CN110029099A - 一种黑曲霉6-4光修复酶及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑曲霉6‑4光修复酶及其构建方法，所述的黑曲霉具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。构建方法为从现有的野生型黑曲霉中获得6‑4光修复酶基因基因An6‑4，重新设计核苷酸序列，选择大肠杆菌表达系统偏好的密码子进行优化，得到改造后的基因An6‑4'，连接基因片段与pET22b质粒，构建出重组表达质粒；将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出工程菌，所述的工程菌在20℃和1mM IPTG条件下获得了较好的表达。本发明与现有技术相比，成功在异源表达系统中表达出的6‑4光修复酶，获得活性可溶蛋白，具有抗氧化能力极好，而且活性持久稳定的特点，可以在生物医药、化妆品领域应用。

Description

一种黑曲霉6-4光修复酶及其构建方法

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及基因、蛋白质工程技术领域，具体涉及一种黑曲霉DNA光修复酶基因及其构建方法。

背景技术

自然条件下紫外线分为三个波段，分别是短波紫外线UVC(200-280nm，杀菌区)，中波紫外线UVB(280-315nm，皮肤红斑区)，长波紫外线UVA(315-400nm，黑光区)。由于大气臭氧层的存在，伤害能力最大的UVC被阻挡，到达地球表面的主要是UVB和UVA波段。而阳光中的中波紫外线UVB会诱导DNA上产生损伤，从而破坏DNA的结构，使DNA的正常复制和转录受到阻碍，引起皮肤及组织细胞内的信号通路发生改变，造成免疫的抑制，皮肤的炎症，甚至造成皮肤癌。其原理是UVB能直接被皮肤细胞DNA吸收，引起DNA上两个相邻的胸腺嘧啶产生稳定共价结合的二聚体，包括环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和6-4光产物(6-4photoproduct)，这两类二聚体破坏DNA正常结构，从而抑制DNA的复制与转录，引起细胞内信号通路的紊乱，从而造成皮肤疾病甚至是皮肤癌(李沛波，关永源，贺华，丘钦英et al.中波段紫外线对角质形成细胞凋亡的诱导和钙信号的影响[J].中国药理学通报，2004,20(4)：398-402.)。

地球上的早期生命诞生于海洋，由于缺乏臭氧层的保护，原始的生命体需要在紫外线极强的环境中生存下来，就形成了多种抵抗紫外线的机制。原始的生命为适应恶劣环境，具有一种具备光修复的蓝光受体：类似于光修复酶利用蓝光修复DNA损伤。随着生物不断进化，这种蓝光受体逐渐分化成今天的光修复酶。光修复酶是一类在细菌、真菌、植物和动物中都普遍存在，在修复紫外线造成的DNA损伤中发挥重要作用的酶。根据修复底物的不同，可以分为CPD光修复酶和6-4光修复酶。两种光修复酶都以非共价的形式结合FAD辅酶，是最常见的辅酶形式。与自然界中利用NADH或是亚铁血红素类似，FAD作为电子传递的中间体，可以通过得失一个或是两个电子完成氧化还原反应，传递电子。FAD主要存在三种基本形式：完全氧化型(oxidized，OX)；单电子还原态即自由基型(semiquinone，SQ)；双电子还原态即完全还原型(hydroquinone，HQ)。在光修复酶中，必须依赖双电子还原态FAD辅酶执行功能。

随着科学技术的发展，人类破坏自然的活动加剧，造成大气中臭氧层稀薄甚至产生空洞，阻挡紫外线的能力减弱。于是到达地球表面的UVB，剂量逐渐增强，导致人类各种皮肤损伤的发病几率大大增加。自1999年德国科学家报道光修复酶修复受损人类臀部皮肤的研究后，将光修复酶作为化妆品的添加成分，逐渐成为防晒产品的主流。以往研究人员对CPD光修复酶的研究已经很充分了，而对于6-4光修复酶的研究较为稀缺。

黑曲霉(Aspergillus niger)作为一种常见的曲霉属真菌，分布极其广泛，是重要的发酵工业菌种，对紫外线耐受能力强，然而由于黑曲酶6-4光修复酶基因(GenBank中的登录号为XM_001397421.2)的GC碱基含量及密码子的差异，使黑曲酶的基因在异源原核宿主中的表达常常受限。特别是大肠杆菌，其作为低等的原核生物，缺乏完善的翻译后修饰系统，真核生物蛋白在其中常无法表达或以包涵体形式存在，不能获得活性可溶蛋白。

发明内容：

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的第1个技术问题是提供了一种黑曲霉6-4光修复酶基因。

本发明所要解决的第2个技术问题提供是含有该基因的表达载体。

本发明所要解决的第3个技术问题是含有该基因的宿主细胞。

本发明所要解决的第4个技术问题是所述光修复酶的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种黑曲霉6-4光修复酶，该6-4光修复酶具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，且能在异源宿主大肠杆菌中表达可溶蛋白。

一种表达载体，所述的载体为重组质粒，该重组质粒含有所述的SEQ ID NO.1的核苷酸序列基因的pET-22b(+)重组质粒。

一种宿主细胞，所述的宿主细胞为大肠杆菌且含有所述的表达载体。

优选的，该工程菌表达黑曲霉6-4光修复酶蛋白的条件为0.5mM-1mM的IPTG诱导浓度及20℃的诱导温度。

本发明的构建方法为：从现有的野生型(wild-type，WT)黑曲霉(Aspergillusniger)中获得6-4光修复酶基因基因An6-4，重新设计核苷酸序列，选择大肠杆菌表达系统偏好的密码子进行优化，得到改造后的基因An6-4'，该基因核苷酸序列所编的氨基酸序列保持不变，但1923个核苷酸序列中440个核苷酸发生了变化，占整个基因的22.9％，GC含量也由菌株中的原始核苷酸占比的52.7％下降至47.4％，有利于优化基因在大肠杆菌的表达。

将优化后的基因An6-4'与pET22b质粒连接，构建具Amp抗性的重组表达载体pET22b-An6-4'。

将pET22b-An6-4'重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，构建用于An6-4'表达的基因工程菌Rosetta(DE3)/pET22b-An6-4'，该重组工程菌同时具备Amp和Cam抗性。

采用Ni²⁺离子亲和层析法及SDS-PAGE电泳，获得高度纯化An6-4蛋白，获得的光修复酶An6-4抗氧化能力强，并且酶活力稳定。

所述的黑曲霉6-4光修复酶在生物医药、化妆品领域的应用。

本发明与现有技术相比，所制的黑曲霉6-4光修复酶，且能在异源宿主大肠杆菌中表达可溶蛋白。并且通过体外表达黑曲霉6-4光修复酶，进行功能和应用性研究，为体外修复和治疗紫外线造成的皮肤损伤提供方向。作为应用最广泛的经典蛋白表达系统，原核表达系统(大肠杆菌表达系统)几十年来不断得到发展和完善，被科研及工业用户大量用于各种重组蛋白表达。与其它表达系统相比，具有目的基因培养周期短，表达水平高，抗污染能力强，成本相对低的特点。比较CPD光产物和6-4光产物可知，6-4光产物比CPD光产物更具有致突变性，它能直接引起细胞的凋亡，而CPD光产物仅仅造成细胞周期暂时或短期的停滞现象，因此，对6-4光修复酶的研究就具有重要的意义。

附图说明:

图1为实施例1中An6-4基因与优化后An6-4'基因部分序列比对图核苷酸序列比对一致性为50％的，为设计优化的核苷酸位点。

图2为实施例1中An6-4基因与优化后An6-4'基因部分序列比对图核苷酸序列比对一致性为50％的，为设计优化的核苷酸位点。

图3为实施例1所制的光修复酶An6-4纯化的SDS-PAGE电泳图泳道1-3为纯化蛋白分管收集样品，M为低分子量标准蛋白。

图4为实施例1所制的光修复酶An6-4活性检测示意图

An6-4：检测的是第0min、7min、15min、25min、40min、90min的底物变化曲线

图5为实施例1所制的光修复酶An6-4活性曲线

An6-4：检测的是第0min、30s、1min、2min、4min、7min、10min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min的底物325nm吸光度变化

图6为实施例1所制的光修复酶An6-4酶活稳定性检测

An6-4：检测的是第1、2、3、5、7、15天的酶活性变化。

图7为实施例1所制的光修复酶An6-4紫外-可见光光谱

An6-4：检测的是第0min、255min、505min、755min、1265min、2005min、3005min、3995min、5015min氧化过程的光谱变化。

图8为实施例1所制的光修复酶An6-4的441nm吸收峰变化曲线

An6-4：检测的是第0min、255min、505min、755min、1265min、2005min、3005min、3995min、5015min的的441nm吸光度变化

具体实施方式:

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

实施例1：An6-4基因的优化以及化学合成

1.对黑曲酶光修复酶基因进行优化、合成

查找Genbank(accession XM_001397421.2)的黑曲霉光修复酶(WT)基因序列，黑曲酶光修复酶基因An6-4基因全长1923bp，A碱基512个，占比26.6％；T碱基398个，占比20.7％；C碱基432个，占比22.5％；G碱基581个，占比30.2％；GC含量为52.7％，体现了黑曲霉的高GC含量特征。由于黑曲霉是真核生物，含有自身的一套密码子系统，无法完成在原核生物大肠杆菌中有效异源表达,为了解决这一问题，在表达相同氨基酸序列的前提下，我们对光修复酶基因An6-4核苷酸序列进行了优化，尽量降低该基因的GC含量，同时以大肠杆菌偏好密码子代替其稀有密码子,此外，为使该基因与载体pET-22b(+)连接，在优化后的基因An6-4'序列上游和下游分别添加Nde I(CATATG)和Xho I(CTCGAG)对应酶切位点的碱基。交由上海捷瑞生物公司人工合成该基因，并装载到pET22b质粒载体上，经由公司测序成功后，寄回构建成功的重组质粒pET22b-An6-4'(郑彬琼.大肠杆菌同义密码子偏好性概述[J].硅谷,2009(01):23-24.)。

2.优化后光修复酶基因的序列分析

优化后的酯酶基因An6-4'全长仍为1923bp，但在核苷酸特征方面表现为A碱基537个，占比27.9％；T碱基475个，占比24.7％；C碱基406个，占比21.1％；G碱基505个，占比26.3％。将黑曲霉光修复酶核苷酸序列An6-4与优化后的该基因的核苷酸序列An6-4'进行比对如图1、图2所示，1923个碱基中有440个碱基发生了改变，占全部氨基酸序列的22.9％。在GC含量方面，相比原始序列，优化后的碱基GC含量下降至47.4％，从而克服了GC含量过高导致该光修复酶无法表达的缺陷。

实施例2：黑曲霉光修复酶An6-4的表达与纯化

1、光修复酶An6-4的表达

将重组质粒pET22b-An6-4'，转化到Rosetta(DE3)感受态细胞，构建工程菌Rosetta(DE3)/pET22b-An6-4'。挑取工程菌Rosetta(DE3)/pET22b-An6-4'，接种于氨苄霉素和氯霉素抗性的5ml的LB液体培养基中，37℃，225rpm摇菌，过夜扩大培养。次日将2ml培养物转接到200ml含相应抗生素的液体LB中，37℃，225rpm，振荡培养至OD₆₀₀吸光度数值为1.0；从摇床中取出细菌，降至室温。加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，20℃，225rpm，诱导表达20h；将扩大培养的200ml菌液分四次加入50ml离心管中，5500rpm，4℃，5min离心，收集菌体。

2、光修复酶An6-4的纯化

LEW Buffer(500ml)

Elution Buffer(500ml)：

取5ml菌体，充分悬浮于30mL LEW Buffer裂解缓冲液中。将菌液置于压力破碎仪中，70Mpa压力，破碎3min。将破碎液12000rpm，10min高速离心，取30ml上清转移至加入到30ml Ni²⁺离子亲和柱(purification Kit)中，混匀；4℃下于水平摇床上晃动样品30min，使上清与镍离子树脂充分结合，。结合结束，用1倍柱体积的LEW Buffer清洗树脂；用1倍柱体积的洗脱液(Elution buffer)洗脱目的蛋白；用EP管收集洗脱蛋白(1ml)。

如图3纯化后的蛋白经12％的SDS-PAGE鉴定(1-2为纯化蛋白分管收集样品，M为低分子量标准蛋白)，在73kDa处有单一特异性很高的条带，说明纯化后的蛋白的纯度较高(90﹪以上)。且与通过氨基酸序列计算分子量大小一致。

实施例3：光修复酶An6-4的酶活性检测

紫外光照射胸腺嘧啶会产生6-4光产物，该嘧啶二聚体在325nm下有特征吸收。通过300nm-400nm近紫外可见光照射，黑曲霉光修复酶裂解还原6-4光产物，使得325nm的吸光度会逐渐下降。因此可以通过325nm处的光吸收值下降速度，即单位时间内底物减少的量，来检测蛋白修复6-4光产物的活性。

在室温中，用254nm紫外灯以1cm灯距，照射人工合成的含有16个胸腺嘧啶碱基寡聚核苷酸溶液(上海捷瑞)，持续5h，得到含有6-4光产物的寡聚核苷酸的溶液，即UV-DT16。反应体系600μL，包括8.6μM的UV-DT16，0.5μM的光修复酶，以及pH 7.0样品缓冲液ProteinBuffer。将反应体系置于1ml的石英比色皿中，用20W近紫外LED灯(主要输出波长385nm)以灯距1cm光照进行光修复，在一定时间内，测定波长325nm附近的可见光吸光度变化。检测其体外6-4光修复酶的活性。

Protein buffer(定容至500mL):

用HCl调pH7.0，加入ddH₂O定容至0.5L。

光修复酶反应体系(600μl)

UV-dT16(8.6μM) 8μl

光修复酶(0.5μM) 10μl

Protein Buffer 定容至600μl

使用实施例2中纯化新鲜的光修复酶An6-4进行酶活检测。如图4，光修复酶An6-4修复6-4光产物的变化曲线，特征吸收峰在325nm处。图中表示的曲线分别表示的是第0、7、15、25、40、90min的6-4光产物325nm吸光度变化。

如图5，图中表示的曲线反映的是光修复酶An6-4在0-90min的酶活反应。每一个点表示的是6-4光产物在325nm处吸光度。随着光照修复，6-4光产物在逐渐减少。由图可以分析，光修复酶An6-4在反应起始20min内的斜率，为单位时间内底物的减少量，反映了蛋白酶活。经过计算，酶活为0.034μM^-1·min^-1(ε_{6-4photoproduct}＝6000μM·cm^-1)。

实施例4：光修复酶An6-4活力稳定性检测

自然条件下，光修复酶结合黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)执行修复功能。FAD通过自身得失电子，进行氧化还原反应，使酶具有光修复活性。因此FAD有三种存在形式，氧化状态，自由基状态(单电子态)和还原状态(双电子态)。在FAD三种类型中，光修复酶只有结合还原型FAD才具有光修复活性，在体外条件下，光修复酶会不断被空气逐渐氧化，蛋白含有的还原型FAD逐渐减少，从而逐渐失去活性。

使用实施例2中的纯化的光修复酶An6-4，参照实施例3中的测活方法，进行蛋白的活性稳定性检测。

如图6，图中表示的曲线反映的是光修复酶An6-4第1、2、3、5、7、15天的酶活性变化。每一个点表示的是当天酶体系反应过程中的斜率绝对值，即在单位时间内底物的减少量。斜率数值的绝对值越大，表示反应速度越快，酶活性越好。从图上可以看出，WT光修复酶的活性慢慢减弱，在第15天进入反应平台期，但仍有活性，活力未降到0，说明光修复酶An6-4的活力能稳定持久。

实施例5：光修复酶An6-4的抗氧化能力检测

在体外条件下，光修复酶会不断被空气逐渐氧化，从而逐渐失去活性。光修复酶可以依赖电子供体(如二硫苏糖醇，DTT)，通过波长300-500nm光照，被还原为完全还原型，此过程称之为光还原。将同等浓度的光修复酶An6-4，置于半微量石英比色皿中，进行光还原，直至变为完全还原型。

在空气中，光修复酶An6-4氧化过程是由还原型光修复酶向氧化型光修复酶转变，即还原型光修复酶不断减少，氧化型光修复酶不断增加。而氧化型光修复酶特定吸收波长为450nm的可见光，其特征是为450nm波长可见光的吸光度逐渐上升，直至稳定不变。吸取600μl光修复酶An6-4，置于1ml的石英比色皿中，进行光还原。将完全还原型的蛋白置于紫外分光光度计下，18℃控温。

设置200-750nm的波长检测范围，每隔一段时间，光修复酶An6-4在200-750nm波长可见光的吸收光谱，主要测定波长450nm可见光的吸光度变化，从而分析比较光修复酶An6-4的氧化过程变化(如图7)。

测定后，光修复酶An6-4在450nm处的吸收峰，在5000min上升趋势才逐渐结束(如图8)，说明蛋白在5000min之后才能完全氧化，氧化速度极慢。

1999年德国科学家发现光修复酶可以体外修复人类晒伤皮肤之后，带有光修复酶的化妆品、医药开始逐步出现，并且一直受到市场欢迎。光修复酶An6-4在空气中能长久保持活性，有利于执行光修复功能，修复更多的紫外造成的DNA损伤，进而可以应用于生物医药、化妆品领域。

序列表

<110> 安徽师范大学

<120> 一种黑曲霉6-4光修复酶及其构建方法

<130> 2019.03.18

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1923

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger人工合成)

<400> 1

atgccgccgc agagcgcacc gaccgttatt ttttggcatc gtaccgatct gcgtctgcat 60

gataatccgg cattacaagc agcactgagc ctgaatccgt ctacctttat tccgattttt 120

acctgggacc cgcattatgc atatcaggtg cgtgtgggcc cgaatcgctg gcgctttctg 180

ctggaatgtc agaatgatct gtcacagagc tatcgcaaac tgaatccgaa acagaaactg 240

tgggttgtgc gcgaagcacc gcagaccgtg tttccgaaac tgtttaaagc atggggtgca 300

acccatctgg tgtttgaatc agataccgat ggctatgcac gcgaacgtga tgaaaccatt 360

cgtaaactgg caaatgaagc aggtgtggaa gttattgtta aatcaggtcg taccctgttt 420

gatagcgatg aagtggttaa acagaataaa ggcgaaccga ccatgtcaat tcatcaggtg 480

gaaaaagcaa ttgaacagat taataatggc gtgccggatc gcccggttga tgcaccggaa 540

cgtattccag acccgctggg cgaagaaaaa atgcgcgata ttagcggcct ggaacatgaa 600

gtgccggatc atgaagatga tattaatgca gcacatcgta ccaaacataa tgataatcag 660

tataataata ttgcaggccc gaaaggtgat tttagtattc cgaccctgga tgaactgtca 720

attgatcctt ctcaggcaac ctctccgcat catggcggcg aatcaattgc actggaaatg 780

ctgaccacct atctccagca gaatgaagat tatattgcaa cctttgaaaa accgaaaacc 840

tctccggcag catttcatcc gcaggcaacc accctgctga gtccgcatct gcattttggt 900

agcctgagcg ttcgcaaatt ttggcatgat gttcaggata ccctacaaca gcgcgaatca 960

gcacataaac cgacctcgga cctgccgacc aatctgccgg gccagctgct gtttcgcgaa 1020

atgttttttg cagcacaggc agcactgggc ccggtgtatg cacagacccg cggtaataaa 1080

attgtgcgct ttgtgccgtg gcatctccag tctaatcatg ataaagaaac tgggctggtt 1140

gatcgtacct ataccgttga tgatgaacag gcagaagtgt ggtttcgtcg ttggaaagaa 1200

ggtcgtaccg gctttccgtg gattgatgca ctgatgcgcc agctgaaaaa tgaaggttgg 1260

attcatcatc tgggtcgcca tagcgttgca tgttttctga cccgcggcgg ttgttatgtt 1320

cattgggaac gcggcgcaga agtgtttgaa gaatggctga ttgatcatga aaccgcaagt 1380

aatgtgggta attggatgtg gctgtcttgt accgcatttt ttacccagta taatcgttgt 1440

tatagcccgg ttgcatttgg taaaaaatgg gacccggaag gtcgctttat tcgccattat 1500

attccggaac tggaacatta tgataaaaaa tatatttatg aaccgtggaa agcaccgctg 1560

gaagatcaga aacgttggaa atgtcgtgtg accggcgatg gtatggtgga aaaagatgaa 1620

gaaaccggcc tgcgcgcata tccggaaccg atgtttgatt ttgatgaacg tcgccagacc 1680

tgtattgcac agatgaaaga agcatacgaa gttcatctga tgggtaatga tgaaaaagtt 1740

atggatggct cttggaaaga aatttttgaa tatgaagtta aagatggtcg cgttgtggat 1800

gaaaccaatg ttaaagtgga tggtgatggc ggtcatcgta aaggcggcga aaaacgcggt 1860

cgccaggcag gcgatcagga tggcgaagat gaagatggtg gacacggcct gaaaaaaaaa 1920

aaa 1923

Claims (5)

1.一种黑曲霉6-4光修复酶，其特征在于：其具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

2.一种表达载体，所述的载体为重组质粒，其特征在于：该重组质粒为含有权利要求1所述的SEQ ID NO.1的核苷酸序列基因的pET-22b(+)重组质粒。

3.一种宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为大肠杆菌且含有权利要求2所述的表达载体。

4.一种黑曲霉6-4光修复酶的构建方法：包括以下步骤：

从现有的野生型(wild-type，WT)黑曲霉(Aspergillus niger)中获得6-4光修复酶基因基因An6-4，重新设计核苷酸序列，选择大肠杆菌表达系统偏好的密码子进行优化，得到改造后的基因An6-4'；

将改造后的基因An6-4'与pET22b质粒连接，构建具Amp抗性的重组表达载体pET22b-An6-4'；

将pET22b-An6-4'重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，构建用于An6-4'表达的基因工程菌Rosetta(DE3)/pET22b-An6-4'；

采用Ni²⁺离子亲和层析法及SDS-PAGE电泳，进行纯化，即可。

5.权利要求1所述的黑曲霉6-4光修复酶在生物医药、化妆品领域的应用。