CN103585497A

CN103585497A - 一种竹叶中多酚的提取和检测方法

Info

Publication number: CN103585497A
Application number: CN201310504150.1A
Authority: CN
Inventors: 刘长国
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2013-10-23
Filing date: 2013-10-23
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2033-10-23
Also published as: CN103585497B

Abstract

本发明公开了一种竹叶中多酚的提取和检测方法，步骤是：（1）备料：选取新鲜竹叶，液氮冷冻后于-70℃保存，备用；（2）超声波辅助丙酮低温提取竹叶中多酚；（3）Folin-ciocalteu法检测：检测体系为：检测体系为：多酚提取液0.04ml、水1.96ml、稀释2～6倍的Folin-ciocalteu显色剂1ml、5%～25%Na₂CO₃1ml；反应温度：水浴25～35℃，反应时间：0.5～4h，检测波长：750nm～775nm。本发明优化并建立了检测新鲜竹叶中多酚含量的体系，以及提取竹叶中多酚的体系，提取效率高，检测快速方便，能够为竹叶的开发利用提供理论依据。

Description

一种竹叶中多酚的提取和检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术，具体地说是涉及一种竹叶中多酚的提取和检测方法。

背景技术

多酚是植物中具有促进人体健康功效的化合物；存在于一些常见的植物性食物中，如可可豆，茶，大豆，红酒，蔬菜和水果。多酚类物质具有很强的抗氧化作用。氧化损伤是导致许多慢性病，如心血管病，癌症和衰老的重要原因。多酚的抗氧化功能可以对这些慢性病起到预防作用。比如巧克力中的多酚是很强的抗氧化剂，它可以抑制低密度脂蛋白（LDL）胆固醇氧化。多酚除了具有抗氧化作用外，据2008年1月FEDERATION of AMERICAN SOCIETIESfor EXPERIMENTAL BIOLOGY(FASEB)杂志报道，以色列研究人员首次发现在进食高脂食物的同时摄入多酚可以减轻高脂食物对人体健康的威胁，这说明多酚可以有效预防高脂食物在人体代谢过程中所产生的衍生物，如自由基的危害性。

尽管多酚广泛存在于植物性食物中，但是它在不同植物中的活性成分物质及其结构、含量有很大差异。而且，植物中多酚的含量受诸多因素影响，如品种、加工过程及储存条件等。

竹叶是中医一味传统的清热解毒药，被中华人民共和国卫生部批准列入"药-食两用天然植物",对人类"第一杀手"心脑血管疾病的防治具有一定的作用；国珍竹康宁就是以竹叶为主要原料。竹叶提取物具有良好的抗自由基氧化能力；其抗衰老，抗疲劳和免疫调节作用与松花粉相当；降血脂和血胆固醇作用与银杏叶提取物相近；抗菌，消炎和抗病毒作用与茶多酚相似，可有效保护人体健康。现代医学研究表明：竹叶多酚除了和其它植物多酚，如茶多酚、银杏多酚一样具有清除体内自由基、消除疲劳、调节机体免疫力、抗衰老、保护肝脏、调节血脂、防治心血管病等功效外；竹叶多酚还能抑菌消炎、促进表皮细胞增殖、修复皮肤损伤、抑制黑色素合成、消斑美白，具有类似SOD的活性，是一种优良的天然医药保健品、卫生防护品及食品添加剂。目前对竹叶多酚研究的报道较少，对此，我们对竹叶多酚的提取和检测方法进行了详细的研究，为竹叶的开发利用提供理论依据。

目前竹叶多酚的提取一般采用有机溶剂法进行提取。通常单纯利用有机溶剂浸提多酚的效率比较低；利用微波炉辅助有机溶剂浸提可以提高多酚的提取效率，但是微波炉的功率较难把握，功率太低达不到加热提取的效果，功率较高则物料的温度会瞬间升高，容易导致茶多酚氧化损失，降低提取率。此外，超声波也被引入多酚的提取，但通常都在高温下进行，由于多酚的热稳定性不好，容易导致多酚发生氧化损失，部分活性成分遭受破坏。

此外，目前竹叶中多酚含量的检测一般参考茶叶中多酚含量的国标分析方法（GB/T8313,酒石酸铁比色法）。但是每种植物的多酚中所含的活性物质类型、及其化学结构和含量都有较大差异，如果直接参考茶叶多酚的测量方法用于竹叶可能产生较大误差。因此本专利针对竹叶多酚系统地研究相应的测量方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，提供一种竹叶中多酚的提取和检测方法，该方法提取效率高，检测方便。本发明的目的在于：优化并建立检测新鲜竹叶中多酚含量的体系，以及提取竹叶中多酚的体系。

相比较于现有的竹叶多酚提取方法，本发明中竹叶的保存、处理及提取过程均在低温进行，可以有效保护多酚中活性物质；并且直接采用丙酮作为提取溶剂可有效提高多酚提取效率；之外，超声波的利用可以进一步提高提取效率。

为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案如下：

一种竹叶中多酚的提取和检测方法，该方法的步骤为：

（1）备料：选取新鲜竹叶，液氮冷冻后于-70℃保存，备用；

（2）超声波辅助丙酮低温提取竹叶中多酚：提取时，取出一定量竹叶置于研钵中，加入液氮研碎，选取丙酮作提取溶剂，向竹叶中加入丙酮，收集到离心管中，于10℃以下低温超声提取15～90min，离心取上清，即得竹叶多酚提取液。

（3）竹叶中多酚的检测：

Folin-ciocalteu法检测：新鲜竹叶中多酚检测体系为：多酚提取液0.04mL、水1.96mL、稀释2～6倍的Folin-ciocalteu显色剂1mL、5%～25%Na₂CO₃1mL；

检测条件：反应温度：水浴25～35℃，反应时间：0.5～4h，检测波长：750nm～775nm。

进一步，步骤（2）中，选取30%丙酮作提取溶剂，按1g竹叶样品加入5～25mL的比例取用30%丙酮，收集到50mL离心管中，于10℃以下低温超声提取15～90min，离心取上清，即得竹叶多酚提取液。

进一步，按1g竹叶样品优选加入20mL30%丙酮进行提取。

进一步，超声提取频率为40kHz，超声功率150W，提取时间为75min。

进一步，步骤（3）中，Folin-ciocalteu法检测：新鲜竹叶中多酚检测体系为：多酚提取液0.04mL、水1.96mL、稀释4倍的Folin-ciocalteu显色剂1mL、10%Na₂CO₃1mL；

检测条件：反应温度：水浴30℃，反应时间：2.5h，检测波长：755nm。

本发明提供的竹叶中多酚的提取和检测方法，该方法采用超声波辅助有机溶剂低温提取竹叶中多酚，并以丙酮作为提取溶剂，提取效果好，所提取的多酚抗氧化活性更强；本发明考虑到植物多酚中有些活性成分会随着温度的升高而氧化失活，在竹叶样品保存、粉碎处理以及多酚提取等过程中均采取低温处理，从而充分保护了多酚中的活性成分；本发明采用Folin-Ciocalteu法检测竹叶中多酚含量，并给出了优化的检测体系及检测条件，具有设备要求低、操作简单、效率高、精密度高、稳定性和可重复性好的优点；采用本发明的多酚测定方法可以直接测量有机溶剂中提取的多酚含量，不需要蒸馏去除有机溶剂，从而可用于快速检测大规模的样品。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供的竹叶中多酚的提取和检测方法，该竹叶中多酚的提取和检测方法按照如下步骤进行：

该方法的步骤为：

（1）备料：选取新鲜竹叶，液氮冷冻后于-70℃保存，备用；

（3）竹叶中多酚的检测：

作为本发明实施例的一优化方案，步骤（2）中，选取30%丙酮作提取溶剂，按1g竹叶样品加入5～25mL的比例取用30%丙酮，收集到50mL离心管中，于10℃以下低温超声提取15～90min，离心取上清，即得竹叶多酚提取液。

作为本发明实施例的一优化方案，按1g竹叶样品优选加入20mL30%丙酮进行提取。

作为本发明实施例的一优化方案，超声提取频率为40kHz，超声功率150W，提取时间为75min。

作为本发明实施例的一优化方案，步骤（3）中，Folin-ciocalteu法检测：新鲜竹叶中多酚检测体系为：多酚提取液0.04mL、水1.96mL、稀释4倍的Folin-ciocalteu显色剂1mL、10%Na₂CO₃1mL；

作为本发明实施例的一优化方案，反应温度：水浴30℃，反应时间：2.5h，检测波长：755nm。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

一、新鲜竹叶中多酚检测体系的优化与建立

实施例1：

多酚检测体系的构成包括：多酚提取液0.04mL、水1.96mL、Folin-ciocalteu显色剂1mL、Na₂CO₃1mL。检测条件包括反应温度、反应时间、检测波长。

Folin-ciocalteu显色剂稀释倍数、Na₂CO₃浓度、检测波长的优化：

采集茶秆竹、紫竹和金镶玉竹3种新鲜竹叶，剪碎合并，液氮条件下研成末，以丙酮为溶剂提取其中的多酚作为检测材料。Folin-ciocalteu显色剂稀释倍数设置为2倍、3倍、4倍、5倍和6倍；Na₂CO₃浓度设置为10%、15%、20%和25%。

将各个反应样品在25℃水浴中反应1h后，在400-800nm波长范围内扫描检测各个样品的吸光值，既确定适宜的检测波长，又鉴定合适的Folin-ciocalteu显色剂稀释倍数、和Na₂CO₃浓度（吸光值越高意味着检测效果越灵敏）。

经过扫描发现，竹叶多酚提取物在波长750-770nm范围内为扫描峰顶，部分检测波长下的吸光值见表1-5。

表1Folin-ciocalteu显色剂稀释2倍时各个反应样品的吸光值

表2Folin-ciocalteu显色剂稀释3倍时各个反应样品的吸光值

表3Folin-ciocalteu显色剂稀释4倍时各个反应样品的吸光值

表4Folin-ciocalteu显色剂稀释5倍时各个反应样品的吸光值

表5Folin-ciocalteu显色剂稀释6倍时各个反应样品的吸光值

总体而言，表1-5显示Folin-ciocalteu显色剂稀释4倍时检测灵敏度更高，在此情况下，Na₂CO₃浓度设置为10%时效果更理想，波长以755nm为宜。

鉴于上述实验中Na₂CO₃浓度为10%更理想，保险起见，我们进一步对4XFolin-ciocalteu显色剂增设了5%、7.5%的Na₂CO₃浓度，以检测它们的效果。见表6。结果表明还是10%的Na₂CO₃更理想。

表65%、7.5%和10%Na2CO3时各个反应样品的吸光值

总体而言，通过上述一系列研究，Folin-ciocalteu显色剂稀释4倍，10%Na₂CO₃，检测波长为755nm，检测效果更理想。

进一步优化优化反应温度和时间：

实施例2：

采集茶秆竹、紫竹和金镶玉竹3种新鲜竹叶，剪碎合并，以丙酮为溶剂提取其中的多酚作为检测材料。在前期预实验的基础上，反应温度设置为25℃、30℃和35℃。反应时间设置为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h。反应体系中Folin-ciocalteu显色剂稀释4倍，以10%Na₂CO₃为碱性组分。各个反应组合在相应的温度反应相应的时间后，在紫外分光光度计中同时测量755nm的吸光值。结果见表7。

表7样品在不同反应温度及反应时间的吸光值

	0.5h	1h	1.5h	2h	2.5h	3h	3.5h	4h
									25℃	0.8388	0.9481	0.9569	0.9957	0.9533	0.9861	0.9647	0.962
30℃	0.9338	0.981	0.9833	0.9878	0.9939	1.002	0.9955	0.9851
									35℃	0.8919	0.954	0.9508	0.9758	0.9597	0.9663	0.9428	0.9823

结果表明，反应条件以30℃水浴反应3h最理想，当然，为了节约时间，反应2.5小时也基本达到理想效果。

结论：建立的新鲜竹叶中多酚最优检测体系为：多酚提取液0.04mL、水1.96mL、4XFolin-ciocalteu显色剂1mL、10%Na₂CO₃1mL。检测条件：反应温度为30℃水浴、反应时间为2.5小时、检测波长755nm。

二、新鲜竹叶中多酚提取体系的优化与建立

新鲜竹叶中多酚提取体系的优化包括提取溶剂的选择、溶剂的使用量（使用比例）、提取时间的优化。

1、丙酮浓度的优化

实施例3:

本发明人根据多年研究并经多次实验，发现在同等条件下，用蒸馏水、各种相同浓度的丙酮和乙醇提取竹叶中的多酚，结果在相同的检测体系中丙酮提取液的吸光值往往高于蒸馏水、乙醇的提取液，说明丙酮的提取效果优于蒸馏水、以及乙醇。因此决定以丙酮作为提取竹叶多酚的溶剂。接下来对适宜的丙酮浓度进行优化。

丙酮浓度设置为0%、15%、30%、45%、60%、75%、90%。

采集茶秆竹、紫竹和金镶玉竹3种新鲜竹叶，剪碎合并，在液氮条件下研碎成末，将各种浓度的提取溶剂按竹叶：溶剂=1：10(g:mL)的比例加入溶剂，超声波提取45min，12000rpm离心取上清。

参考已建立的检测体系，检测各种浓度溶剂提取多酚的效果。结果见表8。

表8各种浓度溶剂提取多酚的755nm吸光值

丙酮浓度	0%	15%	30%	45%	60%	75%	90%
								λ755	0.4897	0.9924	1.071	0.9924	1.0698	1.0629	0.7705

实验结果表明15%、30%、45%、60%、75%的提取效果相当，而30%丙酮提取效果略微更理想，因此确立用30%丙酮作为竹叶提取溶剂。

多酚提取时间的优化

实施例4：

为了保护多酚的质量，我们选用超声波仪以提取多酚，同时对提取的时间进行优化。

将茶秆竹、紫竹和金镶玉竹3种新鲜竹叶在液氮条件下研碎成末，将30%丙酮按竹叶：溶剂=1：10(g:mL)的比例加入溶剂。超声提取时间设置为5min、30min、45min、60min、75min、90min。超声波提取结束后，12000rpm离心取上清。

参考已经建立的检测体系，检测30%丙酮在各种时间提取多酚的效果。结果见表9。

表9各种超声时间提取多酚的755nm吸光值

时间	15min	30min	45min	60min	75min	90min
							λ755	0.8305	0.9129	0.9089	0.951	0.9626	0.9388

表9结果说明在当前浸提条件下，超声波提取75min效果更理想，其次为60min。

丙酮使用比例的优化

实施例5：

将茶秆竹、紫竹和金镶玉竹3种新鲜竹叶在液氮条件下研碎成末，往竹叶粉末中加入30%丙酮，竹叶：溶剂的比例(g:mL)设置为1：5，1：10，1：15，1：20，1：25。10℃以下低温超声提取15min，12000rpm离心取上清。

参考已经建立的检测体系，检测各种浓度溶剂提取多酚的效果。由于相同重量竹叶中加入不同体积的提取溶剂，将导致体积少者多酚浓度更高，为了校正单位溶剂中多酚含量，检测体系中上述5种处理的多酚提取液的用量依次为20uL、40uL、60uL、80uL、100μL，然后分别用蒸馏水补齐为100uL；体系中其它成分为4XFolin-ciocalteu显色剂1mL、10%Na2CO3 1mL、之外用1.9mL双蒸水补充使总体积为4mL。检测条件：反应温度为30℃水浴、反应时间为2.5小时、检测波长755nm。检测结果见表10。

表10各种比例溶剂提取多酚的755nm吸光值

竹叶丙酮比例	1：5	1：10	1：15	1：20	1：25
						λ755	0.9715	1.0515	1.0956	1.155	0.9831

实验结果表明丙酮使用比例为1：20（g:mL）提取效果更理想。

结论：新鲜竹叶中多酚的最优提取工艺（体系）为：液氮条件下将竹叶研碎成末，30%丙酮按1：20（g:mL）的料液比例加入到竹叶中，10℃以下低温超声提取75min，12000rpm离心取上清，即得竹叶多酚提取液。对所得竹叶多酚提取液旋转蒸馏去除丙酮，然后冷冻干燥即可获得冻干品。

三、竹叶中多酚提取工艺应用效果

应用上述已经建立的竹叶多酚提取体系和检测体系，以没食子酸为标样制作标准曲线，检测了18种竹叶的多酚含量。主要过程为：将冻存的竹叶在液氮条件下研成细末，称取1g左右的竹叶末（每个品种设置3个重复），按竹叶和30%丙酮1：20（g:mL）的料液比加入相应体积的30%丙酮，10℃低温超声提取75min，12000rpm离心取上清，即竹叶的多酚粗提取液。之后按照以下体系检测每个提取液样品中的多酚含量：多酚提取液0.04mL（空白对照用30%丙酮代替提取液）、水1.96mL、4XFolin-ciocalteu显色剂1mL、10%Na₂CO₃1mL。检测条件包括反应温度为水浴30℃、反应时间2小时、检测波长755nm。应用结果见表11。

表11各种新鲜竹叶中多酚的含量（mg/g）

竹叶品种	淡竹	紫竹	浙江淡竹	石竹	京竹	孝顺竹
							多酚含量	13.742	13.482	12.389	11.388	11.12	10.35
竹叶品种	金镶玉	木竹	篌竹	毛竹	黄秆京竹	安吉金竹
							多酚含量	10.34	10.13	10.02	9.93	9.77	9.66
竹叶品种	黄甜竹	长叶苦竹	白夹竹	茶杆竹	大明竹	广东箬竹
							多酚含量	6.57	6.52	6.49	6.43	5.23	4.88

注：新鲜竹叶中干物质含量约为50%，即1g鲜竹叶含干物质约500mg。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种竹叶中多酚的提取和检测方法，其特征在于：该方法的步骤为：

（1）备料：选取新鲜竹叶，液氮冷冻后于-70℃保存，备用；

（3）竹叶中多酚的检测：

2.根据权利要求1所述的一种竹叶中多酚的提取和检测方法，其特征在于：步骤（2）中，选取30%丙酮作提取溶剂，按1g竹叶样品加入5～25mL的比例取用30%丙酮，收集到50mL离心管中，于10℃以下低温超声提取15～90min，离心取上清，即得竹笋多酚提取液。

3.根据权利要求2所述的一种竹叶中多酚的提取和检测方法，其特征在于：按1g竹叶样品优先加入20mL30%丙酮进行提取。

4.根据权利要求2所述的一种竹叶中多酚的提取和检测方法，其特征在于：超声提取频率为40kHz，超声功率150W，提取时间为75min。

5.根据权利要求1所述的一种竹叶中多酚的提取和检测方法，其特征在于：步骤（3）中，Folin-ciocalteu法检测：新鲜竹叶中多酚检测体系为：多酚提取液0.04mL、水1.96mL、稀释4倍的Folin-ciocalteu显色剂1mL、10%Na₂CO₃1mL；