CN114916672A - 一种柑橘类黄酮的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于有机物提取领域，特别是涉及一种柑橘类黄酮的提取方法。本发明提供的提取方法，将打碎后的新鲜柑橘果皮与乙醇溶液混合后闪式提取得到提取物；离心所述提取物得到上清液，浓缩上清液获得粗提物；纯化所述粗提物即得到柑橘类黄酮。本发明提供的提取方法具有绿色高效，提取效率高，提取成本低，提取时间短，提取工艺简单且稳定可靠，提取能耗低的优点，柑橘类黄酮提取率为2.25±0.12gRutin/100gWW。
Description
技术领域
本发明属于有机物提取领域，特别是涉及一种柑橘类黄酮的提取方法。
背景技术
柑橘(Citrus reticulata Blanco.)，芸香科柑橘属，是热带、亚热带常绿果树。研究表明柑橘具有多种健康功效，如抗氧化、抗炎、抗癌、降血压、降胆固醇、改善消化和保护视力等功效。事实上，酸甜可口的柑橘果肉只是人们有效利用其营养的一部分，占柑橘总量的20％～40％的柑橘果皮也具有丰富的营养健康成分。柑橘皮含有多种重要的功能活性成分，包括不溶性膳食纤维(占干皮的60％)、果胶(占干皮30％)、香精油(占干皮的3％)、类柠檬苦素(占种子的0.5％～1.0％)、类黄酮(占干皮的0.8％)、多甲氧基黄酮(占鲜皮的0.54％)、辛弗林(占干皮的0.1％～2％)、酚酸类、类胡萝卜素等。
柑橘类黄酮是一系列具有显著生物活性的黄酮类化合物所组成的混合物，不但具有独特的芳香性、良好的水溶性和显著的药理作用，而且是一类新发现的营养素。临床研究证实，黄酮类物质既是营养因子又是重要的药理因子，具有显著的抗氧化、抗癌、抗肿瘤、抗炎、抗菌和抗病毒活性。近年来国内外有关柑橘类黄酮的关注和报道日渐增多，目前市场上已有大量以天然黄酮类化合物作为膳食补充剂制成的各种保健品和食品，柑橘类黄酮作为食品添加剂具有广阔的发展前景。
在实际应用中，常见柑橘类黄酮的提取方法如下：微波辅助提取法、超声波辅助提取法、加压辅助提取法、高压均质提取法、酶法和低共熔溶剂萃取法，但是现有的从柑橘中提取黄酮的方法不同程度上均存在成本高、耗时低效、产率不理想的缺陷。此外，传统方法大多需要将果皮进行繁琐的预处理步骤，如冻干、打粉、过筛等。因此，提供一种简单便捷、快速高效、绿色健康的制备柑橘类黄酮的方法成为柑橘类黄酮产业化发展亟待解决的首要问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种柑橘类黄酮的提取方法。本发明提供的提取方法能够简单便捷、快速高效、绿色健康的制备柑橘类黄酮，具有极高的市场化前景。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种柑橘类黄酮的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：
(1)将柑橘果皮与乙醇溶液混合后闪式提取得到提取物；
(2)离心所述提取物得到上清液，浓缩上清液获得粗提物；
(3)纯化所述粗提物得到柑橘类黄酮。
优选的，所述步骤(1)中柑橘果皮与乙醇溶液的固液比为1g:(3～10)mL，进一步优选为1:(5～8)，最优选为1:8。
优选的，所述步骤(1)中乙醇溶液的体积浓度为40％～80％，进一步优选为60％～80％，最优选为69.00％。
优选的，所述步骤(1)中闪式提取的转速为2000～10000r/min，进一步优选为4000～8000r/min，最优选为6928～6930r/min。
优选的，所述步骤(1)中闪式提取的时间为1～5min，进一步优选为2～4min，最优选为3.18～3.20min。
优选的，所述步骤步骤(1)中所用的柑橘果皮为新鲜的柑橘果皮。
优选的，所述步骤(3)中纯化的方法包括大孔吸附树脂法。
在本发明中，所述大孔吸附树脂法优选包括以下步骤：
(a)向吸附柱内依次加入无水乙醇和树脂；无水乙醇浸泡树脂24h后，使用2BV的无水乙醇以2BV/h的流速通过树脂层，待流出液加水不呈白色浑浊时停止，再使用水以2BV/h的流速洗无水乙醇；
(b)使用2BV的体积浓度为5％的盐酸溶液，以5BV/h的流速通过树脂层，并浸泡4小时，浸泡结束后用水以5BV/h的流速洗至出水的pH至中性；
(c)使用2BV的质量浓度为2％氢氧化钠溶液，以5BV/h的流速通过树脂层，并浸泡4小时，浸泡结束后用水以5BV/h的流速洗至出水的pH至中性；
(d)向吸附柱内加入上述提取获得的粗提物，使用浓度为60％的乙醇以1BV/h的流速进行洗脱，洗脱液用量为1.8BV。
本发明以剪碎的新鲜成熟柑橘果皮为原料，使并以比色法计算柑橘类黄酮的提取率为参考指标，通过单因素多水平实验结合Box-Behnken中心组合设计-响应面法优化了闪式提取法提取柑橘类黄酮的最佳提取工艺条件，其中包括了提取时的乙醇浓度、提取时间和提取转速，最终确定乙醇浓度69％、提取时间3.2min、提取转速6930r/min为闪式提取的最佳工艺参数，在此条件下进行三次验证试验，测得柑橘类黄酮提取率为2.25±0.12gRutin/100gWW。
与现有技术相比，本发明主要具有如下的有益效果：
(1)本发明采用闪式提取法从新鲜柑橘果皮中提取黄酮，该方法无需传统方法中对果皮繁琐的预处理步骤，具有绿色高效，提取效率高，提取成本低，提取时间短，提取工艺简单且稳定可靠，提取能耗低的优点，本发明方法的推广和应用将对柑橘类黄酮产业化发展起到重要的推动作用。
(2)本发明所提供的闪式提取法提取柑橘类黄酮提取物工艺条件的响应面优化方法将为闪式提取法在柑橘类黄酮实际生产中的应用提供可靠的参考，为柑橘类黄酮作为功能性食品的研发提供技术支撑。
附图说明
图1为实施例中涉及使用的KBE-I5智能型闪式提取仪特制容器；
图2为不同乙醇浓度对柑橘类黄酮提取率的影响图；
图3为不同提取时间对柑橘类黄酮提取率的影响图；
图4为不同转速对柑橘类黄酮提取率的影响图；
图5为乙醇浓度和提取时间对柑橘类黄酮提取率的响应面三维图和等高线图；
图6为乙醇浓度和转速对柑橘类黄酮提取率的响应面三维图和等高线图；
图7为提取时间和转速对柑橘类黄酮提取率的响应面三维图和等高线图；
图8为柑橘黄酮标准品LC-MS色谱图；
图9为柑橘果皮类黄酮提取物LC-MS色谱图。
具体实施方式
下文中涉及使用的试剂或器械未注明具体技术或条件者，则按照常规实验条件进行，未明确说明有试剂公司说明书的，则按照说明书所建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
柑橘类黄酮的提取、纯化和鉴定
(1)取新鲜柑橘果皮，用MJ-WBL2521H榨汁机进行打碎，随后装入密封袋中，置于-20℃保存备用。
(2)准确称量50.0g柑橘碎果皮，置于特制容器中(该容器具有密封性好，底座稳固的特点，如图1所示)，加入400mL 70％乙醇(1：8，w/v)，使用KBE-I5智能型闪式提取仪在6000r/min的转速下提取3min。样品配平后通过X3R型高速冷冻离心机在4000g下离心10min，弃去沉淀保留上清液，将上清液使用旋转蒸发仪在50℃下旋蒸，浓缩至原体积的1/3，得到粗提物。
(3)将步骤(2)中得到的粗提物采用AB-8大孔吸附树脂进行进一步的快速纯化；
对AB-8大孔吸附树脂进行预处理：①先于吸附柱内加入相当于装填树脂体积0.5倍的无水乙醇，然后将树脂投入柱中，并浸泡24小时。用2BV无水乙醇，以2BV/h的流速通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色浑浊止。并以水以同样流速洗净无水乙醇。②用2BV的5％HCL溶液，以5BV/h的流速通过树脂层，并浸泡4小时，而后用水以同样流速洗至出水pH＝7。③用2BV的2％NaOH溶液，以5BV/h的流速通过树脂层，并浸泡4小时，而后用水以同样流速洗至出水pH＝7；
预处理结束后，向吸附柱内加入步骤(2)中得到的粗提物，并用60％的乙醇以1BV/h的流速进行洗脱，洗脱液用量为1.8BV；
收集洗脱液并用旋转蒸发仪在50℃下旋蒸至无乙醇味，将得到的样品通过冷冻干燥获得最终的产物——柑橘类黄酮；冷冻干燥时间为72h，干燥结束后立即收集样品用比色法进行提取率计算，以每100g柑橘果皮湿重中所含芦丁的当量计(g Rutin/100gWW)。
提取率的测定方法如下：
以芦丁为标准品，首先配置500μg/mL的芦丁原液(芦丁标准品1mg与2mL 80％甲醇溶液混匀)。接着，将芦丁原液稀释为100、200、300、400及500μg/mL。准确量取100μL不同浓度芦丁标准液于EP管之中，加入30μL 5％NaNO2，摇匀。6min后加入30μL 10％的Al(NO3)3，摇匀。6min后加入4％NaOH 400μL，混匀反应25min。于510nm处测定吸光度，设置两组平行。最终得到芦丁的标准曲线为：
Y＝2.4687x-0.0249
其中，Y为吸光值，x为芦丁标准液的浓度。
经过计算，实施例1的柑橘类黄酮的提取率为2.32g Rutin/100gWW。
(4)将步骤(3)中得到的纯化后的柑橘类黄酮提取物采用LC-MS进行鉴定，具体方法为：
柑橘类黄酮提取物的配制：准确称取类黄酮提取物5.00mg于50.00mL烧杯中，用色谱纯甲醇溶解并定容，配制成0.25mg/mL，－80℃保存备用。
标准品的配制：分别准确称取标准品(8-异戊烯基柚皮素、大波斯菊苷、野漆树苷、香蜂草苷、橙皮素、黄腐醇、异甜橙黄酮、枸橘苷、橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、柚皮素、甜橙黄酮、橘皮素、新橙皮苷、柚皮苷、槲皮素)各1.00mg，分别配制成0.25mg/mL的母液标准溶液。其中，橙皮苷采用二甲基亚砜溶解，其余标准品采用色谱纯甲醇溶解，-80℃保存备用。柑橘黄酮标准品LC-MS色谱图如图8所示。
柑橘类黄酮测定色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(4.6mm×250mm，5.0μm)；
柱温30℃；进样量10.0μL；
流动相为0.1％磷酸溶液(A)和乙腈(B)；
洗脱梯度：0～3min，20％～30％B；
3～10min，30％～40％B；
10～17min，40％～50％B；
17～19min，50％～60％A；
19～21min，60％～70％B；
21～25min，70％～80％B；
25～30min，80％～90％B；
30～35min，90％B。
流速为0.5mL/min；
在284nm(8-异戊烯基柚皮素、香蜂草苷、橙皮素、枸橘苷、橙皮苷、芸香柚皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、柚皮素，最终浓度为0.025mg/mL)、336nm(川陈皮素、甜橙黄酮、橘皮素、异甜橙黄酮、大波斯菊苷、野漆树苷，最终浓度为0.025mg/mL)和370nm(黄腐醇和槲皮素，最终浓度为0.025mg/mL)的波长下监测。柑橘果皮类黄酮提取物LC-MS色谱图如图9所示。
通过LC-MS分析，该纯化后的柑橘类黄酮提取物主要组成组分为：芸香柚皮苷(10.949min)、橙皮苷(11.497min)、香蜂草苷(14.883min)、甜橙黄酮(22.058min)、川陈皮素(24.655min)、8-异戊烯基柚皮素(26.778min)。经过计算，物质的量之比为：芸香柚皮苷：橙皮苷：香蜂草苷：甜橙黄酮：川陈皮素：8-异戊烯基柚皮素＝42.76：74.35：4.92：9.41：7.53：1.00。
实施例2
柑橘类黄酮的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(1)中乙醇的浓度为60％，提取时间为3min，闪式提取的转速为6000r/min；其余均与实施例1相同。
经过计算，本实施例的柑橘类黄酮的提取率为1.87g Rutin/100gWW。
实施例3
柑橘类黄酮的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(1)中乙醇的浓度为80％，提取时间为3min，闪式提取的转速为6000r/min；其余均与实施例1相同。
经过计算，本实施例的柑橘类黄酮的提取率为1.77g Rutin/100gWW。
实施例4
柑橘类黄酮的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(1)中乙醇的浓度为70％，提取时间为5min，闪式提取的转速为6000r/min；其余均与实施例1相同。
经过计算，本实施例的柑橘类黄酮的提取率为2.12g Rutin/100gWW。
实施例5
柑橘类黄酮的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(1)中乙醇的浓度为70％，提取时间为2min，闪式提取的转速为6000r/min；其余均与实施例1相同。
经过计算，本实施例的柑橘类黄酮的提取率为1.96g Rutin/100gWW。
实施例6
柑橘类黄酮的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(1)中乙醇的浓度为70％，提取时间为3min，闪式提取的转速为8000r/min；其余均与实施例1相同。
经过计算，本实施例的柑橘类黄酮的提取率为2.17g Rutin/100gWW。
实施例7
柑橘类黄酮的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(1)中乙醇的浓度为70％，提取时间为3min，闪式提取的转速为2000r/min；其余均与实施例1相同。
经过计算，本实施例的柑橘类黄酮的提取率为1.82g Rutin/100gWW。
对比实施例
柑橘类黄酮的传统水提法
与实施例1的区别在于：使用水浴法代替低共熔溶剂。将50.0g打碎的柑橘果皮置于500mL烧杯中，加入400mL 70％的乙醇，摇匀；随后，使用恒温水浴锅(HH-4，邦西仪器科技有限公司)对柑橘类黄酮进行水浴加热提取，设置提取时间为2h，提取温度为50℃；提取次数为两次；其余均与实施例1相同。
经过计算，本对比实施例的柑橘类黄酮的提取率为1.07g Rutin/100gWW。
试验例1
柑橘类黄酮的闪式提取工艺条件的优化试验
1.单因素多水平实验
根据实施例1的制备柑橘类黄酮的闪式提取法，筛选出3个影响柑橘类黄酮提取率的因素，即：提取时的乙醇浓度、提取时间、提取转速；以柑橘类黄酮提取率为参考指标，进行单因素多水平实验。
1.1乙醇浓度的单因素实验
选取5个水平进行乙醇浓度的单因素实验：固定提取时间为3min，闪式提取的转速为6000r/min，测量在乙醇浓度(％)分别为40％、50％、60％、70％及80％时柑橘类黄酮的提取率。
乙醇浓度对柑橘类黄酮提取率的影响如图2所示，从试验结果可以看出，当乙醇浓度为60％时，柑橘类黄酮的提取率仅为1.87g Rutin/100g WW左右，当乙醇浓度为70％时，柑橘类黄酮的提取率达到了2.03g Rutin/100g WW左右，随着乙醇浓度的增加，柑橘类黄酮的提取率又呈现明显降低趋势，故最佳乙醇浓度为70％。
1.2提取时间的单因素实验
选取5个水平进行提取时间的单因素实验：固定乙醇浓度为70％，闪式提取的转速为6000r/min，测量在提取时间分别为1、2、3、4及5min时柑橘类黄酮的提取率。
提取时间对柑橘类黄酮提取率的影响如图3所示，根据该结果可以看出，随着提取时间的增加，柑橘类黄酮的提取率呈上升的趋势，当提取时间为3min时，柑橘类黄酮的提取率达到最大值2.17g Rutin/100g WW。随后，柑橘类黄酮提取率没有明显增加，故单因素试验确定的最佳提取时间为3min。
1.3提取转速的单因素实验
选取5个水平进行提取转速的单因素实验：乙醇浓度为70％，提取时间为3min，测量在闪式提取转速为2000、4000、6000、8000及10000r/min时柑橘类黄酮的提取率。
提取转速对柑橘类黄酮提取率的影响的试验结果为图4所示，根据图4可以看出，柑橘类黄酮的提取率随提取转速的增加呈现先增加后降低的趋势，提取转速为6000r/min时柑橘类黄酮的提取率最高2.32g Rutin/100g WW。故单因素试验确定的最佳提取转速为6000r/min。
2.响应面分析试验
根据上述单因素多水平实验结果，以乙醇浓度(X1)、提取时间(X2)、转速(X3)为自变量，以柑橘类黄酮提取率为响应值，采用Box-Behnken中心组合设计法设计三因素三水平的响应面分析试验，响应面试验设计因素与水平如表1所示。
表1响应面试验设计因素与水平
根据Box-Behnke试验设计原理，利用响应面设计三因素三水平进一步优化柑橘类黄酮提取的反应条件，实施17个试验点，其中12个分析因子，5个中心试验以估计误差。表2列出了响应面实验矩阵和实验数据。
表2响应面实验设计与结果
采用Design Expert 8.0.6对试验结果进行回归拟合分析生成二阶多项式方程，得到具有编码因子的最终方程如下：
Y＝2.24-0.070X1+0.026X2+0.059X3-0.053X1X2-0.038X1X3+0.020X2X3-0.48X1 2-0.11X2 2-0.071X3 2
其中，Y是柑橘类黄酮的提取率；X1、X2和X3分别是乙醇浓度(％)、提取时间(min)、转速(r/min)。
表3回归方程方差分析
注：R2＝0.9949，R2 adj＝0.9884，C.V.＝1.54％，adeq.precision＝30.416；
*显著差异(p<0.05)，**极显著差异(p<0.01)。
表3为回归模型的方差分析表，二次回归模型具有较高的F值(151.95)和较低的P值(P<0.0001)表明该模型的适用性非常显著。模型的决定系数R2＝0.9949，校正决定系数R2 adj＝0.9884，证明该模型与实际实验过程具有较高的拟合度。因此，该回归模型具有可行性，可以利用该模型对柑橘类黄酮提取率与单因素水平变化的关系以及数据波动进行预测。
在本实验中，当P<0.05时，表明该因素显著，当P<0.01时，表明该因素极显著。失拟项P值(0.6096，P>0.05)和F值(0.68)表明残差主要有随机误差组成，对优化结果的影响可以忽略不计。此外，C.V.(方程中Y的变异系数)值代表实验的置信度，C.V.值越大，表示实验可靠性低，本试验中C.V.＝1.54％，表明实验操作可信，具有足够的准确性和普遍适用性。此外，参数优化系数表明线性系数(X1，X2，X3)，二次项(X1 2，X2 2，X3 2)和相互作用系数(X1X2，X1X3)对柑橘类黄酮的提取率有很大影响(P<0.05)。
图5～图7显示了响应面预测结果的三维响应面图(3D)和等高线图。通常，带有椭圆形轮廓图的响应面表明相应变量之间的相互作用是显著的，而圆形轮廓图表明相应变量之间的相互作用是不显著的。由图5～7可知，乙醇浓度(X1)和提取时间(X2)、乙醇浓度(X1)和转速(X3)之间的相互作用是显著的。
根据上述步骤构建的回归模型，应用统计学软件Design-Expert 8.0.6对柑橘类黄酮的低共熔溶剂辅助微波提取工艺进一步优化，结果显示，在以下最佳反应条件下可以得到最大提取率的柑橘类黄酮：乙醇浓度为69.00％、提取时间3.18min、提取转速6928r/min，柑橘类黄酮提取率的预测值为2.26g Rutin/100gWW。
考虑实际操作，将以上条件调整为乙醇浓度为69％、提取时间3.2min、提取转速6930r/min，在乙醇浓度为69％、提取时间3.2min、提取转速6930r/min的条件下进行三次验证试验，测得柑橘类黄酮提取率为2.25±0.12g Rutin/100g WW，与理论预测值相差不大，说明Box-Behnken中心组合设计-响应面法优化后的闪式提取法提取柑橘类黄酮的工艺可行，可推广于产业应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本发明的发明人来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种柑橘类黄酮的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：
(1)将柑橘果皮与乙醇溶液混合后闪式提取得到提取物；
(2)离心所述提取物得到上清液，浓缩上清液获得粗提物；
(3)纯化所述粗提物得到柑橘类黄酮。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中柑橘果皮与乙醇溶液的固液比为1g：(3～10)mL。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中乙醇溶液的体积浓度为40％～80％。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中闪式提取的转速为2000～10000r/min。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中闪式提取的时间为1～5min。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤步骤(1)中所用的柑橘果皮为新鲜的柑橘果皮。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中纯化的方法包括大孔吸附树脂法。
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