CN115141839A - 一种结合8-hdf的聚球藻原核6-4光修复酶及其构建方法 - Google Patents

一种结合8-hdf的聚球藻原核6-4光修复酶及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及基因、蛋白质工程技术领域，具体涉及一种结合8‑HDF的聚球藻原核6‑4光修复酶及其构建方法，本发明从聚球藻中获得6‑4光修复酶基因序列，设计引物得到基因片段，其编码如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，连接基因片段与pET22b质粒，构建出重组表达质粒pET22b‑SeFeS‑BCP，将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出用于光修复酶表达的基因工程菌BL21(DE3)/pET22b‑SeFeS‑BCP；将天蓝色链霉菌中的FO合酶(ScFbiC)克隆到pCDFDuet‑1载体上，得到的质粒pCDFScFbiC；将质粒pET22b‑SeFeS‑BCP和pCDFScFbiC一起转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，构建出基因工程菌BL21(DE3)/pET22b‑SeFeS‑BCP+pCDFScFbiC；本发明表达的SeFeS‑BCP[8‑HDF]光修复酶性质稳定、活性持久稳定，能很好的修复紫外线造成的DNA损伤，更有利于为化妆品类、医学疾病的治疗提供帮助。

Description

一种结合8-HDF的聚球藻原核6-4光修复酶及其构建方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及基因、蛋白质工程技术领域，具体涉及一种结合8-HDF的聚球藻原核6-4光修复酶及其构建方法。
背景技术
紫外线(UV)一直对生物的延续发展产生威胁，经过紫外辐射，微生物细胞主要产生环丁烷嘧啶二聚体(cyclobutane pyrimidine dimer，CPD)和嘧啶(6-4)嘧啶酮(pyrimidine(6-4)pyrimidone，(6-4)光产物)，其存在会干扰微生物DNA的复制和转录，使生物体的遗传信息不能稳定传递，引起细胞内信号通路的紊乱，从而造成皮肤疾病甚至是皮肤癌。
光修复酶是修复DNA的蛋白之一，广泛存在于各种生物体中，根据修复底物的不同主要分为CPD光修复酶和6-4光修复酶。光修复酶通过吸收光能来修复紫外线导致的DNA损伤，利用其共价结合的FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)辅酶发挥作用，FAD主要存在三种基本形式：完全氧化型(oxidized，OX)；单电子还原态即自由基型(semiquinone，SQ)；双电子还原态即完全还原型(hydroquinone，HQ)，在光修复酶中，必须依赖双电子还原态FAD辅酶执行功能。部分光修复酶还会结合8-HDF(8-羟基-5-去氮核黄素)或DMRL(6,7-二甲基-8-三硝基脲嘧啶)等第二辅酶，可通过吸收额外的光能，并将能量转移给还原态FAD，提高光修复酶的修复活性。
蓝藻具有高效的光修复能力，聚球藻(Synechococcus elongatus)作为蓝藻的一种代表物种，一直是研究光修复的模式生物。之前的研究只在聚球藻中发现了一种CPD光修复酶(SeCPDI)，修复CPD光产物。我们发现，聚球藻中还存在一种原核6-4光修复酶来完成6-4光产物的修复。结合第二辅酶8-HDF的聚球藻原核6-4光修复酶可以更高效地修复损伤。
光修复酶基因导入哺乳动物可以保护这些生物体免受晒伤、突变和皮肤癌的威胁。光修复酶在化妆品制剂中可预防UV对人体皮肤诱发的病理变化，如晒伤，在缺乏内源性光修复酶的小鼠中引入一种袋鼠CPD光修复酶转基因，可增强抗UV的能力并降低皮肤癌的发病率。以往研究人员对CPD光修复酶的研究已经很充分了，而对于6-4光修复酶的研究较为稀缺。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种聚球藻6-4光修复酶基因和表达8-HDF辅酶的基因。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供含有该基因的表达载体。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供含有该基因的宿主细胞。
本发明所要解决的第四个技术问题是所述聚球藻DNA光修复酶的表达方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种聚球藻6-4光修复酶基因，该6-4光修复酶具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列；来自天蓝色链霉菌中的FO合酶基因S.coelicolor fbiC，可以表达8-HDF。
一种聚球藻6-4光修复酶基因的编码蛋白，该编码蛋白具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
一种载体，所述的载体为重组质粒，该重组质粒含有所述的聚球藻6-4光修复酶基因的pET22b重组质粒。
一种宿主，所述的宿主为聚球藻6-4光修复酶重组工程菌，该工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)且含有所述的重组质粒表达载体，以及核苷酸序列。
该工程菌表达聚球藻6-4光修复酶蛋白的条件为0.5mM-1mM的IPTG诱导浓度及20℃的诱导温度。
本发明的构建方法为从现有的野生型(wild-type，WT)聚球藻中获得6-4光修复酶基因序列，进行人工密码子优化之后，设计引物得到基因SeFeS-BCP，其编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，连接基因片段与pET22b质粒，构建出重组表达质粒pET22b-SeFeS-BCP；将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出用于光修复酶表达的基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-SeFeS-BCP；在20℃和1mM IPTG条件下获得了较好的表达。
为了能够在大肠杆菌中合成8-HDF，将天蓝色链霉菌中的FO合酶(ScFbiC)克隆到pCDFDuet-1载体上，得到的质粒pCDFScFbiC和质粒pET22b-SeFeS-BCP一起转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，共同表达S.coelicolor FO合成酶(ScFbiC)和SeFeS-BCP，此时SeFeS-BCP蛋白可结合8-HDF辅酶，简称SeFeS-BCP[8-HDF]。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1.通过构建出用于光修复酶表达的基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-SeFeS-BCP，与来自农杆菌的6-4光修复酶(AfPhrB)相比，SeFeS-BCP光还原速率较快，并且可以在没有外部电子供体的情况下被光还原，被光还原后，SeFeS-BCP中还原的FAD辅助因子对空气氧化极为稳定，SeFeS-BCP蛋白性质非常稳定。
2.通过SeFeS-BCP[8-HDF]，与不含8-HDF辅酶的SeFeS-BCP相比，SeFeS-BCP[8-HDF]光还原速率更快，而且酶活力大大提高；另外，许多蓝藻具有高效的光活化能力，直接利用外部光能修复CPD和6-4光产物，恢复到100％的存活率，长期以来，在聚球藻中只发现了一种CPD光修复酶(SeCPDI)，它作为CPD光解酶的模型被广泛地研究，而没有对聚球藻中6-4光修复酶进行研究；本发明通过体外表达聚球藻6-4光修复酶，进行功能和应用性研究，为预防紫外损伤和治疗紫外线引起的疾病的应用提供基础。
附图说明
图1为实施例1中PCR检测的SeFeS-BCP基因；
泳道M为DNA Marker，1-3为SeFeS-BCP基因。
图2为实施例1中表达8-HDF的SeFeS-BCP[8-HDF]的PCR检测图；
泳道M为DNA Marker，1-3为SeFeS-BCP基因，显示约1500bp条带，以及ScFbiC基因显示约3000bp条带。
图3为实施例2中纯化后的SeFeS-BCP(A)和SeFeS-BCP[8-HDF](B)的SDS-PAGE电泳图；
泳道S：细胞破碎后离心的上清液；
P:细胞破碎后离心的沉淀；
FT：镍柱结合后的流穿液；
W：杂蛋白洗脱液；
EC:浓缩蛋白的目的蛋白洗脱液；
E过筛：纯度较高的目的蛋白。
图4为实施例3光修复酶SeFeS-BCP光还原检测示意图；
A：检测的是SeFeS-BCP在含10mM DTT的情况下，440nm蓝光照射，第0、1、2、3、5、8、10、15、20min的变化过程；
B：检测的是SeFeS-BCP在不含DTT的情况下，440nm蓝光照射，第0、1、2、4、6、8、12、15、18、20min的变化过程。
图5为实施例3光修复酶SeFeS-BCP[8-HDF]光还原检测示意图；
A：检测的是SeFeS-BCP[8-HDF]在含10mM DTT的情况下，440nm蓝光照射，第0、0.17、0.5、1、1.5、2.5min的变化过程；
B：检测的是SeFeS-BCP[8-HDF]在不含DTT的情况下，440nm蓝光照射，第0、0、0.17、0.5、0.75、1、2、3.5、4.5min的变化过程。
图6为实施例3光修复酶SeFeS-BCP和SeFeS-BCP[8-HDF]光还原速率示意图；
SeFeS-BCP：检测的是第0、1、2、3、5、8、10、15、20min吸光度下降幅度；
SeFeS-BCP[8-HDF]：检测的是第0、0.17、0.5、1、1.5、2.5min的吸光度下降幅度。
图7为实施例4光修复酶SeFeS-BCP活性检测示意图；
检测的是SeFeS-BCP第0、3、6、8、11、14、17、20min的6-4光产物的变化过程变化。
图8为实施例4光修复酶SeFeS-BCP[8-HDF]活性检测示意图；
检测的是SeFeS-BCP[8-HDF]第0、2、4、5、6、7、9min的6-4光产物的变化过程变化。
图9为实施例4光修复酶SeFeS-BCP和SeFeS-BCP[8-HDF]活性比较示意图；
SeFeS-BCP：检测的是6-4光产物在第0、3、6、8、11、14、17、20min吸光度下降幅度；
SeFeS-BCP[8-HDF]：检测的是6-4光产物第0、2、4、5、6、7、9min的吸光度下降幅度。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明技术方案作进一步的详细描述，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定，另外，实施例中出现具体的重量、型号、数量等限定仅作为优选实施例。
实施例1：SeFeS-BCP基因的获得以及共表达载体的构建
1、获得聚球藻6-4光修复酶基因SeFeS-BCP
查找Genbank的聚球藻6-4光修复酶基因序列，基于大肠杆菌(Escherichia coli)中密码子偏好性进行优化，设计适于大肠杆菌表达的基因(SeFeS-BCP)，并连接到pET22b质粒载体上，经由南京金斯瑞公司测序成功后，成功构建重组质粒pET22b-SeFeS-BCP，将pET22b-SeFeS-BCP转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，获得工程菌BL21(DE3)/pET22b-SeFeS-BCP。
2、构建SeFeS-BCP[8-HDF]表达体系
为了在大肠杆菌中合成8-HDF，将S.coelicolor fbiC基因克隆到pCDDuet-1载体中，经由南京金斯瑞公司人工合成该基因，并装载到pCDDuet-1质粒载体上，经由公司测序成功后，寄回构建成功的重组质粒pCDFScFbiC，然后和质粒pET-SeFeS-BCP一起转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，以共同表达S.coelicolorFO合成酶ScFbiC和SeFeS-BCP；PCR检测转化后的菌落，得到表达两种质粒的工程菌BL21(DE3)/pET22b-SeFeS-BCP+pCDFScFbiC。
实施例2：酶SeFeS-BCP、SeFeS-BCP[8-HDF]的表达与纯化
1、光修复酶的表达
挑取工程菌BL21(DE3)/pET22b-SeFeS-BCP，BL21(DE3)/pET22b-SeFeS-BCP+pCDFScFbiC，分别接种于氨苄霉素和氨苄霉素+链霉素抗性的5mL的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌，过夜培养；
次日将菌液接种至500mL含相应抗生素的液体培养基中继续扩大培养；待菌液OD600＝0.6-0.8时，室温冷却至20℃左右时加入1mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，20℃诱导表达20h，将扩大培养的500ml菌液于5500rpm，4℃离心收集菌体。
2、光修复酶的纯化
Start buffer:
Figure BDA0003729459500000051
Elution buffer：
Figure BDA0003729459500000052
Protein buffer:
Figure BDA0003729459500000053
从冰箱中取出菌体，加入约50mL Start buffer重悬吹匀，利用超声破碎仪进行冰浴超声破碎(每超声一秒，暂停两秒作为一个循环)，超声10min；
破碎完成后，4℃，10000rpm/min离心10min，收集上清液S，沉淀P；
取一支Ni-NTA柱子，用Start buffer平衡后加入上清液，充分混匀后置于水平摇床结合30min，使得蛋白与Ni充分结合；结合后，收集穿透液FT；
先使用低咪唑浓度的Start buffer清洗Ni柱，清除杂蛋白，收集洗脱液W；再使用高咪唑浓度的Elution buffer清洗Ni柱两次，将目的蛋白清洗下来，收集洗脱液E；
使用浓缩管将洗脱液E充分浓缩得到浓缩的蛋白EC，并使用Sephadex G25柱将缓冲液快速转换为Protein buffer，进一步提高蛋白纯度得到E过筛。
如图3纯化后的蛋白经12％的SDS-PAGE鉴定(E过筛为纯化后的蛋白样品)，SeFeS-BCP有一条强条带，分子量为50kDa，与通过氨基酸序列计算分子量大小一致。
实施例3：光修复酶SeFeS-BCP与SeFeS-BCP[8-HDF]的光还原检测
CPF家族蛋白功能的发挥都需借助FAD辅酶吸收光能来执行功能，FAD作为电子传递的中间体，可以通过得失一个或是两个电子完成氧化还原反应，传递电子，从而实现光修复功能；将600μL新鲜纯化的光修复酶置于石英比色皿中(加入6μL 1M DTT)，将比色皿置于冰水浴中的烧杯中，固定灯距，用蓝色LED(波长440nm)照射，照射过程中记录光修复酶吸收光谱随光照时间的变化(操作迅速避免空气氧化)；照射一段时间后，光修复酶还原达到平台期。
如图4，光修复酶SeFeS-BCP光还原的变化曲线。
特征吸收峰在375nm和443nm处；
A图表示的是SeFeS-BCP在含DTT条件下的光还原，图中曲线发表表示的是第0、1、2、3、5、8、10、15、20min的SeFeS-BCP吸光度变化；
B图表示的是SeFeS-BCP在不含DTT条件下的光还原，图中曲线发表表示的是第0、1、2、4、6、8、12、15、18、20min的SeFeS-BCP吸光度变化；
可以看出，有无DTT对SeFeS-BCP的光还原几乎没有影响。
如图5，光修复酶SeFeS-BCP[8-HDF]光还原的变化曲线。
特征吸收峰在447nm处。
A图表示的是SeFeS-BCP[8-HDF]在含DTT条件下的光还原，图中曲线发表表示的是第0、0.17、0.5、1.5、2.5min的SeFeS-BCP吸光度变化；
B图表示的是SeFeS-BCP[8-HDF]在不含DTT条件下的光还原，图中曲线发表表示的是第0、0.17、0.5、0.75、1、2、3.5、4.5min的SeFeS-BCP[8-HDF]吸光度变化。
如图6，图中表示的曲线分别反映的是光修复酶SeFeS-BCP和SeFeS-BCP[8-HDF]的光还原反应；每一个点表示的是光照不同时间后FADox的吸光度；
由图可以看出，SeFeS-BCP[8-HDF]的光还原速率明显快于SeFeS-BCP。
实施例4：酶SeFeS-BCP与SeFeS-BCP[8-HDF]的酶活性检测
紫外光照射胸腺嘧啶会产生6-4光产物，该嘧啶二聚体在325nm下有特征吸收；通过不同波长的光照射，聚球藻6-4光修复酶裂解6-4光产物，使得325nm的吸光度会逐渐下降；因此可以通过325nm处的光吸收值下降速度，即单位时间内6-4光产物减少的量，来检测蛋白修复6-4光产物的活性。
在室温中，用254nm紫外灯以10cm灯距，照射合成的含有16个胸腺嘧啶碱基寡聚核苷酸溶液Oligo(dT)16(10uM(umol/L))，持续10-20min，得到含有6-4光产物的寡聚核苷酸的溶液，即UV-dT16；
反应体系包括10μM的UV-dT16，0.1uM(μmol/L)的光修复酶，1mM(mmol/L)的二硫苏糖醇(DTT)，4mM的Mg2+，Protein Buffer定容至600μL；将反应体系置于1ml的石英比色皿中，用不同波长LED灯以灯距5cm光照进行光修复，在一定时间内测定波长325nm附近的可见光吸光度变化，检测其体外6-4光修复酶的活性。
如图7，光修复酶SeFeS-BCP修复6-4光产物的变化曲线。
特征吸收峰在325nm处。
图中表示的曲线分别表示的是第0、3、5.5、10、15、20、25min的6-4光产物吸光度变化。
如图8，光修复酶SeFeS-BCP[8-HDF]修复6-4光产物的变化曲线。
特征吸收峰在325nm处。
图中表示的曲线分别表示的是第0、2、4、5、6、7、9min的6-4光产物吸光度变化。
如图9，图中表示的曲线分别反映的是光修复酶SeFeS-BCP和SeFeS-BCP[8-HDF]在相同条件下经不同波长光照的酶活反应，每一个点表示的是不同波长的光修复速率。
由图可以看出，在所有的照明波长下，SeFeS-BCP[8-HDF]的光修复速率都明显快于SeFeS-BCP的速率，说明SeFeS-BCP结合8-HDF后光修复活性显著提高。
SeFeS-BCP和SeFeS-BCP[8-HDF]蛋白性质稳定且6-4光修复活性高，可以通过不同的固定化方式(如脂质体包埋，纳米结构材料等)，将其有效应用于医学疾病的治疗，如光化性角化病、过早光老化和癌症等，对未来预防或治疗皮肤癌或其他疾病提供帮助。
Figure BDA0003729459500000081
Figure BDA0003729459500000091
Figure BDA0003729459500000101

Claims (5)

1.一种结合8-HDF的聚球藻原核6-4光修复酶，其特征在于：该6-4光修复酶具有SEQ IDNO.1的核苷酸序列；来自天蓝色链霉菌中的FO合酶基因Streptomyces coelicolor fbiC，表达8-HDF。
2.一种聚球藻6-4光修复酶基因的编码蛋白，其特征在于，该编码蛋白具有SEQ IDNO.2的氨基酸序列。
3.一种载体，其特征在于，所述的载体为重组质粒，该重组质粒含有所述的聚球藻6-4光修复酶基因的pET22b重组质粒。
4.一种宿主，其特征在于，所述的宿主为聚球藻6-4光修复酶重组工程菌，该工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)且含有所述的重组质粒表达载体，以及核苷酸序列。
5.一种结合8-HDF的聚球藻原核6-4光修复酶的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
从现有的野生型(wild-type，WT)聚球藻(Synechococcus elongatus)中获得6-4光修复酶基因序列，进行人工密码子优化之后，设计引物得到基因SeFeS-BCP，其编码如SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列；
连接基因片段与pET22b质粒，构建出重组表达质粒pET22b-SeFeS-BCP；
将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出用于光修复酶表达的基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-SeFeS-BCP；
将天蓝色链霉菌中的FO合酶(ScFbiC)克隆到pCDFDuet-1载体上，得到的质粒pCDFScFbiC和质粒pET22b-SeFeS-BCP一起转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，共同表达S.coelicolor FO合成酶(ScFbiC)和SeFeS-BCP，此时SeFeS-BCP蛋白可结合8-HDF辅酶，简称SeFeS-BCP[8-HDF]。
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