用软件预测的最佳工艺条件进行验证实验，以确认该预测条件的可靠性。根据最佳工艺条件提取3次，将3次结果取平均值得黄酮提取率为1.40mg/g。此实验结果与预测值一致，表明此条件是酶辅闪式提取树莓黄酮的最佳工艺条件且有着较高的可信度。
六、树莓干果黄酮体外抗氧化活性结果与分析
1、ABTS+自由基清除能力结果与分析
不同质量浓度的黄酮提取液和Vc对ABTS+自由基清除能力结果，如图22所示。由图可知，黄酮提取液在浓度0.02mg/mL～0.10mg/mL时，对ABTS+自由基清除能力有明显提升，清除率随着浓度的增加而增加。黄酮提取液浓度为0.1mg/mL时，对ABTS+自由基的清除率为60.41％，此时Vc的清除率为96.78％。说明树莓黄酮对ABTS+自由基有一定的清除能力。树莓黄酮与Vc清除能力相比较弱。
2、羟基自由基清除能力结果与分析
不同质量浓度的黄酮提取液和Vc对羟基自由基清除能力结果，如图23所示。由图可知，黄酮提取液在浓度1.0mg/mL～2.5mg/mL时，对羟基自由基的清除率有明显增幅，并且在浓度2.0mg/mL～2.5mg/mL时对羟基自由基的清除能力达到一个很高的水平。黄酮提取液浓度为2.5mg/mL时，对羟基自由基的清除率为88.64％，此时Vc的清除率为94.68％。说明树莓黄酮清除羟基自由基能力较强。树莓黄酮与Vc清除能力相比有一定差距。
3、DPPH·自由基清除能力结果与分析
不同质量浓度的黄酮提取液和Vc对DPPH·自由基清除能力结果，如图24所示。由图可知，黄酮提取液在浓度0.02mg/mL～0.04mg/mL时，对DPPH·自由基清除能力有明显增幅。黄酮提取液在浓度0.08mg/mL～0.10mg/mL时，对DPPH·自由基清除能力增幅趋缓，总体维持一个较高的清除水平。黄酮提取液浓度为0.1mg/mL时，对DPPH·自由基的清除率为91.52％，此时Vc的清除率为93.68％。说明树莓黄酮清除DPPH·自由基能力很强。树莓黄酮和Vc对DPPH·自由基清除能力接近。
4、还原能力结果与分析
不同浓度的黄酮提取液和Vc还原能力结果，如图25所示。由图可知，黄酮提取液在浓度0.02mg/mL～0.06mg/mL时，黄酮还原能力不强且变化不大。黄酮提取液在浓度0.06mg/mL～0.10mg/mL时，黄酮还原能力有明显的增幅，但总体水平一般。黄酮提取液浓度为0.1mg/mL时，吸光值达到0.511，此时Vc的吸光值已经超过1。说明树莓黄酮在还原能力上表现一般，只具有一定的还原能力。树莓黄酮与Vc相比还原能力较弱且相差较大。
实现结论：使用酶辅闪式提取树莓干果中的黄酮，通过Plackett－Burman设计实验确定了酶浓度、酶解温度、液料比和提取次数是影响树莓黄酮得率的主要因素。再采用Box-Behnken响应面优化法得到了树莓黄酮的最佳提取工艺条件：酶浓度1.5mg/mL、提取时间25S、酶解温度48℃、液料比38:1、乙醇体积分数50％、酶解时间40min、提取功率50W、提取次数3次，树莓黄酮得率为1.40mg/g。说明使用酶辅闪式的提取方法对树莓黄酮的提取工艺有着较好的优化。抗氧化实验结果表明，随着黄酮提取液浓度增加，树莓黄酮的抗氧化能力也随之增大。黄酮提取液浓度为0.1mg/mL时，ABTS+自由基清除率为60.41％；黄酮提取液浓度为2.5mg/mL时，羟基自由基清除率为88.64％；黄酮提取液浓度为0.1mg/mL时，DPPH·自由基清除率为91.52％；当黄酮提取液浓度为0.1mg/mL时，还原能力吸光值为0.511。且说明树莓黄酮抗氧化能力强，有着较高的研究价值。

Claims (5)

1.一种提取树莓干果黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将经过人工去蒂的树莓干果，放入粉碎机中粉碎，重复粉碎多次后将粉末放入密封袋保存，得到树莓干果粉末样品；
S2:准确称取3g树莓干果粉末样品，放入烧杯中，在38：1液料比的条件下加入1.5mg/mL的果胶酶，再将溶液置入48℃的恒温水浴锅中静置40min；
S3: 将溶液取出，放入闪式提取器中，在提取时间25S、提取功率50W的条件下进行3次提取处理；
S4:提取完毕后再将溶液均分在两个离心试管中，配平后在转速3500r、离心时间15min的条件下用离心机进行离心处理，将离心后的上清液进行抽滤，把所得滤液转移至烧杯中，用50%体积分数的乙醇溶液定容至100mL容量瓶中，得到提取液。
2.根据权利要求1所述的一种提取树莓干果黄酮的方法，其特征在于，在步骤一中，所述粉碎机为FZ102微型粉碎机。
3.根据权利要求1或2所述的一种提取树莓干果黄酮的方法，其特征在于，在步骤二中，所述恒温水浴锅为HH-2型数显恒温水浴锅。
4.根据权利要求3所述的一种提取树莓干果黄酮的方法，其特征在于，在步骤三中，所述闪式提取器为ZHBE-50T闪式提取器。
5.根据权利要求4所述的一种提取树莓干果黄酮的方法，其特征在于，在步骤四中，所述离心机为TDL-80-2B离心机。
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