CN1151166A - 用作酶抑制剂的3-氨基-2-氧代-1-哌啶乙酸衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了作为有效的凝血酶特异性抑制剂的肽醛，它们的药学上认可的盐，它们的药学上认可的组合物，以及将其用作哺乳动物体内特点为异常血栓形成的疾病的治疗药剂的方法。

Description

用作酶抑制剂的3-氨基-2- 氧代-1-哌啶乙酸衍生物

相关专利申请的参考

本申请是于1994年6月17日申请的USSN08/261,378和于1994年12月13日申请的USSN08/356,831的部分继续申请，以上两项申请的公开内容在此引用参考。

技术领域

一方面，本发明涉及作为凝血酶的强特异性抑制剂的化合物。另一方面，本发明涉及新的肽醛，它们的药学上认可的盐，和它们的药学上认可的组合物，此类组合物可用作哺乳动物体外和体内血液凝固作用的强特异性抑制剂。此外，本发明还涉及将这些抑制剂用作治疗哺乳动物中以异常的血栓形成为特征的疾病的方法。

背景

正常的止血作用是血凝块形成(血液凝固)过程和血凝块溶解(血纤维蛋白溶解)过程之间复杂平衡的结果。血细胞、特异性血浆蛋白和血管表面之间复杂的相互作用维持着血液的流动性，除非发生损伤和失血。

血液凝固是一系列反应扩增至最大时的结果，其中，血浆中丝氨酸蛋白酶的几种特异性酶原被限制性蛋白水解作用所激活。Nemerson，Y.和Nossel，H.L.，Ann.Rev.Med.，33：479(1982)。由这一系列反应形成稳定初级止血栓所需的不溶性的血纤维蛋白基质。通过血凝作用的外源性和内源性路径发生激活反应的相互作用和扩增。

这些路径高度的相互依赖并集中到一种丝氨酸蛋白酶，即因子Xa的形成。因子Xa催化凝血作用级联中的倒数第二步，此步骤产生丝氨酸蛋白酶凝血酶。此步骤发生于凝血酶原酶复合物组装完成之后，此复合物由因子Xa、非酶辅因子Va和底物凝血酶原在被粘附的已活化的血小板或全身循环膜质微粒表面组装而成。

酶原因子X经蛋白水解激活成为其有催化活性的形式Xa可以通过内源性或外源性凝血路径发生。

之所以称“内源性”路径是因为凝血所需的各种物质都在血液之中。Saito，H.，“Normal Hemostatic Mechanisms”，Disorders of Hemostasis，pp.27-29，Grune & Stratton，Inc.(O.D.Ratnoff，M.D.和C.D.Forbes，M.D.编，1984)。此路径包括丝氨酸蛋白酶原(因子IX和XI)和非酶辅因子(因子VIII)。内源性路径的引发将因子XI激活成XIa。因子XIa催化激活IX成为IXa，后者与位于合适的磷脂表面上的活性形式的因子VIII结合形成tenase复合物。此复合物也催化由酶原，因子X形成丝氨酸蛋白酶(因子Xa)，由后者形成血凝块。

之所以称“外源性”路径是因为与因子VII结合并促使其激活的组织因子来自血液之外。Saito，同上。此路径中的主要组份是丝氨酸蛋白酶原(因子VII)和膜结合蛋白(组织因子)。后者起此酶所必需的非酶辅因子的作用。此路径的引发是通过微量的已激活的因子VII(因子VIIa)激活酶原因子VII的自催化作用，两种因子都与血管损伤部位膜表面上新暴露的组织因子相结合。因子VIIa/组织因子复合物直接催化由酶原(因子X)形成丝氨酸蛋白酶(因子Xa)。血液与受伤组织接触引发通过外源性路径的凝血作用。

因子Xa在组装成有催化活性的凝血酶原酶复合物后催化凝血酶的形成(参见Mann，K.G.等的综述，“Surface-Dependent Reactions of the VitaminK-Dependent Enzyme Complexes”，blood，76：1-16(1990))。此复合物由因子Xa，非酶辅因子Va和底物凝血酶原在合适的磷脂表面上组装而成。有效的催化作用需要大分子复合物使因子Xa不受天然抗凝血机制，例如肝素-抗凝血酶III介导的抑制作用的影响。Teite，J.M.和Rosenberg，R.D.，“Protectionof Factor Xa from neutralization by the heparin-antithrombin complex”，J.Clin.Invest.，71：1383-1391(1983)。此外，将因子Xa隐含在凝血酶原酶复合物内部还使它能够耐受外源肝素疗法(也需要抗凝血酶III来产生抗凝血作用)的抑制作用。

凝血酶是血栓形成中的早期介体。凝血酶直接作用使循环的血纤维蛋白原形成不溶性的血纤维蛋白。此外，凝血酶将酶原因子XIII激活成活性转谷氨酰胺酶因子XIIIa，后者通过使血纤维蛋白链交联来共价地稳定形成中的血栓。Lorand，L.和Konishi，K.，Arch.Biochem.Biopys.，105：58(1964)。除了在富血纤维蛋白血凝块的形成和稳定化中的直接作用之外，据报道，此酶还具有尚无解释的对脉管系统和血液中许多细胞组份的生物调节作用。Shuman，M.A.，Ann.NY Acad.Sci.，405：349(1986)。

凝血酶被认为是血小板激活最有效的激动剂，而且，它已被证明是血小板依赖性的动脉血栓形成的早期病理生理介体。Edit，J.E.等，J.Clin.Invest.，84：18(1989)。凝血酶介导的血小板激活引起配体介导的血小板相互凝聚，此凝聚主要是由于粘性配体(例如血纤维蛋白原和纤连蛋白)与血小板整合蛋白受体(例如糖蛋白IIb/IIIa)之间的二价相互反应，它们在凝血酶激活后采取其活性构象。Berndt，M.C.和Phillips，D.R.，Platelets in Biology and Pathalogy，pp.43-74，Elsevier/North Holland Biomedical Press(Gordon，J.L.编。1981)。凝血酶激活的血小板还可以通过在凝血酶分别介导的非酶辅因子V和VIII激活后，在完整的活性血小板和血小板衍生的微粒的膜表面组装新的凝血酶原酶和tenase(因子IXa，因子VIIIa和因子X)催化复合物，支持进一步产生凝血酶。Tans，G.等，Blood，77：2641(1991)。这一正反馈过程在血栓周围局部产生高浓度的凝血酶，由此支持血栓进一步的生长和扩展。Mann，K.G.等，Blood，76：1(1990)。

和促血栓形成作用相对照，凝血酶还证明能影响止血作用的其它方面。这些包括其作为重要的生理抗凝剂的作用。凝血酶在与内皮细胞膜糖蛋白血小板修饰蛋白(thrombomodulin)结合后表现出其抗凝血作用。这被认为引起凝血酶底物特异性的改变，由此使其能够识别并通过蛋白水解作用激活循环的蛋白C成为活性蛋白C(aPC)。Musci，G.等，Biochemistry，27：769(1988)。aPC是一种丝氨酸蛋白酶，它选择性地使非酶辅因子Va和VIIIa失活，这种失活作用分别通过凝血酶原酶和tenase催化复合物而对凝血酶的形成产生降调节作用。Es-mon，C.T.，Science，235：1348(1987)。没有血小板修饰蛋白时，凝血酶对蛋白C的激活作用很弱。

凝血酶还是多种细胞的有效的直接促细胞分裂剂，包括血管平滑肌细胞之类的来自间质的细胞。Chen，L.B.和Buchanan，J.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72：131(1975)。凝血酶与血管平滑肌的直接相互作用还引起血管收缩。Walz，D.A.等，Proc.Soc.Expl.Biol.Med.，180：518(1985)。凝血酶起着直接促分泌素的作用，诱导许多生物活性物质由血管内皮细胞中释放，其中包括组织纤溶酶原激活物。Levin，E.G.等，Thromb.Haemost.，56：115(1986)。除了这些对血管细胞的直接作用外，该酶能够在凝血酶介导的激活作用后，通过从无粒血小板(patelet agranules)中释放多种强生长因子(例如血小板衍生生长因子和表皮生长因子)，间接发挥对血管平滑肌细胞的强促有丝分裂活性。Ross，R.，N.Engl.J.Med.，314：408(1986)。

许多重要的病况与异常的凝血有关。对于冠状动脉脉管系统，已形成的粥样硬化斑块的破裂造成的异常血栓形成是急性心肌梗塞和不稳定型心绞痛的主要原因。而且，用血栓溶解疗法或经皮经腔冠状血管成形术(PTCA)治疗闭合性冠状血栓通常伴有患病血管的急性血栓形成性再闭合，需要立刻溶解。对于静脉脉管系统，接受下肢或腹部大手术的病人中有很高百分比发生静脉脉管系统血栓形成，这会引起流向患病肢体的血流减少和肺栓塞的倾向。播散性血管内凝血障碍通常在败血性休克、某些病毒感染和癌症时在血管系统中发生，其特点为凝血因子的迅速消耗和全身性凝血，引起在整个脉管系统中发生危及生命的血栓形成，引起广泛的器官衰竭。

动脉脉管系统中的病原性血栓形成是现代医学中的一个主要临床问题。它是急性心肌梗塞(西方国家死亡率的主要原因之一)的主要原因。在闭塞的冠状血管分别使用溶血栓剂或经皮经腔血管成形术(PTCA)经酶法或机械再通之后，复发性动脉血栓形成也仍然是衰竭的主要原因之一。Ross，A.M.，Throm-bosis in Cardiovascular Disorder，p.327，W.B.Saunders Co.(Fuster，V.和Verstraete，M.编，1991)。Califf，R.M.和Willerson，J.T.，同上，p389。与静脉脉管系统中的血栓形成不同，动脉血栓形成是血纤维蛋白形成(血液凝固级联所引起)和细胞成份，尤其是构成动脉血栓主要部分的血小板之间复杂的相互作用的结果。肝素，使用最广泛的抗凝血剂(静脉注射给药)治疗和防止急性动脉血栓形成或血栓再形成尚未证明普遍有效。Prins，M.H.和Hirsh，J.，J.Am.Coll.Cardiol.，67：3A(1991)。

除了常发生在PTCA之后的无法预料的复发性血栓形成性再闭塞，在此手术后的1至6个月中，在30％至40％的病人中还发生再通血管的再狭窄(尚无解释)。Califf，R.M.等，J.Am.Coll.Cardiol.，17：2B(1991)。这些病人需要再次进行PTCA或冠状动脉搭桥术来进一步治疗，以缓解新形成的狭窄。机械损伤的血管的再狭窄不是血栓形成过程，而是周围平滑肌细胞中过度增殖反应的结果，这种增殖在长时间后造成因肌肉体积增加而减小了管腔直径。同上书。至于动脉血栓形成，目前没有防止机械再通后血管再狭窄的有效的药物治疗方法。

在一个方面，对安全有效的治疗用抗凝血剂的需求已将注意力集中在丝氨酸蛋白酶凝血酶在血液凝固中的作用。

据报道，凝血酶最好的天然底物在P3识别亚部位具有一个不带电的氨基酸。例如，作为凝血酶主要生理底物的血纤维蛋白原其Aα链上的凝血酶酶切部位，据报道，在此位置具有一个甘氨酸残基，而在Bβ链上的酶切部位具有一个丝氨酸，如下所示：

P4  P3  P2  P1  P1′

Gly-Gly-Val-Arg/Gly血纤维蛋白原Aα链

Phe-Ser-Ala-Arg/Gly血纤维蛋白原Bβ链

已有报道，在P3位具有不带电残基的肽基衍生物据说与凝血酶的活性部位结合，由此抑制血纤维蛋白原向血纤维蛋白的转化以及细胞的激活。这些衍生物具有与P1氨基酸相关的一个醛、氯甲基酮或硼酸官能团。例如，类似底物的肽基衍生物，例如D-苯丙氨酰-脯氨酰-精氨醛(D-Phe-Pro-Arg-al)，D-苯丙氨酰-脯氨酰-精氨酸-氯甲基酮(P-PACK)和乙酰-D-苯丙氨酰-脯氨酰-硼精氨酸(Ac-(D-Phe)-Pro-boroArg)已被报道能通过与此酶活性部位的直接结合来抑制凝血酶。Bajusz，S.，Symposia Biologica Hungarica，25：277(1984)，Bajusz，S.等，J.Med.Chem.，33：1729(1990)和Bajusz，S.等，Int.J.Peptide ProteinRes.12：217(1970)；Kettner，C.和Shaw，E.，Metods Enzymol.，80：826(1987)，Kettner，C.等，EP293，881(于1988年12月7日公开)，Kettner，C.等，J.Biol.Chem.265：18209(1990)。这些分子已被报道是防止富血小板的动脉血栓形成的强抗凝血剂。Kelly，A.B.等，Thromb.Haemostas.，65：736，摘要257(1991)。还提出或报道了其它用作凝血酶抑制剂的肽基醛。Bey，P.等，EP363，284(公开于1990年4月11日)和Balasubramanian，N.等，EP526，877(公开于1993年2月10日)。

据说是凝血酶活性部位的抑制剂，但其结构不同于那些在P3识别亚部位具有不带电氨基酸的化合物也已有所报道。

据报道，化合物Argatroban(又称2R，4R-4-甲基-1-〔N-2-(3-甲基-1，2，3，4-四氢-8-喹啉磺酰)-L-精氨酰〕-2-哌啶羧酸)也直接与凝血酶的活性部位结合，而且被认为是该酶的非肽基抑制剂类中最强且具有选择性的化合物。Okamoto，S等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，101：440：(1981)。Argatroban据报道在几种动脉血栓形成实验模型中是强抗血栓形成剂。Jang，I.K.等，Circulation，81：219(1990)和Circ.Res.，67：1552(1990)。

已报道了据说是凝血酶抑制剂、其作用方式被认为是通过与酶的活性部位和另一部位结合的肽基化合物。已有报道，水蛭素和水蛭素的某些肽基衍生物通过同时与凝血酶的活性部位和外侧部位结合，或只与外侧部位结合同时抑制血纤维蛋白原向血纤维蛋白的转化和血小板的激活。Markwardt，F.，Thromb.Haemostas.，66：141(1991)。据报道，水蛭素是一个65氨基酸的多肽，最早由水蛭的唾液腺提取物中分离得到。它被说成是已知最有效的凝血酶抑制剂。Mark-i，W.E.和Wallis，R.B.，Thromb.Haemostas.，64：344(1990)。据报道，它通过同时与结合阴离子的外侧部位和催化活性部位(两者互不相同且相距很远)结合来抑制凝血酶。Rydel，T.J.等，Science，249：277(1990)。据报道，水蛭素是有效的体内抗血栓形成剂。Markwardt，F.等，Pharmazie，43：202(1988)；Kelly，A.B.等，Blood，77：1(1991)。除了其抗血栓形成作用之外，据报道，水蛭素还能有效抑制粥样硬化的兔股动脉受机械损伤后的平滑肌增生及相关的再狭窄。Sarembock，I.J.等，Circulation，84：232(1991)。

据报道，Hirugen是从水蛭素的阴离子羧基末端衍生的肽。据报道，它只与凝血酶结合阴离子的外侧部位结合，因此抑制血纤维蛋白的形成但不抑制已与酶的未封闭的活性部位接近的小的合成底物的催化转化。Maraganore，J.M.等，J.Biol.Chem.，264：8692(1989)；Naski，M.C.等，J.Biol.Chem.，265：13484(1990)。据报道，根据X线晶体分析，水蛭素中由Hirugen代表的结构域直接与凝血酶的外侧部位结合。Skrzypczak-Jankun，E.等，Thromb.Haemostas.，65：830，abstract 507(1991)。而且，据报道，hirugen的结合加强了凝血酶对某些小的合成底物的催化转化，这表明对外侧位置的占据可能伴随着酶活性部位的构象变化。Liu，L.W.等，J.Biol.Chem.，266：16977(1991)。据报道，hirugen还阻滞凝血酶介导的血小板凝聚。Jakubowski，J.A.和Maraganore，J.M.，Blood，75：399(1990)。

现已有一组合成的嵌合分子被命名为hirulog，它们由甘氨酸间隔区连接到肽D-苯丙氨酰-脯氨酰-精氨酸的hirugen样序列构成，这是根据凝血酶的一个最佳底物识别部位合成的。Maraganore等，U.S.专利5,196,404(March 23，1993)。据说，hirugen样序列通过该肽的C末端与肽连接。Maraganone，J.M.等，Biochemistry 29：7095(1990)。已有报道，hirulog类是防止富血纤维蛋白和富血小板性血栓形成的有效抗血栓形成剂。Maraganone，J.M.等，Thromb.Haemostas.，65：651，abastract 17(1991)。

发明概述

本发明涉及新的肽精氨醛类化合物，其中包括内酰胺基，它们是有效的体内和体外凝血酶抑制剂。

所以，一方面，本发明涉及具有以下结构式的化合物：

其中

(a)X选自-S(O)₂-、-N(R′)-S(O)₂-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-NH-C(＝O)-、-P(O)(R″)-和直接连接键，其中的R′是氢原子、1至约4个碳原子的烷基、约6至14个碳原子的芳基或约6至16个碳原子的芳烷基，R″是NR′、OR′、R′、或SR′，条件是R″不是NH、OH、H或SH；

(b)R₁选自(1)1至约12个碳原子的烷基，(2)经约5至8个碳原子的环烷基取代的1至约3个碳原子的烷基，环碳原子可以可选性地被羟基、氨基、胍基、脒基或1至约3个碳原子的烷氧基或烷基所取代，(3)3至约15个碳原子的环烷基，环碳原子可以可选性地被羟基、氨基、胍基、脒基或1至约3个碳原子的烷氧基或烷基所取代，(4)4至约10个环原子的杂环烷基，环原子选自碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮和S(O)_i，其中的i是0、1或2，环碳原子可以可选性地被羟基、1至约3个碳原子的烷氧基或烷基、氨基、胍基或脒基取代，(5)4至约10个环原子的杂环基，环原子选自碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮和S(O)_i，其中的i是0、1或2，环碳原子可以可选性地被羟基、1至约3个碳原子的烷氧基或烷基、氨基、胍基或脒基取代，(6)可以经约5至8个碳原子的环烷基取代的约3至6个碳原子的链烯基，环碳原子可以被羟基、氨基、胍基、脒基或1至约3个碳原子的烷氧基或烷基取代，(7)约6至约14个碳原子的芳基，可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代，(8)5至14个原子的杂芳基，环原子选自碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮和S(O)_i，其中的i是0、1或2，可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代，(9)芳环上可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代的约7至15个碳原子的芳烷基，(10)6至11个原子的杂芳烷基，环原子选自碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮和S(O)_i，其中的i是0、1或2，可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代，(11)芳环上可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代的约8至15个碳原子的芳链烯基，(12)7至12个原子的杂芳链烯基，环原子选自碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮、和S(O)_i，其中的i是0、1或2，可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代，

(17)1至约12个碳原子的全氟烷基，(18)约6至约14个碳原子的全氟芳基，(19)约7至15个碳原子的全氟芳烷基，(20)氢原子，和(21)

，其中

是具有3至6个环碳原子的5至7元的杂环，其中的V是-CH₂-、-O-、-S(＝O)-、-S(O)₂-或-S-，其中的Y₁、Y₂和Y₃是

(i)各自选自氢原子、卤原子、氰基、四唑基、氨基、胍基、脒基、甲基氨基和甲基胍基，-CF₃、-CF₂H、-CF₂CF₃、-CH(CF₃)₂，-C(OH)(CF₃)₂，-OCF₃、-OCF₂CF₃、-OC(O)NH₂、-OC(O)NHZ₁、-OC(O)NZ₁Z₂、-NHC(O)Z₁、-NHC(O)NH₂、-NHC(O)NHZ₁、-NHC(O)NZ₁Z₂、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-C(O)NHZ₁、-C(O)OZ₁、-P(O)₃H、-P(O)₃H₂、-P(O)₃(Z₁)₂、-S(O)₃H、-S(O)_mZ₁、-Z₁、-OZ₁、-OH、-NH₂、-NHZ₁和-NZ₁Z₂，其中m是0、1或2，Z₁和Z₂各自选自1至约12个碳原子的烷基、约6至14个碳原子的芳基、其中有1至约9个碳原子的约5至14个原子的杂芳基、约7至15个碳原子的芳烷基和约6至11个原子的杂芳烷基(其中有约3至9个碳原子)，或

(ii)Y₁和Y₂同为-OC(Z₃)(Z₄)O-，其中Z₃和Z₄各自选自氢原子、1至约12个碳原子的烷基、约6至14个碳原子的芳基、具有1至约9个碳原子的约5至约14个原子的杂芳基、约7至15个碳原子的芳烷基、约6至约11个原子的杂芳烷基(其中有约3至9个碳原子)，

(c)Q是-(CH₂)_n-(其中n是整数1至4)，或-(CH₂)_qR₄-，其中q是1或2，R₄是-S(O)_p-、-O-、-N(R₅)-，其中p是0、1或2，R₅选自氢原子、1至4个碳原子的烷基和1至4个碳原子的酰基；

(d)R₂选自氢原子、1至4个碳原子的烷基或2至4个碳原子的链烯基；和(e)Y选自R₁取代基，条件是Y不是

以及它们的药学上认可的盐。

在诸多因素中，本发明是基于我们的发现，即本发明的新化合物作为体内和体外凝血酶选择性抑制剂具有活性。此外，我们发现，本发明的某些化合物显示特别好的选择性，它们是凝血酶的高效抑制剂，但在抑制血纤维蛋白溶酶方面没有活性或活性明显较低(低几个数量级)并且其抑制胰蛋白酶的活性明显较低。这种抑制凝血酶的选择性使得这些化合物在治疗或预防可能有异常血栓形成的情况的哺乳动物体内的血栓形成方面具有突出的治疗优点。

已有报道，肽基精氨醛以平衡结构存在于水溶液中。BajHsz，S.等，J.Med.Chem.，33：1729(1990)。这些结构，见下文，包括精氨醛A，水合醛B，和两个氨基环醇形式，C和D。R基团代表本发明某一给定的具体化合物的其余部分。本发明的肽醛包括其定义内的所有平衡形式。

另一方面，本发明涉及含有治疗有效量的本发明的化合物和药学上认可的载体的药物组合物。

再一方面，本发明涉及使用本发明的化合物和药物组合物预防可能有异常血栓形成的情况的哺乳动物体内的血栓形成的方法，此方法包括对所述哺乳动物给以治疗有效量的本发明化合物或含有此化合物的药物组合物。定义

根据本发明，在本文中，除非另作说明，以下术语具有以下定义，

“链烯基”指具有至少一个双键的不饱和脂肪族基团。

“烷基”指直链、支链或环状的饱和脂肪族基团。

“烷基氧”和“烷氧基”指结构式为R-O-的基团，其中的R是烷基。

“烷氧羰基”指-C(O)OR，其中的R是烷基。

“芳链烯基”指经芳基取代的链烯基。

“芳烷基”指经芳基取代的烷基。合适的芳烷基有苄基、吡啶甲基等，它们可以是经取代的。

“芳基”指具有至少一个有共轭π电子体系的环的芳香族基团，包括碳环芳基、杂环芳基和联芳基，它们都可以是经取代的。

“芳氧基”指结构式为R-O-的基团，其中的R是芳基。

“芳烷氧基”指结构式为R-O-的基团，其中的R是芳烷基。

“氨基酸”指天然氨基酸、非天然氨基酸，和具有立体异构体的氨基酸的D型和L型立体异构体类似物。天然氨基酸为丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。非天然氨基酸包括但不限于氮杂环丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基异丁酸、锁链赖氨素、2，2′-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链赖氨素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸和2-哌啶酸。氨基酸类似物包括被可逆或不可逆地化学保护的，或在N末端氨基或侧链基团被修饰的天然和非天然氨基酸，例如甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、S-(羧基甲基)-半胱氨酸、S-(羧基甲基)-半胱氨酸亚砜和S-(羧基甲基)-半胱氨酸砜。

“氨基酸类似物”指C末端羧基或N末端氨基，或者侧链官能团被修饰成其它官能团的氨基酸。例如，天冬氨酸-(β-甲基酯)是天冬氨酸的氨基酸类似物；N-乙基甘氨酸是甘氨酸的氨基酸类似物；或丙氨酸羧酰胺是丙氨酸的氨基酸类似物。

“氨基酸残基”指如下结构式的基团：(1)-C(O)-R-NH-，其中的R通常是-CH(R′)-，其中的R′是H或含碳的取代基；或(2) ，其中p是1、2或3，分别表示氮杂环丁烷羧酸、脯氨酸或2-哌啶酸基。

“联芳基”指在与苯环连接点的邻位、间位或对位被在此定义的碳环或杂环芳基取代的苯基。

“盐水”指氯化钠饱和水溶液。

“碳环芳基”指芳香环上的环原子是碳原子的芳香族基团。碳环芳基包括单环碳环芳基和萘基，都可以是经取代的。合适的碳环芳基为苯基和萘基。合适的取代碳环芳基为被1至2个取代基(以低级烷基、羟基、低级烷氧基、低级烷氧基羰基、卤原子、三氟甲基、硝基和氰基为宜)取代的茚和苯基。取代萘基指被低级烷基、低级烷氧基或卤原子取代的1-或2-萘基。

“环烯基”指环状烯基。合适的环烯基有，例如环戊烯基和环己烯基。

“环烷基”指环状烷基。合适的环烷基有，例如环己基、环丙基、环戊基和环庚基。

“环己基甲基”指与CH₂连接的环己基。

“卤原子”指氟、氯、溴和碘。

“杂芳基链烯基”指被杂芳基取代的链烯基，并且包括“Handbook of Chem-istry and Physics”，第49版，1968，R.C.Weast编；The Chemical Rubber Co.，Cleveland，OH中所述的那些杂环体系。特别参见Rules for Naming OrganicCompounds，B.Fundamental Heterocyclic Systems中的C部分。

“杂芳烷基”指被杂芳基取代的烷基，并包括“Handbook of Chemistry andPhysics”，第49版，1968，R.C.Weast编；The Chemical Rubber Co.，Cleve-land，OH中所述的那些杂环体系。特别参见Rules for Naming Organic Com-pounds，B.Fundamental Heterocyclic Systems中的C部分。

“杂芳基”指具有1至9个碳原子，而其它原子为杂原子的芳基，并包括“Handbook of Chemistry and Physics”，第49版，1968，R.C.Weast编；TheChemical Rubber Co.，Cleveland，OH中所述的那些杂环体系。特别参见Rules for Naming Organic Compounds，B.Fundamental Heterocyclic Systems中的C部分。合适的杂原子为氧、氮、S(O)_i，其中的i是0、1或2，合适的杂环芳基为呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等。

“杂环”指由碳原子、氮原子、氧原子和/或硫原子构成的被还原的杂环体系，并包括“Handbook of Chemistry and Physics”，第49版，1968，R.C.Weast编；The Chemical Rubber Co.，Cleveland，OH中所述的那些杂环体系。特别参见Rules for Naming Organic Compounds，B.Fundamental Heterocyclic Systems中的C部分。

“杂环烷基”指被杂环取代的烷基，并包括“Handbook of Chemistry andPhysics”，第49版，1968，R.C.Weast编；The Chemical Rubber Co.，Cleve-land，OH中所述的那些杂环体系。特别参见Rules for Naming Organic Com-pounds，B.Fundamental Heterocyclic Systems中的C部分。

“低级”在此指有机基团或化合物含有少于等于5，以少于等于4为佳，最好是1个或2个碳原子。这种基团可以是直链或支链的。

“全氟烷基”指每一个氢原子都被氟原子取代的烷基。

“全氟芳基”指每一个氢原子都被氟原子取代的芳基。

“全氟芳烷基”指其中芳基部分的每一个氢原子都被氟原子取代的芳烷基中。

“药学上认可的盐”指本发明化合物与某有机酸或无机酸组合而成的盐。实际上，使用盐形式即使用碱形式。本发明化合物的游离碱形式和盐形式都可用，两种形式都被认为包括在本发明的范围之内。

“Arg-al”指结构式如下的L-精氨醛残基：

“Arg-ol”指结构式如下的L-精氨醇残基：

“盐酸(S)-N^g-硝基精氨醇”指结构式如下的化合物：

“N-α-叔丁氧基羰基-N^g-硝基-L-精氨酸”指结构式如下的化合物：

“高Ala(环)-Gly”指结构式如下的(S)-3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸残基：

“正Val(环)-Gly”指结构式如下的(S)-3-氨基-2-氧代-1-哌啶乙酸残基

“正Leu(环)-Gly”指结构式如下的(R)-或(S)-3-氨基-2-氧代-六氢-1-氮杂乙酸残基：

此外，以下缩写的意义分别为：

“Boc”指叔丁氧基羰基。

“BzlSO₂”指苄基磺酰基。

“Cbz”指苄氧基羰基。

“DCC”指N，N′-二环己基碳化二亚胺。

“EDC”指1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺盐酸盐。

“HBTU”指2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓(uronium)六氟磷酸盐。

“HCl”指盐酸。

“HPLC”指高压液相色谱。

“HOBt”指一水合1-羟基苯并三唑。

“i-Pr”指异丙基。

“LiAlH₄”指氢化锂铝。

“LiAlH₂(OEt)₂”指二乙氧基二氢化锂铝。

“Me”指甲基。

“Oet”指乙氧基。

“THF”指四氢呋喃。

“TLC”指薄层色谱。

附图说明

图1是制备用于合成本发明化合物的一中间体的反应图解。图中，“i”到“iv”是：i)氢气，10％钯碳；ii)二羟乙酸；iii)氢气，10％钯碳；iv)50-60℃，N，N-二甲基甲酰胺。

图2是制备用于合成本发明化合物的一中间体的反应图解。图中，“i”到“iii”是：i)HOBt，DCC和三乙胺；ii)甲基碘；iii)依次为氢化钠、乙酸乙酯和水。

图3是合成本发明某些化合物的一较好的反应图解。图中，“i”到“v”是：i)HOBt，EDC和4-甲基吗啉；ii)1N溶于乙酸乙酯的HCl；iii)碳酸钾，R₁-SO₂Cl，其中的R₁如本文所定义；iv)氢气，10％钯碳；v)二甲基亚砜，甲苯，二氯乙酸和EDC。

图4是合成本发明某些化合物的一较好的反应图解。图中，“i”到“vi”是：i)HCl饱和的甲醇；ii)三乙胺，R-SO₂Cl，其中的R是烷基、芳基或芳烷基；iii)1.0M的氢氧化锂；iv)HOBt，N，N-二异丙基乙基胺，EDC；v)氢气，10％钯碳；vi)3N的HCl。

图5表示的是利用活化部分凝血活酶时间(APTT)测定法在加柠檬酸盐的大鼠(●)和人(m)血浆中测定的BzlSO₂-正Val(环)-Gly-Arg-al的抗凝血作用。鼠和人血浆的对照凝固时间(0抑制剂)分别是20秒和28秒。在大鼠和人血浆中使对照凝固时间增加一倍的BzlSO₂-正Val(环)-Gly-Arg-al浓度分别是22.1μM和12.8μM。其中的数据是两次独立测定的平均值。

图6是制备本发明化合物的一个较好的反应图解。图中，i)-x)是：i)在四氢呋喃和水中的二碳酸二叔丁酯，碳酸氢钠；ii)双(三甲基甲硅烷基)胺基锂和四氢呋喃；iii)溴乙酸苄酯；iv)氯化铵；v)HCl和乙酸乙酯；vi)三乙胺，乙腈和R₁-SO₂-Cl，其中的R₁定义同上；vii)氢、钯碳和乙醇；viii)乙腈，N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇盐酸盐，一水合1-羟基苯并三唑，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N，N-二异丙基乙基胺；ix)氢气，钯碳，乙醇，乙酸和水；x)3N的HCl和HPLC纯化。

图7表示利用活化部分凝血活酶时间(APTT)测定法在加柠檬酸盐的人血浆中[实心圆(●)]测定的N-(BnSO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛的抗凝血作用。人血浆的对照凝固时间(O抑制剂)为29秒。在人血浆中使对照凝固时间增加一倍的N-(BnSO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛浓度是4.5μM。其中的数据是两次独立测定的平均值。

图8是一制备本发明某些化合物的较好的反应图解。图中，i)-v)是：i)氢气和钯碳；ii)N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇盐酸盐，一水合1-羟基苯并三唑，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N，N-二异丙基胺；iii)氢气和乙醇中的钯碳，乙酸和水；iv)3N的HCl；v)HPLC纯化，以三氟乙酸在乙腈和水中的0.1％溶液洗脱。

图9是制备本发明某些化合物的较好的反应图解。图中，i)-vii)是：i)氢化钠；ii)甲基碘；iii)氢气和钯碳；iv)N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇盐酸盐，一水合1-羟基苯并三唑，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N，N-二异丙基胺；v)氢气和乙醇中的钯碳，乙酸和水；vi)3N的HCl；vii)HPLC纯化，以三氟乙酸在乙腈和水中的0.1％溶液洗脱。

图10是实施例46至55所述，制备化合物30的较好的反应图解。图中，各步骤为：由(20)合成(21)中：1.H₂，Pd/C，35PSI，MeOH，H₂O，HOAc，2.5小时；2.OHCCO₂H，室温，20小时；3.H₂，Pd/C，40PSI，37小时；4.DMF，50-60℃，2.5小时；5.提取，总得率67％。由(21)合成(23)中：1.EtOH，HCl，0℃至室温，定量得率的(22)；2.PhCHO，Et₃N，MgSO₄，CH₂Cl₂，0℃至室温，(23)的得率为89％。由(23)合成(24)中：KOtBu，THF，BnBr，于室温左右，得率89％。由(24)合成(26)：1.1N的HCl，室温下2-4小时；2.EtOH，HCl，0℃至室温，(25)的得率为96％；3.Boc₂O，NaHCO₃，THF，H₂O，(26)得率77％。由(26)合成(27)：1.LiOH，EtOH，H₂O，0℃至室温；2.Dowex H⁺，(27)得率98％。由(27)合成(29)：1.H-Arg(NO₂)OEt胺醛，EDC，HOBt，DIPEA，CH₃CN，(28)得率67％；2.H₂，Pd/C，60PSI，(29)得率为定量。由(29)合成(30)：1.3N的HCl，室温，3小时；2.HPLC，(30)得率12％。

图11是实施例56至64所述，制备化合物(39)较好的反应图解。图中，各步骤如下：合成(32)：1.PhCHO，苯，回流，脱H₂O，(31)得率为定量得率；2.LiN(TMS)₂，THF，室温，2小时；3.BnBr，0℃至室温，22小时，重结晶得48％。由(32)合成(34)：1.1N的HCl，室温，5小时，得(33)；2.Cbz-OSu，NaHCO₃，THF，H₂O，0℃至室温，14小时，总得率79％。由(34)合成(35)：1.LiN(TMS)₂，THF，室温，30分钟；2.BrCH₂CO₂t-Bu，室温，20小时；3.NH₄Cl，H₂O，(35)得率60％。由(35)合成(38)：1.TFA，CH₂Cl₂，0℃至室温，得率80％；2.HCl-Arg(NO₂)OEt胺醛，EDC，HOBT，DIPEA，室温，CH₃CN，18小时，(37)得率73％；3.H₂，Pd/C，55PSI，EtOH，HOAc，H₂O，(38)得率99％。由(38)合成(39)：1.3N的HCl，室温，3小时；2.HPLC，(39)得率36％。

图12是实施例65至72所述，制备化合物(47)的较好的反应图解。图中，各步骤如下：由(21)合成(41)：1.BnBr，K₂CO₃，DMF，CH₃CN，回流，得率96％；2.5N的HCl，EtOAc，室温，3小时，(41)得率为定量。由(41)合成(42)：PhCH₂CHO，Na(OAc)₃BH，三乙胺，DCE，室温，(42)得率66％。由(42)合成(44)：1.Boc₂O，NaHCO₃，THF，H₂O，室温，1.5小时，(43)得率70％；2.H₂，Pd/C，MeOH，45PSI，2小时，(44)得率98％。由(44)合成(45)：H-Arg(NO₂)OEt胺醛，EDC，HOBt，DIPEA，CH₃CN，室温，20小时，(45)得率99％。由(45)合成(47)：1.H₂，Pd/C，EtOH，HOAc，H₂O，45PSI，得(46)；2.3N的HCl，室温，3小时；3.HPLC得(47)。

图13是实施例73至80所述，制备化合物(56)的较好的反应图解。图中，各步骤如下：由(48)合成(50)：1.LiN(TMS)₂，THF，室温；2.BrCH₂CO₂Et，室温，18小时，(49)得率83％；3.HCl，EtOH，0℃至室温，(50)得率96％。由(50)合成(51)：PhCH₂CHO，Na(OAc)₃BH，Et₃N，室温，(51)得率69％。由(51)合成(53)：1.Boc₂O，NaHCO₃，THF，H₂O，(52)得率84％；2.LiOH，EtOH，H₂O，0℃至室温；3.Dowex H⁺，(53)得率94％。由(53)合成(54)：H-Arg(NO₂)OEt胺醛，EDC，HOBt，DIPEA，CH₃CN，室温，18小时，(54)得率71％。由(54)合成(56)：1.H₂，Pd/C，EtOH，HOAc，H₂O，50PSI，(55)得率为定量；2.3N的HCl，室温，3小时；3.HPLC，(56)得率77％。

详细说明1.优选化合物

本发明化合物具有以下结构式：其中

(a)X选自-S(O)₂-、-N(R′)-S(O)₂-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-NH-C(＝O)-、-P(O)(R″)-和直接连接键，其中的R′是氢原子、1至约4个碳原子的烷基、约6至14个碳原子的芳基或约6至16个碳原子的芳烷基，R″是NR′、OR′、R′、或SR′，条件是R“不是NH、OH、H或SH；

(b)R₁选自(1)1至约12个碳原子的烷基，(2)经约5至8个碳原子的环烷基取代的l至约3个碳原子的烷基，环碳原子可以可选性地被羟基、氨基、胍基、脒基或1至约3个碳原子的烷氧基或烷基所取代，(3)3至约15个碳原子的环烷基，环碳原子可以可选性地被羟基、氨基、胍基、脒基或1至约3个碳原子的烷氧基或烷基所取代，(4)4至约10个环原子的杂环烷基，环原子选自碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮和S(O)_i，其中的i是0、1或2，环碳原子可以可选性地被羟基、1至约3个碳原子的烷氧基或烷基、氨基、胍基或脒基取代，(5)4至约10个环原子的杂环基，环原子选自碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮和S(O)_i，其中的i是0、1或2，环碳原子可以可选性地被羟基、1至约3个碳原子的烷氧基或烷基、氨基、胍基或脒基取代，(6)可以经约5至8个碳原子的环烷基取代的约3至6个碳原子的链烯基，环碳原子可以被羟基、氨基、胍基、脒基或1至约3个碳原子的烷氧基或烷基取代，(7)约6至约14个碳原子的芳基，可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代，(8)5至14个原子的杂芳基，环原子选自碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮和S(O)_i，其中的i是0、1或2，可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代，(9)芳环可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代的约7至15个碳原子的芳烷基，(10)6至11个原子的杂芳烷基，环原子为碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮和S(O)_i，其中的i是0、1或2，可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代，(11)芳环可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代的约8至15个碳原子的芳链烯基，(12)7至12个原子的杂芳链烯基，环原子为碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮、和S(O)_i，其中的i是0、1或2，可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代，

(17)1至约12个碳原子的全氟烷基，(18)约6至约14个碳原子的全氟芳基，(19)约7至15个碳原子的全氟芳烷基，(20)氢原子，和(21) 其中 是具有3至6个环碳原子的5至7元的杂环，其中的V是-CH₂-、-O-、-S(＝O)-、-S(O)₂-或-S-，其中的Y₁、Y₂和Y₃是

(i)各自选自氢原子、卤原子、氰基、四唑基、氨基、胍基、脒基、甲基氨基和甲基胍基，-CF₃、-CF₂H、-CF₂CF₃、-CH(CF₃)₂，-C(OH)(CF₃)₂、-OCF₃、-OCF₂CF₃、-OC(O)NH₂、-OC(O)NHZ₁、-OC(O)NZ₁Z₂、-NHC(O)Z₁、-NHC(O)NH₂、-NHC(O)NHZ₁、-NHC(O)NZ₁Z₂、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-C(O)NHZ₁、-C(O)OZ₁、-P(O)₃H、-P(O)₃H₂、-P(O)₃(Z₁)₂、-S(O)₃H、-S(O)_mZ₁、-Z₁、-OZ₁、-OH、-NH₂、-NHZ₁和-NZ₁Z₂，其中m是0、1或2，Z₁和Z₂各自选自1至约12个碳原子的烷基、约6至14个碳原子的芳基、其中有1至约9个碳原子的约5至14个原子的杂芳基、约7至15个碳原子的芳烷基和约6至11个原子的杂芳烷基(其中有约3至9个碳原子)，或

(ii)Y₁和Y₂同为-OC(Z₃)(Z₄)O-，其中Z₃和Z₄各自选自氢原子、1至约12个碳原子的烷基、约6至14个碳原子的芳基、具有1至约9个碳原子的约5至约14个原子的杂芳基、约7至15个碳原子的芳烷基、约6至约11个原子的杂芳烷基(其中有约3至9个碳原子)，

(c)Q是-(CH₂)_n-(其中n是整数1至4)，或-(CH₂)_qR₄-，其中q是1或2，R₄是-S(O)_p-、-O-、-N(R₅)-，其中p是0、1或2，R₅选自氢原子、1至4个碳原子的烷基和1至4个碳原子的酰基；

(d)R₂选自氢原子、1至4个碳原子的烷基或2至4个碳原子的链烯基；和(e)Y选自R₁取代基，条件是Y不是 以及它们的药学上认可的盐。

较好的X基团有直接连接键，-SO₂-，-NH-S(O)₂-，和-N(R′)-S(O)₂-。特别好的X基团是直接连接键和-SO₂-。

较好的R₁基团是烷基、芳烷基和芳基。合适的芳基包括取代或未取代的苯基和萘基。较好的芳环取代基是-C(O)OH，-C(O)OZ₁，-CH₃，-OCH₃和-CF。以间位和/或邻位的取代为佳。特别好的R₁基团是芳烷基。具体的较好的R₁基团包括取代或未取代的苄基。环己基和环己基甲基是尤其好的R₁基团。

较好的化合物中Q是-(CH₂)₂-或-(CH₂)₃-。较好的R₂基团包括氢原子。

较好的Y基团选自

(1)氢原子，

(2)苯基-(CH₂)_i-，其中的i是整数O至3，苯基可以如前所述分别被Y₁，Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代，

(3)杂芳基-(CH₂)_i-，其中的i是整数0至3，杂芳基可以如前所述分别被Y₁，Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代，

(4)杂环烷基-(CH₂)_i-，其中的i是整数0至3，杂环烷基可以被羟基、1至约3个碳原子的烷氧基或烷基取代，

(5)C₅至C₈环烯基，可以被如下所述的Z₅，Z₆和/或Z₇取代，

(6)C₅至C₈环烷基，可以分别被Z₅，Z₆和/或Z₇单取代、二取代或三取代，其中Z₅，Z₆和/或Z₇各自选自-R₆，OR₆，和-CO₂R₆，其中的R₆选自氢原子、甲基或1-3个碳原子的烷基，

(7)-(CH₂)_b-Z₅，其中的b是整数0至6，Z₅如上定义。

更好的Y基有芳烷基和环烷基。特别好的是经取代或未取代的苄基和1-萘基甲基。较好的芳环取代基有-C(O)OH，-C(O)OZ₁，-CH₃，-OCH₃和-CF₃。以间位和/或邻位的取代为佳。较好的环烷基具有5-8个环碳原子。较好的环烷基取代基有-C(O)OH，-C(O)OZ₁，-CH₃，-OCH₃。

一类特别好的结构式I化合物中，X是-S(O)₂-，R₁是取代或未取代的芳烷基，Q是-(CH₂)₂-，R₂是氢原子。一类很好的化合物中R₁是取代或未取代的苄基。

另一类特别好的化合物中，X是-S(O)₂-，R₁是取代或未取代的芳烷基，Q是-(CH₂)₃-，R₂是氢原子。一类很好的化合物中R₁是取代或未取代的苄基。

实施例8(和18)，26，34，36(a)至36(y)，40(b)，55，64，72(a)至72(b)，80和82(a)至28(f)中描述了本发明优选化合物的合成方法。

尤其好的本发明化合物有N-苄基磺酰-正Val(环)-Gly-L-精氨醛(实施例8，18)，N-(正Val(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例40(b))，D，L-α-苄基-正Val(环)-Gly-L-精氨醛(实施例55)，D，L-α-苄基-正Leu(环)-Gly-L-精氨醛(实施例64)，N-(1-萘基-SO₂-正Val(环)-Gly-L-精氨醛(实施例82a)，N-(BnSO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例34)，N-(2-甲氧羰基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例36(e))，N-(2-三氟甲基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例36(g))，N-(环己基甲基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例36(i))，N-(2-噻吩甲基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例36(k))，N-(苯基氨基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例36(n))，N-(3-甲氧羰基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例36(o))，N-(3-三氟甲基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例36(p))，N-(2-甲基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例36(q))，N-(3-甲基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例36(r))，N-(3-甲氧基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例36(t))，N-(2-氯苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例36(u))，N-(2-甲基-5-氟苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例36(w))，N-(2-甲基-5-甲氧基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例36(x))，N-〔(S)-3-N-苯基乙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酰〕-L-精氨醛(实施例72a)，N-〔(S)-3-N-苯基丙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酰〕-L-精氨醛(实施例72b)，N-〔(S)-3-N-苯基乙基氨基-六氢-2-氧代-氮杂-1-乙酰〕-L-精氨醛(实施例80)。

另一方面，本发明涉及结构式I化合物的盐。“盐”根据其定义包括由本发明的化合物与某有机酸或无机酸组合而成的本发明化合物的盐。实际上，使用盐形式即使用碱形式。本发明化合物既可以以游离碱的形式使用也可以以盐形式使用，两种形式都被认为包括在本发明范围之内。这些盐包括酸加成盐，例如三氟乙酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、苯磺酸盐以及其它合适的酸加成盐。

结构式I中，带有R₂和Y基团的碳原子能够形成立体异构体。本发明将两类立体异构体都考虑在内。2.优选化合物的制备

某些特定的本发明的中间体被用于制备本发明的化合物。例如，实施例1的(S)-3-〔(叔丁氧基羰基)氨基〕-2-氧代-1-哌啶乙酸，实施例21的(S)-3-〔(叔丁氧基羰基)氨基〕-2-氧代-1-吡咯烷乙酸，和实施例28的(S)-3-〔(叔丁氧基羰基)氨基〕-2-氧代-1-六氢氮杂乙酸苄酯。

图1例举了制备用于制备本发明化合物的优选中间体3的优选反应图解。实施例提供了此图解的具体细节。

如图1所示，N-α-Boc-N-δ-苄氧基羰基-L-鸟氨酸1经氢气和钯碳加氢生成2，然后2与二羟乙酸反应，用氢气和钯碳加氢，并加热至高温，生成3。

图2例举了制备用于制备本发明化合物的优选中间体2-5的优选反应图解。实施例19至21提供了该图解的细节。

如图2所示，利用碳化二亚胺和HOBt将N-α-Boc-L-甲硫氨酸2-1与盐酸甘氨酸甲酯2-2偶联成2-3。利用甲基碘烷基化2-3甲硫氨酸侧链上的硫原子，生成2-4。最后，2-4与氢化钠反应而环化成2-5。

可以利用图3和图4中的优选反应图解来制备本发明的化合物。实施例2至8提供了图3的细节，实施例9至18提供了图4的细节。

在两张图解中，中间体，包括图1和图2中的2-3和2-5，分别与精氨醛基团偶联，最终生成本发明化合物。

例如，如图3所示，3-3利用碳化二亚胺与盐酸(S)-N^g-硝基精氨醇3-4(如实施例2至3所述，由(S)-N-α-Boc-N^g-硝基精氨酸制得)偶联，生成3-5。3-5与氯化氢反应，去除Boc基团，得盐酸盐3-6，然后3-6与磺酰氯(R₁-S(O)₂-Cl)反应得3-7。R₁定义见文中。3-7经氢气和钯碳加氢脱去N^g-硝基基团，然后用二甲基亚砜、二氯乙酸、甲苯和EDC氧化羟基，得3-8。

或者，如图4所示，3-3在醇中与饱和的HCl反应脱去其Boc基团并将其羧基转化为酯，然后其游离的氨基与磺酰氯(R_i-S(O)₂-Cl)反应得4-9。R₁定义见前文。4-9碱水解生成具有一游离羧基的4-10。利用碳化二亚胺将4-10与4-11(制备见实施例12至15)偶联得4-12。4-12经氢气和钯碳加氢得4-13。4-13在酸水溶液中水解也得到3-8。

优选的化学偶联方法(例如，图3中的2-3至3-5偶联或图4中的4-10至4-12偶联)即本领域已知的利用常规偶联剂形成肽键。参见Bodanszky，N.，Peptide Chemistry，pp.55-73，Springer-Verlag，New York(1988)和在此引用的参考文献。化学偶联可以是一步偶联也可以是两步偶联。在一步偶联中，两部分直接偶联。用于一步偶联的较好的偶联剂有DCC和HOBt，EDC和HOBt，HBTU或TBTU。在两步偶联中，在与偶联的另一方偶联之前，先由偶联一方的C末端羧基形成被活化的酯或酸酐。

还可以由图6中的优选反应图解来制备本发明的化合物。实施例12至15和27至34提供了此优选图解的细节。

如图6所示，D-(α)-或L-(-)-α-氨基-ε-己内酰胺6-1通过与二碳酸二叔丁酯和碳酸氢钠在THF和水中反应，保护其中的胺，生成6-2，6-2然后在THF中与双(三甲基甲硅烷基)胺基锂反应，接着再与溴乙酸苄酯反应。此反应以饱和氯化铵溶液终止，得6-3。

6-3在乙酸乙酯中与5N的HCl反应脱去其Boc保护基，得盐酸盐6-4，6-4然后在乙腈中与三乙胺和R₁SO₂Cl反应，得磺酰胺6-5。然后，6-5在Parr振荡器中经氢气和钯碳加氢得6-6。6-6用碳化二亚胺与N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇盐酸盐(制备见实施例12至15)偶联得6-7。

然后在乙醇、水和乙酸中经氢气和钯碳加氢脱去6-7的N^g-硝基得6-8。然后，6-8与3N的HCl反应得6-9。

图8和图9是合成本发明化合物的一优选反应图解，其中的X是一直接连接键，由此在结构式II中R₁与氮原子直接连接。如图8所示，(S)-3-〔(叔丁氧基羰基)氨基〕-2-氧代-六氢-1-氮杂乙酸苄酯6-3通过在Parr振荡器中于40PSI反应而去保护得酸8-10。利用一水合1-羟基苯并三唑，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐，然后是N，N-二异丙基胺将8-10与N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇偶联，得8-11。用氢气和钯碳在乙醇、水和乙酸中在50PSI脱去8-11的N^g-硝基。此反应生成乙酸盐8-12。8-12的乙基环醇基经3N的HCl水解，再用0.1％三氟乙酸的乙腈和水的溶液经HPLC纯化得8-13。图9的区别在于(S)-3-〔(叔丁氧基羰基)氨基〕-2-氧代-六氢-1-氮杂乙酸苄酯首先与氢化钠再与甲基碘反应生成烷基化Boc保护的胺14。14再经去保护得15，15再与图8中的酸8-10一样进行相同的反应。图9中的方法说明的是制备X直接与R₁成键，R₁不是氢原子的化合物的方法。

图10是一个优选化合物的合成方法。中间体20经催化加氢，与二羟乙酸缩合，催化再加氢，形成的中间体再在温热的二甲基甲酰胺中热脱水，得内酰胺21。21与干燥氯化氢在乙醇中反应，除去Boc保护基团的同时羧基酯化，生成氨基酯盐酸盐22。在三乙胺之类的碱存在下，使用硫酸镁之类的脱水剂，22与苯甲醛缩合得亚胺衍生物23。用选择性碱，例如叔丁醇钾、N，N-二异丙基胺基锂或双(三甲基甲硅烷基)胺基锂使中间体23去质子化，再与苄基溴反应得烷基化化合物24。24在环境温度下用稀盐酸水解2至4小时，并用无水乙醇和干燥氯化氢部分酯化，得25。在THF中，在饱和碳酸氢钠存在下用二碳酸二叔丁酯重新保护25的游离氨基，得26。在醇的水溶液中，用强碱，例如氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾水解26，再用强酸性阳离子交换树脂，例如Dowex(注册商标)50WX8-400质子化，得N-Boc-保护的内酰胺羧酸中间体27。在乙腈之类的惰性溶剂中，在环境温度下，利用EDC、HOBt和N，N-二异丙基乙基胺进行27与N^g-硝基-精氨醛乙基环醇的标准肽偶联，得28。在乙醇、乙酸和水中，利用钯碳催化剂对28催化加氢，得乙酸盐前体29。最后，在环境温度下用稀盐酸水解，再经HPLC纯化得新的目标化合物30。

图11显示一个优选化合物的合成方法，它是化合物30的7元环类似物。α-氨基-ε-己内酰胺在共沸回流的苯溶液中与苯甲醛缩合得亚胺31。用选择性碱，例如叔丁醇钾、N，N-二异丙基胺基锂或双(三甲基甲硅烷基)胺基锂将31去质子化，然后与苄基溴反应得烷基化化合物32。在环境温度下用稀盐酸水解32得胺盐酸盐33。33在THF水溶液中与N-(苄基氧羰基氧)-琥珀酰亚胺和碳酸氢钠反应以保护氨基，得N-Cbz-内酰胺中间体34。使用有位阻的碱，例如双-(三甲基甲硅烷基)胺基锂，并加入溴乙酸叔丁酯，对34选择性地去质子化20小时，然后用氯化铵终止反应，得产物35。在0℃至室温，在二氯甲烷中，用三氟乙酸切除35中的叔丁酯部分，得羧酸衍生物36。在乙腈之类的惰性溶剂中，在环境温度下，利用EDC、HOBt和N，N-二异丙基乙基胺进行36与N^g-硝基-精氨醛乙基环醇的标准肽偶联，得37。在乙醇、乙酸和水中，利用钯碳催化剂对37催化加氢，得乙酸盐前体38。最后，在环境温度下，用稀盐酸水解38，再经HPLC纯化得新的目标化合物39。

图12显示了结构式I为基础的另一种结构的实例的合成方法。化合物21，制备见前文，在回流乙腈中与无水碳酸钾和苄基溴反应而酯化得40。在乙酸乙酯中与无水氯化氢反应，选择性地切除40的Boc保护基，得盐酸胺41。在惰性溶剂，如1，2-二氯乙烷中，用三乙酰氧基硼氢化钠和三乙胺进行盐41和苯基乙醛的还原胺化反应生成胺衍生物42。在THF中，在饱和碳酸氢钠存在下，与二碳酸二叔丁酯反应以保护42的氨基，得43。利用钯碳对43催化加氢得羧酸44。在乙腈之类的惰性溶剂中，在环境温度下，利用EDC、HOBt和N，N-二异丙基乙基胺进行44与N^g-硝基-精氨醛乙基环醇的标准肽偶联，得45。在乙醇、乙酸和水中，利用钯碳催化剂对45催化加氢，得乙酸盐前体46。最后，在环境温度下，用稀盐酸水解46，再经HPLC纯化得新的目标化合物47。

图13描绘一个优选化合物的合成方法，它是目标化合物47的7元环类似物。化合物48，制备见前文(相当于图6中的6-2)，与有位阻的碱，例如双-(三甲基甲硅烷基)胺基锂反应，并用溴乙酸乙酯烷化得49。在乙醇中用氯化氢切除49的Boc基团，得胺盐酸盐衍生物50。在惰性溶剂，如1，2-二氯乙烷中，用三乙酰氧基硼氢化钠和三乙胺进行的50和苯基乙醛的还原胺化反应生成胺衍生物51。在THF中，在饱和碳酸氢钠存在下，与二碳酸二叔丁酯反应保护51中的氨基，得52。在醇水溶液中，用强碱，例如氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾水解52，再用强酸性阳离子交换树脂，例如Dowex(注册商标)50WX8-400质子化，得N-Boc-保护的内酰胺羧酸中间体53。在乙腈之类的惰性溶剂中，在环境温度下，利用EDC、HOBt和N，N-二异丙基乙基胺进行53与N^g-硝基-精氨醛乙基环醇的标准肽偶联，得54。在乙醇、乙酸和水中，利用钯碳催化剂对54催化加氢，得乙酸盐前体55。最后，在环境温度下，用稀盐酸水解55，再经HPLC纯化得新的目标化合物56。

对于本发明中具有被卤原子，氰基、硝基或-S-Z₁取代的链烯基、杂环基或芳基的化合物，最好避免使用氢气和钯碳。取而代之的是，最好使用三(三氟乙酸)硼(B(OCOCF₃)₃)来切除精氨酸基团中的N^g-硝基。此试剂由BBr₃和CF₃COOH在二氯甲烷中在0℃反应制备。此试剂也可购置。通常，N^g-硝基化合物与三(三氟乙酸)硼在0℃，在三氟乙酸中反应。Fieser，M.和Fieser，L.F.，Reagents for Organic Synthesis，p.46，John Wiley & Sons，New York(1974)；Pless，J.，和Bauer，W.Angew.Chem.，Internat.Ed.，12，147(1973)。

此外，选择性切除硝基的另一种较好的试剂是三氯化钛。此试剂是可购置的。N^g-硝基化合物与三氯化钛在含乙酸铵缓冲液的甲醇水溶液中反应，再令此反应混合物与空气或二甲基亚砜接触。Freidinger，R.M.，Hirschmann，R.，和Veber，D.F.，J.Org.Chem.，43，4800(1978)。

更好的方法是，L-精氨醛使用二-N-叔丁氧基羰基保护基保护不适应用钯碳进行加氢的基团。例如，α-N-苄氧基羰基-ω，ω′-二-N-叔丁氧基羰基精氨酸溶于乙腈，与羟基苯并三唑和1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺盐酸盐反应生成α-N-苄氧基羰基-ω，ω′-二-N-叔丁氧基羰基-L-精氨酸内酰胺。此内酰胺在-70℃，在THF中，被LiAlH₄还原成α-N-苄氧基羰基-ω，ω′-二-N-叔丁氧基羰基-L-精氨醛。此醛与乙醇和HCl反应，被以醛缩二乙醇的形式保护。用氢气和钯碳去除N-苄氧基羰基保护基，得ω，ω′-二-N-叔丁氧基羰基-L-精氨醛缩二乙醇HCl盐。然后可通过与N-羟基苯并三唑和1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺HCl盐反应将保护后的L-精氨醛部分与要求的羧酸偶联。在0℃，在乙腈中与六氟磷酸反应，脱去醛缩二乙醇和二Boc保护基。加2.5M乙酸钠水溶液，直至pH4，终止此反应。将混合物滤过2微米的滤膜。以10-40％乙腈水溶液-0.1％CF₃COOH经制备HPLC，得按要求取代的L-精氨醛化合物的三氟乙酸盐。3.优选混合物的筛选

如下文所述，本发明的化合物就其抑制凝血酶、血纤维蛋白溶酶、重组组织血纤维蛋白溶酶原活化剂(rt-PA)、活性蛋白C(aPC)、胰凝乳蛋白酶、fXa和胰蛋白酶的能力进行筛选。某些优选化合物的特殊之处在于它们能够抑制凝血酶，而基本上不抑制血纤维蛋白溶酶、t-PA、aPC、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶。对凝血酶及这里所用的其他酶，本文中“基本上不抑制”指给定化合物对血纤维蛋白溶酶、t-PA、aPC、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的IC₅₀(或K_i)大于或等于它对凝血酶的IC₅₀(或K_i)。

将本发明化合物溶解在缓冲液中，形成0至100μM的试验浓度。在凝血酶、血纤维蛋白溶酶、t-PA、aPC、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的试验中，在含有待测化合物的溶液中加入生色合成底物，利用分光光度法测定靶酶及其残留催化活性。由被测的特异性酶引起的底物转化率测定本发明化合物的IC₅₀。IC₅₀是被测化合物对底物转化率产生50％抑制作用的浓度。同样，由不同酶浓度时被测特异性酶引起的底物转化率测定本发明化合物的K_i。K_i是被测化合物对底物转化率产生50％抑制作用的浓度。实施例A和B给出了用于筛选本发明化合物的体外试验实例。

本发明某些优选化合物在凝血酶试验中的K_i约为0.001至200nM。更好的化合物的K_i约为0.001至50nM。更好的优选化合物的Ki约为0.001至10nM。

较好的本发明化合物对血纤维蛋白溶酶、t-PA、aPC、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的IC₅₀至少是其对凝血酶IC₅₀的10倍。尤其好的化合物其对血纤维蛋白溶酶、rt-PA、aPC、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的IC₅₀是其对凝血酶IC₅₀的约20至约100,000倍。更好的化合物其对血纤维蛋白溶酶、rt-PA、aPC、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的IC₅₀是其对凝血酶IC₅₀的约100至约1,000,000倍。如果本发明某化合物其对凝血酶、rt-PA、aPC、胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶的IC₅₀高于被测化合物的最高浓度，就将化合物的最高浓度作为其IC₅₀。4.药物组合物

另一方面，本发明包含了制备后用于保存和使用的药物组合物，其中含有包含在药学上认可的载体中的治疗有效量的本发明化合物。

本发明化合物的“治疗有效量”取决于给药途径、受治哺乳动物的种类和具体考虑的哺乳动物的身体特征。决定此用量的这些因素及其相互关系是医学领域熟练开业医师所熟知的。为了获取最佳的药效，可改变此用量和给药方法，但这取决于体重、饮食、合并疗法及其它医学领域熟练医师所知道的因素。

本发明化合物的“治疗有效量”根据要求的效果和治疗适应症而大不相同。通常，剂量为约0.01mg/kg体重至100mg/kg体重，较好的是约0.01mg/kg体重至10mg/kg体重。

用于治疗的“药学上认可的载体”是医药领域所熟知的，并且在例如Rem-ington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编，1985)中有所记述。例如，可以使用生理pH值的无菌盐水和磷酸盐缓冲的盐水。可以在药物组合物中加入防腐剂、稳定剂、着色剂、甚至赋味剂。例如，作为防腐剂，可加入苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。同上书1449。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。同上书。

本发明药物组合物的配制和使用可以是口服的片剂、胶囊或酏剂；直肠用栓剂；注射用无菌溶液和悬浮液；等等。为了获取最佳的药效，可改变用量和给药方法，但这取决于体重、饮食、合并疗法及其它医学领域熟练医师所知道的因素。

非肠胃给药时，例如每日的静脉注射，可将注射用药物组合物制备成常规形式，液体溶液或悬浮液，适于在使用前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或是乳剂。合适的赋形剂是，例如水、盐水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠、盐酸半胱氨酸等。此外，如有必要，注射用药物组合物可以含有小量的无毒助剂，例如湿润剂，pH缓冲剂等。如有必要，可以使用吸收加强剂(例如脂质体)。5.用途和方法

如本文所述制备和筛选后，本发明化合物是有效的体外和体内凝血酶抑制剂。即，这些化合物可用作体外诊断药以防止血液凝固，和体内的药物以预防可能有异常血栓形成的情况的哺乳动物体内血栓形成。

本发明的化合物可用于防止抽血试管中的血液凝结。使用内为真空的加塞试管将静脉穿刺抽取的血液抽入试管中，在医学是众所周知的。Kasten，B.L.，“Specimen Collection”，Laboratory Test Handbook，第2版，Lexi-CompInc.，Cleveland PP.16-17(编者：Jacobs，D.S.等，1990)。这种真空管可能没有抗凝添加剂，此时，它们被用于从哺乳动物血液中分离血清。或者，它们可能含有抗凝添加剂(如肝素盐、EDTA盐、柠檬酸盐或酸盐)，此时，它们被用于从哺乳动物的血液中分离血浆。本发明化合物是因子Xa或凝血酶的有效抑制剂，即，可以加入血液收集管中防止抽入其中的哺乳动物的血液凝固。

本发明化合物可单独、与本发明的其它化合物组合，或与其它已知的抗凝剂组合用于血液收集试管中。加入试管的量应足以在哺乳动物的血液被抽入其中时抑制血凝块的形成。可以利用本领域众所周知的方法将化合物加入这类试管中，例如引入其液体组合物，以固体组合物加入，或冻干成固体的液体组合物。本发明化合物加入血液收集管中的量为，与2至10ml哺乳动物血液混合时，化合物的浓度足以抑制血凝块的形成。通常，要求浓度为约1至10,000nM，较好的是10至1000nM。

本发明化合物可以被用作预防可能有异常血栓形成的情况的哺乳动物体内血栓形成的药剂。

异常血栓形成的情况在医学领域是众所周知的，包括涉及哺乳动物动脉和静脉脉管系统的那些。在冠状动脉脉管系统中，异常血栓形成(血栓形成)的特点是已形成的粥样硬化斑块破裂，这是引起急性心肌梗塞和不稳定型心绞痛的主要原因，以及由血栓溶解疗法或经皮经腔冠状血管成形术(PTCA)引起的闭塞性冠状血栓形成。在静脉脉管系统中，异常血栓形成的特点是可在一般因静脉脉管系统内血栓形成导致患肢血流量减少和肺栓塞倾向的、接受下肢或腹部大手术的病人中观察到到的情况。异常血栓形成的另一特点是播散性血管内凝血，通常在败血性休克、某些病毒感染和癌症时，在两种血管系统中都会发生，其间发生凝血因子的迅速消耗和全身性凝血，引起遍及整个微血管系统的危及生命的血栓形成，引起广泛的器官衰竭。

本发明涉及对可能有异常血栓形成的情况的哺乳动物进行预防的方法，即对所述哺乳动物给以治疗有效量的本发明化合物或药物组合物。

本发明的化合物和药物组合物是体内给药的，一般适用于哺乳动物，更适用于人。体内使用时，化合物或药物组合物可以通过多种途径对哺乳动物给药，其中包括口服、肠胃外给药、静脉内、皮下、肌内、结肠、直肠、经鼻或腹腔内，同时可使用多种剂型。较好的是肠胃外给药，如每日静脉注射。或者，以口服为佳，如每日服用片剂、胶囊或酏剂。

在本发明方法的实施中，本发明的化合物或药物组合物可以单独给药，或相互组合给药，或与其它已知治疗剂或体内诊断用剂组合给药。

对医学领域的熟练技术人员来说显而易见的是，本发明化合物或药物组合的治疗有效量取决于年龄、体重和受治哺乳动物的种类、具体使用的化合物、具体的给药方式和要求达到的效果和治疗适应症。由于决定此用量的这些因素及其相互关系在医学上是众所周知的，所以本领域熟练技术人员将能够决定治疗有效剂量水平和获取要求的防血栓形成效果所需的量。通常，建议以低剂量水平给以本发明的化合物或药物组合物，同时不断提高剂量水平，直至获得要求的抑制体内血栓形成效果，以此定义为治疗有效量。对于本发明的化合物，单独使用或作为药物组合物的一部分使用时，此剂量约为0.0lmg/kg体重至100mg/kg体重，较好的是约0.01mg/kg体重至10mg/kg体重。

为了帮助理解，将通过以下实施例进一步说明本发明。这些与本发明相关的实施例当然不应被视为是对本发明的具体限定，对本发明的改变，不论是本领域熟练技术人员现在已知或将会发现的，都被认为属于本发明的说明和后文权利要求的范围之内。实施例实施例1制备(S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-氧代-1-哌啶乙酸

本化合物通过改进D.F.Veber和R.M.Freidinger的美国专利4,192,875(1980年3月11日)；和R.M.Freidinger等，J.Org.Chem.，47：104-109(1982)所报导的方法用四步步骤制得。下面描述的新方法由更纯净的中间体着手，由此，可制得大量高纯物质。

将N-α-Boc-δ-苄氧基羰基-L-鸟氨酸(100.3g，0.27mol)溶解在甲醇(450ml)、水(320ml)和乙酸(46.5ml)形成的溶液中。加入10％钯炭催化剂(10.0g)。在Parr设备上在35psi将混合物氢化2.5小时。薄层色谱(硅胶；20∶10∶3二氯甲烷/甲醇/乙酸；茚三酮)显示全部转化成N-α-Boc-L-鸟氨酸。

用氮气吹洗后，加入二羟乙酸(27.72g，0.30mol)，在环境温度将混合物搅拌50小时，在35psi氢化17小时，随后滤去催化剂。加入新鲜的10％钯炭催化剂(5g)，在Parr振荡器上在40psi将混合物再氢化20小时。滤去催化剂，在真空下将滤液浓缩至干。将残余物溶于甲醇中并再次蒸发。重复该步骤，将残余物的压力抽至小于1mmHg并保持过夜，得到黄色泡沫状物。

将粗中间体溶解在无水二甲基甲酰胺(625ml)中并在50-60℃加热2.5小时。在真空于80℃除去溶剂。将生成的油溶解在500ml二氯甲烷中并用500ml1M氢氧化钠溶液萃取。水溶液用500ml二氯甲烷反萃，冷却下用550ml 1MHCl酸化，用5×500ml二氯甲烷和2×500ml 9∶1二氯甲烷/异丙醇再萃取。用无水硫酸镁干燥合并的有机层，蒸发，得到50g(67％产量)固化的油状标题化合物，薄层色谱(TLC，硅胶；27∶3∶1二氯甲烷/甲醇/乙酸)确定其纯度(具有R_f＝0.30的单个的色谱斑)。实施例2制备(S)-N-α-Boc-N^g-硝基精氨醇

在-78℃，向(S)-N-α-Boc-N^g-硝基精氨酸(370g，1.15mol)在6升无水四氢呋喃中的悬浮液中缓慢地加入四氢呋喃·甲硼烷配合物(1.0M，2.6升)，将反应温度控制在不超过-60℃。加料完成后，将反应混合物在-20℃的冰箱内放置过夜。

接着将绿黄色的反应混合物冷冻至-78℃，缓慢地加入3升无水甲醇以中止反应。中止反应后2小时，将混合物温热至25℃并再搅拌2小时。在真空中除去溶剂得到标题化合物(360g)。薄层色谱(二氧化硅；90∶10二氯甲烷/甲醇)给出R_f＝0.28。实施例3制备(S)-N^g-硝基精氨醇盐酸盐

在0℃，向实施例2的化合物(34g，0.1117mol)在500ml甲醇中的溶液中加入1.2升饱和HCl甲醇溶液。30分钟后，移去冰浴并将反应混合物搅拌2小时。此后，在真空中除去溶剂，可直接使用得到的固体而无须进一步纯化。实施例4制备Boc-正缬氨酸(环)-甘氨酸-N^g-硝基-L-精氨醇

向实施例1的化合物(7.49g，0.0275mol)和HOBt(4.43g，0.0289mol)在75ml无水乙腈中的溶液中加入4-甲基吗啉(8.35g，0.0825mol，9.06ml)并将混合物冷却至0℃。用4-甲基吗啉(5.56g，0.055mol，6.05ml)处理实施例3的化合物(7.55g，0.0275mol)在25ml无水二甲基甲酰胺中的溶液，搅拌5分钟，并将其加至上述溶液中。在0℃，于2分钟内，分批地向该混合物中加入EDC(5.26g，0.0275mol)。从0℃至环境温度，将反应混合物搅拌17小时，随后在真空中除去溶剂，残余物在短硅胶闪蒸柱上过滤进行预纯化，使用梯度范围为5-20％甲醇-二氯甲烷洗脱，得到黄色泡沫状物。将其在乙酸乙酯/甲醇中重结晶，得到7.70g(61％产量)无色固态标题化合物，m.p.＝160-162℃；薄层色谱(硅胶；4∶1二氯甲烷/甲醇)给出R_f＝0.45。实施例5制备正缬氨酸(环)-甘氨酸-N^g-硝基-L-精氨醇盐酸盐

在0℃于氮气氛中，向实施例4的化合物(3.86g，8.40mmol)在100ml乙酸乙酯中的悬浮液中加入1N HCl/乙酸乙酯溶液(42ml，5当量)。在0℃将生成的糊状悬浮液搅拌45分钟，接着在环境温度搅拌过夜。在氮气氛中抽滤收集产物，将其溶解在无水甲醇中，接着在真空中蒸发至干。重复上述步骤，真空干燥后，得到3.38g(100％粗产量)无定形吸水的固态标题化合物，NMR和薄层色谱测定表明其纯度约95％，该产物立即在下面实施例中使用，薄层色谱(硅胶：20∶10∶2二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵)给出R_f＝0.5。实施例6制备N-苄基磺酰-正缬氨酸(环)-甘氨酸-N^g-硝基-L-精氨醇

向实施例5的化合物(395.8mg，1.0mmol)在10ml无水二甲基甲酰胺中的溶液中加入无水碳酸钠粉末(276.4mg，2.0mmol)。在环境温度下搅拌30分钟后，加入苯甲磺酰氯(190.7mg，1.0mmol)。24小时后，用二氯甲烷稀释混合物，滤去固体，在真空中除去溶剂得到残余物。用硅胶闪蒸色谱纯化残余物，用梯度范围为10-20％的甲醇/二氯甲烷洗脱，得到220mg(43％产量)无色泡沫状标题化合物。薄层色谱(硅胶；4∶1二氯甲烷/甲醇)给出R_f＝0.5。实施例7制备N-苄基磺酰-正缬氨酸(环)-甘氨酸-L-精氨醇醋酸盐

向实施例6的化合物(965.3mg，1.88mol)在125ml甲醇中的溶液中加入乙酸(903.2mg，15.0mmol，0.86ml)，接着加入10％钯炭催化剂(386mg)。在Parr振荡器上在35psi将混合物氢化17小时，过滤，在真空中蒸去溶剂。将残余物的压力抽至小于1mmHg保持2天，其间偶尔温热之，得到1.02g(100％粗产量)泡沫状标题化合物。薄层色谱(硅胶；20∶10∶2二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵)给出R_f＝0.32。快原子轰击质谱确认其具有468的理论分子量。实施例8制备N-苄基磺酰-正缬氨酸(环)-甘氨酸-L-精氨醛三氟醋酸盐

在约5℃，向实施例7的化合物(218.0mg，0.412mmol)在3ml无水二甲亚砜和3ml无水甲苯中的溶液中加入二氯乙酸(265.9mg，2.06mmol，170.1ml)，接着在1分钟后加入EDC(790.6mg，4.12mmol)。在5℃将混合物搅拌5分钟，然后在环境温度下搅拌90分钟。加入35ml水以中止反应，用3×25ml二乙醚萃取，并用水稀释至总体积为50ml。将水溶液放置在旋转蒸发器上短时间，以除去挥发性物质。在标准C18的50×300mm柱上，使用梯度范围为10-30％的乙腈-水(含0.1％的三氟乙酸)的洗脱液在1小时内对反应产物进行反相HPLC纯化。将有用的馏份合并并冻干，得到151mg(63％产量)标题化合物(无色、无定形固体)。HPLC(在C18反相柱上)分析显示有三种产物形式。快原子轰击质谱确认其具有466的理论分子量。实施例9制备正缬氨酸(环)-甘氨酸-O-甲酯盐酸盐

将实施例1的化合物(43.5g，0.160mol)溶解在150ml无水甲醇中，冷却至0℃，滴入饱和HCl甲醇溶液(400ml)。在0℃将该溶液搅拌1小时，随后温热至环境温度并搅拌14小时。在真空中浓缩该溶液得到透明油状的标题化合物，该化合物直接用于下面实施例中。薄层色谱(硅胶；27∶3∶1二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵)给出R_f＝0.25。实施例10制备N-苄基磺酰-正缬氨酸(环)-甘氨酸-O-甲酯

将实施例8的化合物(19.1g，85.8mmol)置于850ml无水乙腈中形成糊状，用苯甲磺酰氯(32.7g，0.172mol)处理之。将得到的溶液冷却至0℃并滴加三乙胺(60.0ml，0.428mol)。2小时后，加入另外一批苯甲磺酰氯(16.4g，85.8mmol)。将溶液缓慢地温热至环境温度并搅拌16小时。滤去固体，在真空中浓缩滤液，得到油状物。用闪蒸色谱(硅胶；用梯度范围为10-50％的乙酸乙酯在二氯甲烷中的溶液洗脱)纯化该油状物，得到19.8g(68％产量)白色泡沫状标题化合物。薄层色谱(硅胶；27∶3∶1二氯甲烷/甲醇/乙酸)给出R_f＝0.55。实施例11制备N-苄基磺酰-正缬氨酸(环)-甘氨酸

将实施例9的化合物(17.2g，52.7mmol)溶解在350ml甲醇中，冷却至0℃，滴加1.0M氢氧化锂水溶液(116ml)。1小时后，将反应混合物温热至环境温度并搅拌18小时。向糊状物中加入Dowex 50X8-400离子交换树脂(H＋型，49g)以将pH调节至3。搅拌30分钟后，过滤糊状物，使用几批水/甲醇洗涤树脂。在真空下浓缩滤液。将残余物溶于乙腈中并在真空中浓缩之。重复该步骤，得到17.2g(100％产量)无色、无定形固态标题化合物。薄层色谱(硅胶；27∶3∶1二氯甲烷/甲醇/乙酸)给出R_f＝0.30。实施例12制备N-α-叔丁氧基羰基-N^g-硝基-L-精氨酸内酰胺

将溶液加热至50℃使-α-N-叔丁氧基羰基-N^g-硝基-L-精氨酸(2.00g，6.3mmol)溶解在四氢呋喃(100ml)中。将该溶液冷却至室温。加入N-甲基哌啶(0.84ml，6.9mmol)。将该溶液在冰浴中冷却。加入氯甲酸异丁酯(0.83ml，6.3mmol)，在0℃将反应混合物搅拌6小时。将反应混合物搅拌18小时(过夜)同时使杜瓦瓶中的冰熔化。在真空中除去溶剂。将粗产物溶解在20％乙酸乙酯/二氯甲烷(10ml)中，并通过3×5cm硅胶闪蒸色谱柱纯化，使用20％乙酸乙酯/二氯甲烷作为洗脱剂。收集125ml洗脱液。在真空中除去溶剂，得到1.39g(74％粗产量)白色泡沫状标题化合物。R_f＝0.44(硅胶；5％异丙醇/二氯甲烷)。化合物中含有异丁醇杂质。该化合物可通过二氯甲烷/己烷或乙醇/水中的重结晶纯化。实施例13制备N-α-叔丁氧基羰基-N^g-硝基-L-精氨醛

(a)步骤1

向在冰浴中冷却搅拌的LiAlH₄在四氢呋喃(3.8ml 1M溶液，3.8mmol)中的溶液中滴加乙酸乙酯(0.43ml，3.8mmol)在四氢呋喃(5ml)中的溶液。将该溶液在0℃搅拌30分钟生成LiAlH₂(OEt)₂。

向该LiAlH₂(OEt)₂溶液中滴加实施例12的化合物(0.92g，3.1mmol)在四氢呋喃(5ml)中的经搅拌的溶液。30分钟后，加入1.0N HCl/四氢呋喃(2ml1∶1混合物)以中止反应。加入1.0NHCl(20ml)，该溶液用乙酸乙酯萃取3次(每次20ml)。合并的有机层用水(5ml)、饱和碳酸氢钠(5ml)和盐水(两次，每次5ml)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，在真空中除去溶剂，得到0.94g(100％产量)灰白色固态的标题混合物。

(b)步骤2

或者，标题混合物可由下列步骤制得。

在强氮气流中，将顶上装有搅拌设备的12升四颈圆底烧瓶用火焰干燥。该烧瓶冷却后，在氮气的覆盖下加入120.0g α-N-叔丁氧基羰基-N^g-硝基-L-精氨酸(376mmol，1当量)，随后通过套管加入6升无水四氢呋喃(Aldrich保证密封)。烧瓶装上温度计，边搅拌边用加热枪将形成的悬浮液温热至50℃。用冰浴将反应混合物冷却至5℃，并用冰/丙酮浴将其进一步冷却至-5℃。

在将溶液冷却至-5℃期间，在一个500ml烧瓶中称入36.66g N-甲基-O-甲基羟基胺盐酸盐(376mmol，1.0当量)并使之悬浮在300ml二氯甲烷中。用氮气对该悬浮液鼓泡5分钟，冷却至0℃，并在氮气氛中通过注射器加入46ml N-甲基哌啶(1.0当量)。短时间用声波处理该混合物使之完全溶解/形成游离碱，并仍然在氮气氛中用冰浴冷却至0℃。生成的游离碱溶液备用。

当上述精氨酸溶液冷却至-5℃时，用注射器加入45ml N-甲基哌啶，5分钟后，用注射器加入46ml氯甲酸异丁酯(0.95当量)。形成的溶液在-5℃搅拌15分钟。然后，通过套管在约15分钟内加入上面制得的N-甲基-O-甲基羟胺游离碱溶液。在-5℃再持续搅拌1.5小时，此时薄层色谱(硅胶；1∶10∶90乙酸/甲醇/二氯甲烷)显示反应完成。趁冷过滤反应混合物，用400ml冷四氢呋喃洗涤该盐，于真空下在旋转蒸发器上浓缩滤液，得到黄色泡沫状物。

将粗中间体溶于300ml二氯甲烷中，并加至硅胶柱(70-230目，7×50cm)上。该柱先用2升二氯甲烷、接着用2升2％甲醇在二氯甲烷中的溶液洗脱。随后用5％甲醇在二氯甲烷中的溶液洗脱，直至所有产物洗出为止(检查洗脱液的UV活性，一旦出现UV活性，就收集5份每份1升的洗脱液)。合并含纯产物的洗脱液并在真空中浓缩，抽真空过夜，得到120.1g(88％产量)α-N-叔丁氧基羰基-N^g-硝基精氨酸-N-甲基-N-甲氧基羧酰胺(淡黄色泡沫状物)。将该泡沫状物置于300ml二氯甲烷、300ml甲苯中，在真空中再次除去挥发性物质以除去任何残余的水或甲醇。

将120.1g N-α-叔丁氧基羰基-N^g-硝基-L-精氨酸-N-甲基-N-甲氧基羧酰胺(331.4mmol)溶于2.8升无水(Aldrich保证密封)四氢呋喃中，将其转移至装有机械搅拌器和低温温度计的干燥的5升4颈圆底烧瓶中。使用干冰/丙酮浴将溶液冷却至-70℃。用套管直接从Aldrich保证密封的几个100ml瓶中加入300ml 1M LiAlH₄在四氢呋喃中的溶液。用注射器另外加入50ml 1M LiAlH4在四氢呋喃中的溶液(总计331ml)。在加料期间，将反应温度保持在低于-60℃。在-70℃将反应混合物搅拌0.5小时。移去冷冻浴，使反应混合物缓慢地温热至0℃(约2.5小时)。在-30℃至-20℃之间形成厚糊状物。当反应混合物到达0℃时，取出少量试样，使之在乙酸乙酯/2M硫酸氢钾中分配。用薄层色谱(硅胶；乙酸乙酯)分析有机层。

当确定反应完成后，将其冷却至-70℃，用滴液漏斗以足够慢的速率加入503ml 2M硫酸氢钾以使反应温度保持在低于-30℃。移去冷却浴，使反应混合物在2小时内达到0℃，接着滤出白色沉淀。用500ml冷四氢呋喃洗涤该固体。在真空下以旋转蒸发器将滤液浓缩至除去大部分四氢呋喃，剩余的白色淤泥几乎是水性的。将粗产物置于1.5升乙酸乙酯中并用0.2M HCl(2×200ml)洗涤之。用400ml乙酸乙酯反萃HCl萃取液，合并有机层，用碳酸氢钠饱和溶液(2×200ml)萃取。用400ml乙酸乙酯反萃碳酸氢钠萃取液。合并有机层，用盐水(200ml)洗涤，随后用无水硫酸钠干燥。过滤溶液，在真空下以旋转蒸发器浓缩，并抽真空过夜，得到白色固态粗标题化合物(89.0g)。该化合物在硅胶色谱上使用梯度范围为0-10％的甲醇在二氯甲烷中的溶液作为洗脱液进行纯化。合并纯馏份并蒸发，得到白色固态标题化合物(75g，74％产量)。实施例14制备N-α-叔丁氧基羰基-N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇

将实施例13的化合物(41.60g，0.137mol)溶解在乙醇(200ml)中，加入浓盐酸(1ml)。薄层色谱(硅胶；10％甲醇/二氯甲烷)确认其反应完成后，在真空中除去溶剂。通过硅胶柱(230-400目)以0-10％乙酸乙酯/二氯甲烷作为洗脱液使用闪蒸色谱纯化粗产物。洗脱液合并，得到36.88g(81％)浅黄色泡沫状标题化合物。薄层色谱(硅胶；5％甲醇/二氯甲烷)给出R_f＝0.62。实施例15制备N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇盐酸盐

在0℃，向35g实施例14的化合物在500ml无水乙醇中的溶液中缓慢地加入500ml以HCl(g)饱和的无水乙醇溶液。将该混合物温热至25℃并使用薄层色谱进行检查。出现强极性的产物就是要求的化合物。用干氮气流除去大多数的HCl并在真空中除去生成的(resulting)的有机溶剂。生成的33g标题化合物为黄白色固体，不经进一步纯化就可使用。实施例16制备N-苄基磺酰-正缬氨酸(环)-甘氨酸-N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇

将实施例11的化合物(17.2g，52.7mmol)溶解于215ml乙腈中，并用实施例15的化合物(14.2g，53.0mmol)、EDC(15.2g，79.1mmol)、HOBt(7.12g，52.7mmol)对其进行处理。在环境温度将该溶液搅拌15分钟，冷却至0℃，然后用N，N-二异丙基乙胺(45.9ml，0.264mol)对其进行处理。将反应物温热至环境温度并搅拌48小时。在真空中蒸发该溶液，接着将残余物溶解在1.5升乙酸乙酯中，并用2×150ml的1N HCl、饱和碳酸氢钠和盐水依次洗涤之。有机层用无水硫酸镁干燥、过滤并在真空中蒸发，得到黄色泡沫状物。使用闪蒸柱色谱(硅胶；使用梯度范围为3-5％的乙醇在二氯甲烷中的溶液进行洗脱)纯化该泡沫状物，生成11.5g(40％产量)标题化合物(白色固体)。薄层色谱给出的R_f＝0.40(硅胶；9∶1的二氯甲烷/甲醇)。实施例17制备N-苄基磺酰-正缬氨酸(环)-甘氨酸-L-精氨醛乙基环醇醋酸盐

将实施例16的化合物(9.50g，17.6mmol)溶解在乙醇(133ml)、水(33ml)和乙酸(33ml)中，加入10％钯炭催化剂(4.0g)，在Parr装置中在50psi H₂下将溶液振摇19小时。滤去固体，在真空中蒸发滤液，得到浅棕色油状的标题化合物，该化合物直接用于下列反应中。薄层色谱给出的R_f＝0.35(硅胶；20∶5∶2的二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵)。实施例18制备N-苄基磺酰-正缬氨酸(环)-甘氨酸-L-精氨醛三氟醋酸盐

将实施例17的化合物(4.5g，8.1mmol)溶解在1N HCl(150ml)中，并在环境温度下搅拌15小时。向该溶液中加入12N HCl(25.5ml)使反应再持续3.5小时。在50×300mm的C18柱上，使用梯度范围为10-30％的乙腈-水(含0.1％的三氟乙酸)的洗脱液在1小时内对反应物进行反相HPLC纯化。得到3.8g(81％产量)标题化合物(白色固体)。HPLC(在C18反相柱上)分析显示产物具有三个峰。快原子轰击质谱确认其具有466的理论分子量。实施例19制备N-叔丁氧羰基(Boc)-L-甲硫氨酰-甘氨酸甲酯

将N-α-叔丁氧羰基甲硫氨酸(24.9g，0.1mol)和甘氨酸甲酯盐酸盐(12.6g，0.1mol)在脱气的二甲基甲酰胺(150ml)中进行混合。在该混合物中溶入三乙胺(13.9ml，0.1mol)和HOBt(15.3g，0.1mol)，并加入DCC(20.6g，0.1mol)。将该混合物在室温搅拌过夜并过滤。在真空中蒸发滤液，接着将残余物再溶解在二氯甲烷(150ml)中。用0.5M柠檬酸(3×50ml)和2N碳酸氢钠水溶液(3×50ml)洗涤该溶液并用无水硫酸钠干燥之。将该溶液过滤、在真空中蒸发并在乙酸乙酯/己烷中重结晶，得到24.1g(75％产量)标题化合物。实施例20制备N-叔丁氧羰基-L-甲硫氨酰-甘氨酸甲酯甲基锍碘化物

在室温边搅拌边将实施例19的化合物(960mg，3mmol)溶解在6ml碘甲烷中，将反应混合物搅拌6.5小时，此时有粘稠的固体析出。滗去浮在上面的清液并在真空下干燥残余物，得到1.41g(100％)吸湿性泡沫状标题混合物。实施例21制备(S)-3-叔丁氧羰基-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸

在氮气氛中将实施例20的化合物(7.3g，15.6mmol)溶解在312ml 1∶1二甲基甲酰胺/二氯甲烷中并冷却至0℃。一次加入氢化钠(1.5g 50％矿物油的悬浮液，31.5mmol)，在0℃将混合物搅拌2.5小时。接着依次加入乙酸乙酯(104ml)和水(24ml)，将形成的溶液在室温下放置过夜。在真空下将该溶液蒸发至小的体积并使之在水(50ml)和二氯甲烷(50ml)中进行分配。相分离后，用0.5M的柠檬酸将pH＝8的水相酸化成pH＝4。连续地用二氯甲烷萃取之，随后在真空中蒸发，得到2.06g(51％)标题化合物(晶状固体)。实施例22制备(S)-3-叔丁氧羰基-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸-N^g-L-硝基精氨醇

将实施例21的化合物(5.16g，0.02mol)、实施例3的化合物(5.83g，0.022mol)、HBTU(8.34g，0.022mol)、HOBt(2.97g，0.02mol)溶解在500ml乙腈中。缓慢地向该溶液中加入N-甲基吗啉(10ml，0.09mol)。将反应混合物在25℃搅拌12小时并在真空中除去溶剂，得到残余物。将该残余物溶解在500ml乙酸乙酯中并用水(100ml)、10％HCl(3×100ml)、饱和碳酸氢钠(3×100ml)和盐水(100ml)洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空中蒸去溶剂，得到残余物。将该残余物在硅胶(300g)上进行色谱分离，用梯度范围为2-10％的甲醇在二氯甲烷中的溶液洗脱，得到3.3g(37％)标题化合物。薄层色谱给出的R_f＝0.66(硅胶；95∶5二氯甲烷/甲醇)。实施例23制备(S)-3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸-N^g-L-硝基精氨醇盐酸盐

将实施例22的化合物(3.3g，74mmol)溶解在200ml乙酸乙酯和50ml甲醇中。在0℃向该溶液中加入50ml以HCl气饱和的乙酸乙酯溶液。将得到的混合物搅拌30分钟。在真空中除去溶剂，得到3.1g(100％)标题化合物(白色固体)。实施例24制备N-苄基磺酰-(S)-3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸-N^g-L-硝基精氨醇

将苯甲磺酰氯(0.60g，3.1mmol)、实施例23的化合物(1g，2.6mmol)、25mlDMF和25ml乙腈在25℃下进行搅拌。向该溶液中加入三乙胺(1.48ml，10.4mmol)。在25℃将该混合物搅拌12小时，在真空中除去溶剂后得到残余物。将该残余物溶解在100ml乙酸乙酯中并用水(100ml)、10％HCl(3×100ml)、碳酸氢钠(3×100ml)和盐水(100ml)进行洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空中蒸发，生成残余物。将该残余物在硅胶(100g)上进行色谱分离，用梯度范围为5-15％的甲醇在二氯甲烷中的溶液洗脱，得到1.1g(85％)标题化合物。薄层色谱给出R_f＝0.53(硅胶；95∶5二氯甲烷/甲醇)。实施例25制备N-苄基磺酰-(S)-3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸-L-精氨醇

将实施例24的化合物(1.1g，2.2mmol)、100ml甲醇、3ml冰醋酸和200mg10％的钯炭于45psi在Parr氢化器中氢化24小时。有机层经硅藻土过滤并用100ml甲醇洗涤。在真空中蒸发有机层，得到1.2g(100％)标题化合物。薄层色谱给出R_f＝0.82(硅胶；80∶20二氯甲烷/甲醇)。实施例26制备N-苄基磺酰-(S)-3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸-L-精氨醛

在25℃搅拌实施例25的化合物(200mg，0.3mmol)、EDC(0.76g，3.0mmol)和4ml二甲亚砜。向该溶液中加入二氯乙酸(170(1，1.5mmol)。将反应混合物搅拌30分钟。接着将其倒入80ml水中，过滤并将其在20分钟内，在HPLC C18 50×300mm柱上进行处理，使用梯度范围为10-40％的乙腈-水(含0.1％三氟乙酸)作为洗脱液。合并纯的馏份并冻干，得到130mg标题化合物。快原子轰击质谱确认其具有452的理论分子量。实施例27制备(S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-六氢-1-氮杂-2-酮

在0℃，在2分钟内向L-(-)-α-氨基-ε-己内酰胺(24.36g，0.19mol，由Sig-ma公司得到)在200ml四氢呋喃和200ml饱和碳酸氢钠溶液中的溶液中快速地加入二碳酸二叔丁酯(di-t-butyl dicarbonate)(43.54g，0.20mol)。快速地搅拌该混合物并缓慢地温热至室温。持续地搅拌3天后，在真空中除去挥发物，加入固体氯化钠使之在水相中达到饱和，接着用3×200ml乙酸乙酯萃取之。合并后的有机相用2×50ml水、1×50ml盐水洗涤，并用无水硫酸镁干燥，蒸干后得到37.92g淡黄色固态粗产物。合并后的水层用200ml乙酸乙酯、200ml 20％异丙醇在二氯甲烷中的溶液反萃，干燥后得到另外4.64g粗产物，合并后的粗产物产量为98％。由TLC(硅胶；乙酸乙酯，R_f＝0.4)确定由此得到的产物是纯产物。将粗产物合并，并在乙酸乙酯/己烷中重结晶，得到的产物为浅黄色晶状固体，m.p.为148-150℃。实施例28制备(S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-六氢-2-氧代-1-氮杂乙酸苄酯

在环境温度下，在氮气氛中向实施例27的化合物(12.28g，0.054mol)在215ml无水四氢呋喃中的溶液快速滴入双(三甲基甲硅烷基)胺基锂(70.0ml1M在四氢呋喃中的溶液，Aldrich，0.070mol)以便将温度保持在约30℃。加料需要约20分钟，将该溶液搅拌15分钟，然后快速加入溴乙酸苄酯(24.65g，0.108mol，1 7.1ml)在35ml四氢呋喃中的溶液，以便将温度保持在约32℃。经过18小时反应以后，加入100ml氯化铵饱和溶液以中止反应，用600ml乙酸乙酯稀释之，接着用2×50ml水、1×50ml盐水萃取；用无水硫酸镁干燥并蒸发。粗产物用硅胶闪蒸色谱纯化，使用梯度范围为4∶1-2∶1的己烷/乙酸乙酯洗脱，得到17.41g(86％产量)黄色粘稠油状产物；TLC(硅胶；1∶1乙酸乙酯/己烷)：R_f＝0.4。实施例29制备(S)-3-氨基-六氢-2-氧代-1-氮杂乙酸苄酯盐酸盐

在0℃，一次用5N HCl在乙酸乙酯(117ml，新鲜制得的，0.585mol)中的溶液处理实施例28化合物(17.04g，0.0453mol)在50ml乙酸乙酯中的溶液。将得到的溶液在0℃搅拌10分钟，接着在环境温度搅拌1.5小时。在真空中除去溶剂，加入无水乙腈(200ml)，再次蒸去溶剂。用真空泵将压力抽至小于1mmHg并将该压力保持几个小时，得到14.06g(99.3％产量)浅黄色泡沫状产物。TLC(硅胶；27∶3∶1二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵)确定其为纯产物，R_f＝0.4。实施例30制备(S)-3-苄基磺酰胺基-六氢-2-氧代-1-氮杂乙酸苄酯

向实施例29的化合物(9.38g，0.030mol)在300ml无水乙腈中的溶液中加入苯甲磺酰氯(6.29g，0.033mol)并在氮气氛中将溶液冷却至0℃。滴入三乙胺(6.68g，0.066mol，9.20ml)在25ml无水乙腈中的溶液，将温度保持在小于5℃。形成的混合物在0℃搅拌1小时，随后在环境温度下搅拌9小时。加入另一份苯甲磺酰氯(572.0mg，3.0mmol)和三乙胺(0.92g，9.0mmol，1.27ml)，将混合物搅拌14小时，过滤并蒸发。残余物用硅胶闪蒸色谱纯化，使用梯度范围为二氯甲烷至10％乙酸乙酯在二氯甲烷中的溶液进行洗脱，得到11.10g(86％产量)粘性的黄色油状产物，TLC(硅胶；9∶1二氯甲烷/乙酸乙酯)确定其为纯产物：R_f＝0.4。实施例31制备(S)-3-苄基磺酰胺基-六氢-2-氧代-1-氮杂乙酸(“苄基SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸”)

向实施例30的化合物(11.06g，0.0257mol)在200ml乙醇中的溶液中加入10％钯炭(1.11g)。在Parr振荡器(Parr Shaker)上在40psi将混合物氢化5小时。滤去催化剂并除去溶剂，得到8.81g(接近定量)无色泡沫状产物。TLC(硅胶；27∶3∶1二氯甲烷/甲醇/乙酸)确定其为纯产物，R_f＝0.5。实施例32制备N-(苄基SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇

将实施例31的化合物(6.81g，0.020mol)溶解在80ml乙腈中。向该混合物中加入实施例15的化合物(N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇盐酸盐，5.89g，0.022mol)、1-羟基苯并三唑一水合物(3.06g，0.020mol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(5.75g，0.030mol)。在环境温度下将得到的溶液搅拌20分钟，接着加入N，N-二异丙基乙胺(12.83g，0.10mol，17.3ml)。将反应混合物搅拌20小时，用700ml乙酸乙酯稀释，并依次用2×50ml 1N HCl、碳酸氢钠饱和溶液和盐水洗涤。有机层用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空中蒸发，得到黄色泡沫状物，在硅胶闪蒸色谱上使用95∶5二氯甲烷/乙醇作为洗脱液纯化该泡沫状物，得到7.54g(68％产量)无色泡沫状产物。TLC(硅胶；9∶1二氯甲烷/乙醇)确定其为纯产物，R_f＝0.40。实施例33制备N-(苄基SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛乙基环醇

将实施例32的化合物(7.54g，0.0136mol)溶解在200ml 4∶1∶1乙醇/水/乙酸中，加入10％钯炭催化剂(3.8g)。在Parr振荡器上在50psi将混合物氢化19小时。滤去催化剂并蒸发滤液。将残余物溶解在1∶1乙醇/乙腈的混合物中，再次蒸发。使用真空泵将压力抽至小于1mmHg并保持3天，得到8.20g(粗品接近定量)无色、无定形固体产物。TLC(硅胶；20∶10∶2二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵)确定其纯度为约95％，R_f为0.48和0.43。实施例34制备N-(苄基SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛

将实施例33的化合物(2.84g，5.0mmol)溶解在3N HCl(80ml)中并在环境温度下搅拌2.5小时。在50×300mm C18柱上在1小时内使用反相HPLC对反应混合物进行纯化，使用梯度范围为10-30％的乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)作为洗脱液，得到2.18g(74％产量)无色无定形固体产物。RP/HPLC分析显示产物具有三个峰。快原子轰击质谱确认其具有480的理论分子量。实施例35(S)-3-氨基-2-氧代-六氢-1-氮杂乙酸苄酯盐酸盐与磺酰或氨磺酰氯反应的通用步骤

向实施例29的化合物(9.38g，0.030mol)在300ml无水乙腈中的溶液中加入下列合适的磺酰或氨磺酰氯(0.033mol)，并在氮气氛中将溶液冷却至0℃。接着滴入三乙胺(6.68g，0.066mol，9.20ml)在25ml无水乙腈中的溶液以便将温度控制在低于5℃。在0℃将生成的混合物搅拌1小时随后在环境温度将混合物搅拌约2-20小时，过滤，在真空中蒸去溶剂。残余物用硅胶闪蒸色谱纯化，使用梯度范围为二氯甲烷和10％-约15％乙酸乙酯在二氯甲烷中的溶液作为洗脱液，得到产物，TLC(硅胶)确定其纯净。

使用本方法和下列原料，可制得具有下列通式的中间体：R＝                    原    料(所需量)苯基                  苯磺酰氯(5.83g)1-萘基                1-萘磺酰氯(7.48g)2-萘基                2-萘磺酰氯(7.48g)2-甲氧基羰基苯基      2-甲氧基羰基苯磺酰氯(7.74g)2-甲氧基羰基苄基      2-甲氧基羰基苯甲磺酰氯(8.21g)2-三氟甲基苯基        2-三氟甲基苯磺酰氯(8.07g)2-三氟甲基苄基        2-三氟甲基苯甲磺酰氯(8.54g)2-苯基乙基            2-苯基乙磺酰氯(6.75g)环己基甲基            环己基甲磺酰氯(6.49g)环己基氨基            环己基氨磺酰氯(6.52g)2-噻吩甲基            2-噻吩甲磺酰氯(6.49g)。该中间体是通过2-

                 氯甲基噻吩(K.B.Wiberg，Org.Synthe-

                 ses，29，32，1949)与Na₂SO₃反应得到相应

                 的磺酸钠盐(cf.S.Zuffanti，J.Am.Chem.

                 Soc.，62，1044，1940)，接着PCl₅进行标

                 准的处理得到相应的磺酰氯而制得的。全氟丁基             全氟-1-丁磺酰氯(9.97g)五氟苄基             五氟苯甲磺酰氯(9.26g)苯基氨基             苯基氨磺酰氯(6.32g)3-甲氧基羰基苄基     3-甲氧基羰基苯甲磺酰氯(8.21g)3-三氟甲基苄基       3-三氟甲基苯甲磺酰氯(8.54g)2-甲基苄基           2-甲基苯甲磺酰氯(6.75g)3-甲基苄基           3-甲基苯甲磺酰氯(6.75g)2-甲氧基苄基         2-甲氧基苯甲磺酰氯(7.28g)3-甲氧基苄基         3-甲氧基苯甲磺酰氯(7.28g)2-氯苄基             2-氯苯甲磺酰氯(7.43g)3-氯苄基             3-氯苯甲磺酰氯(7.43g)2-甲基-5-氟苄基      2-甲基-5-氟苯甲磺酰氯(7.35g)2-甲基-5-甲氧基苄基  2-甲基-5-甲氧基苯甲磺酰氯(7.75g)3-甲氧基羰基-5-甲氧  3-甲氧基羰基-5-甲氧基-6-三氟甲基苯甲磺基-6-三氟甲基苄基  酰氯(11.44g)实施例36制备本发明化合物的通用方法

按照实施例31至34列出的四个步骤(氢化，偶合，氢化和水解)，使用实施例35的中间体合成本发明下列化合物(它们的三氟乙酸盐)：

N-(苯基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛    36(a)

N-(1-萘基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛  36(b)

N-(2-萘基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛  36(c)

N-(2-甲氧基羰基苯基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛  36(d)

N-(2-甲氧基羰基苄基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛  36(e)

N-(2-三氟甲基苯基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛    36(f)N-(2-三氟甲基苄基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛  36(g)

N-(苯基乙基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛        36(h)N-(环己基甲基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛      36(i)N-(环己基氨基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛      36(j)

N-(2-噻吩甲基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛  36(k)

N-(全氟丁基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛    36(l)

N-(五氟苄基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛    36(m)

N-(苯基氨基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛    36(n)

N-(3-甲氧基羰基苄基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛  36(o)N-(3-三氟甲基苄基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛    36(p)N-(2-甲基苄基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛        36(q)

N-(3-甲基苄基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛    36(r)

N-(2-甲氧基苄基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛  36(s)N-(3-甲氧基苄基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛  36(t)N-(2-氯苄基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛           36(u)N-(3-氯苄基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛           36(v)

N-(2-甲基-5-氟苄基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛    36(w)N-(2-甲基-5-甲氧基苄基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛36(x)

N-(3-甲氧基羰基-5-甲氧基-6-三氟甲基苄基-SO₂-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛36(y)。实施例37制备(S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基-2-氧代-1-氮杂乙酸(叔丁氧羰基-正亮氨酸(环)-甘氨酸)

向实施例28的化合物(3.76g，0.010mol)在50ml乙醇中的溶液中加入10％钯炭(0.76g)，在Parr振荡器上在40psi将混合物氢化2小时。滤去催化剂并除去溶剂，得到2.77g(97％产量)无色泡沫状产物。TLC(硅胶；CH₂Cl₂/MeOH/HOAc为27∶3∶1)：R_f＝0.45。实施例38制备N-(叔丁氧羰基-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇

将实施例37的化合物(5.73g，0.020mol)溶解在80ml乙腈中，并用实施例15的化合物(N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇盐酸盐，5.89g，0.022mol)、1-羟基苯并三唑单水合物(3.06g，0.020mol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(5.75g，0.030mol)处理之。在环境温度下将得到的溶液搅拌20分钟，接着用N，N-二异丙基乙胺(12.83g，0.10mol，17.3ml)处理之。将反应混合物搅拌24小时，用700ml乙酸乙酯稀释，并依次用2×50ml 1N HCl、碳酸氢钠饱和溶液和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并在真空中蒸发，得到黄色泡沫状物，以硅胶闪蒸色谱使用95∶5二氯甲烷/乙醇作为洗脱液纯化该泡沫状物，得到产物。TLC(硅胶；9∶1二氯甲烷/乙醇)确定其为纯产物。实施例39制备N-(叔丁氧羰基-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛乙基环醇将实施例38的化合物(6.79g，0.0136mol)溶解在200ml 4∶1∶1乙醇/水/乙酸的混合物中，加入10％的钯炭催化剂(3.4g)。在Parr振荡器上在50psi将混合物氢化22小时。滤去催化剂并蒸发滤液。将残余物溶解在1∶1乙醇/乙腈的混合物中，再次蒸发。使用真空泵将压力抽至小于lmmHg并保持3天，得到接近定量的粗产物。TLC(硅胶；20∶10∶2的二氯甲烷/甲醇/氢氧化铵)确定其为纯产物。实施例40(a)制备N-(正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛

将实施例39的化合物(2.57g，5.0mmol)溶解在3N HCl(80ml)中并在环境温度下搅拌2.5小时。在50×300mm C18柱上在1小时内使用反相HPLC对反应混合物进行纯化，使用梯度范围为0-20％的乙腈/水/0.1％TFA作为洗脱液，得到标题化合物。RP/HPLC分析显示产物具有三个峰。实施例40(b)制备N-(正缬氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛

使用实施例1的化合物作为原料，按照实施例38、39、40所描述的三个步骤(偶合、氢化、水解)制得无色、无定形的标题化合物。RP/HPLC显示产物具有三个峰。快原子轰击质谱确认其具有312的理论分子量。实施例41制备(S)-3-[(叔丁氧基羰基)-N-甲基氨基]-2-氧代-1-氮杂乙酸苄酯

在0℃、氮气氛中向氢化钠(1.26g 60％油中分散液，用无水己烷洗涤过三次，0.0315mol)在60ml无水THF和6ml无水DNF中的悬浮液中快速滴入实施例28的化合物(11.29g，0.030mol)在30ml无水THF中的溶液，将温度保持在5-10℃。10分钟后，将混合物温热至环境温度，搅拌1小时并再次冷却至0℃。滴入碘甲烷(4.68g，0.033mol，2.05ml)在5ml无水THF中的溶液，并使温度保持在小于约5℃，1小时以后，移去冰浴，将混合物在环境温度搅拌24小时，用400ml Et2O稀释该溶液，用2×50ml水和盐水萃取之。有机层用硫酸镁干燥，过滤并真空蒸发，得到的粗产物用硅胶闪蒸色谱纯化，使用乙酸乙酯、己烷梯度洗脱，得到产物，TLC(硅胶；乙酸∶己烷为1∶1)确认其为纯产物。实施例42制备(S)-3-[(叔丁氧基羰基)-N-甲基氨基]-2-氧代-1-氮杂乙酸(“叔丁氧羰基-N-甲基正亮氨酸(环)-甘氨酸”)

向实施例41的化合物(11.71g，0.030mol)在200ml乙醇中的溶液中加入10％钯炭催化剂(1.17g)，在Parr振荡器上在40psi将混合物氢化6小时。滤去催化剂并除去溶液，得到定量的无色泡沫状产物。TLC(硅胶；CH₂Cl₂/MeOH/HOAc为27∶3∶1)确定其为纯产物。实施例43制备N-(叔丁氧羰基-N-甲基-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇

将实施例42的化合物(6.01g，0.020mol)溶解在80ml乙腈中，并用实施例15的化合物(N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇盐酸盐，5.89g，0.022mol)、1-羟基苯并三唑单水合物(3.06g，0.020mol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(5.75g，0.030mol)处理之。在环境温度下将得到的溶液搅拌20分钟，接着用N，N-二异丙基乙胺(12.83g，0.10mol，17.3ml)处理之。将反应混合物搅拌22小时，用700ml乙酸乙酯稀释，并用2×50ml 1N HCl、碳酸氢钠饱和溶液和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并在真空中蒸发，得到黄色泡沫状物，在硅胶闪蒸色谱上使用95∶5二氯甲烷/乙醇作为洗脱液纯化该泡沫状物，得到产物。TLC(硅胶；9∶1二氯甲烷/乙醇)确定其为纯产物。实施例44制备N-(叔丁氧羰基-N-甲基-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛乙基环醇

将实施例43的化合物(6.99g，0.0136mol)溶解在200ml 4∶1∶1乙醇/水/乙酸的混合物中，加入10％的钯炭催化剂(3.5g)。在Parr振荡器上在50psi将混合物氢化26小时。滤去催化剂并蒸发滤液。将残余物溶解在1∶1乙醇/乙腈的混合物中，再次蒸发。使用真空泵将压力抽至小于1mmHg并保持3天，得到接近定量的粗产物。TLC(硅胶；20∶10∶2的二氯甲烷/甲醇/氢氧化铵)确定其为纯产物。实施例45制备N-(N-甲基-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛

将实施例44的化合物(2.64g，5.0mmol)溶解在3N HCl(80ml)中并在环境温度下搅拌2.5小时。在50×300mm C18柱上在1小时内使用反相HPLC对反应混合物进行纯化，使用梯度范围为0-20％的乙腈/水/0.1％TFA作为洗脱液，得到标题化合物。RP/HPLC分析显示产物具有三个峰。

实施例46至55将描述合成N-[D，L-3-氨基-3-苄基-2-氧代-1-哌啶乙酰]-L-精氨醛双三氟醋酸盐(30)或D，L-α-苄基-正缬氨酸(环)-甘氨酸-L-精氨醛双三氟醋酸盐(30)。该合成的反应流程图见图10。实施例46制备(S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-氧代-1-哌啶乙酸(21)

按照实施例1的方法制得化合物21。实施例47制备(S)-3-氨基-2-氧代-1-哌啶乙酸乙酯(22)；或正缬氨酸(环)甘氨酸-O-乙酯(22)

在0℃，向化合物21(5.45g，0.020mol)在20ml无水乙醇中的溶液中加入12N HCl的乙醇溶液(50.0ml，0.60mol)。在0℃将该溶液搅拌1小时，接着在环境温度下搅拌3小时。蒸去溶剂，将残余物溶解在乙醇-乙腈为1∶1的混合物中并蒸发，共两次。用真空泵将压力抽至低于1mmHg，并保持24小时后，得到4.84g(接近定量)粘稠浅棕色泡沫状产物22，TLC(二氧化硅；二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵为27∶3∶1)：R_f＝0.35。实施例48制备(S)-3-亚苄基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酸乙酯(23)；或N-亚苄基正缬氨酸(环)甘氨酸-O-乙酯(23)

在0℃，在氮气氛中向化合物22(4.7586g，0.0200mol)和苯甲醛(2.1224g，0.0200mol，2.03ml)在50ml二氯甲烷中的溶液中加入无水硫酸镁(5.0g)和Et3N(4.05g，0.040mol，5.58ml)。将该混合物从0℃至环境温度搅拌21小时，在氮气氛下过滤并蒸去溶剂。残余物溶解在300ml二乙醚中。用50ml水(3次)、盐水依次萃取，硫酸镁干燥，在氮气氛中过滤并蒸发，得到5.13g(89％产量)淡黄色粘性油状产物23。该物质容易水解，在0℃氮气氛中储存。实施例49制备D，L-3-亚苄基氨基-3-苄基2-氧代-1-哌啶乙酸乙酯(24)；或D，L-N-亚苄基-α-苄基正缬氨酸(环)-甘氨酸-O-乙酯(24)

在室温，氮气氛下向KOt-Bu(5.25ml 1M的THF溶液，5.25mmol)溶液中快速滴入化合物23(1.4417g，5.00mmol)在5ml无水THF中的溶液，以使温度保持在约30℃。在环境温度下将生成的深红棕色溶液搅拌1小时，随后一次加入溴苄(855.2mg，5.00mmol，0.60ml)。可观察到平稳的放热使温度升高至45℃，伴随着快速的颜色变化，并形成沉淀。经过22小时的反应后，用二乙醚稀释该混合物，用25ml水(2次)、盐水依次萃取，用硫酸镁干燥，过滤，蒸发得到1.6834g(89％产量)粘性的黄色油状产物24。该物质容易水解，在0℃氮气氛中储存。实施例50制备D，L-3-氨基-3-苄基2-氧代-1-哌啶乙酸乙酯盐酸盐(25)；或D，L-α-苄基正缬氨酸(环)-甘氨酸-O-乙酯盐酸盐(25)

在室温，将化合物24(1.5722g，4.15mmol)在5ml二乙醚和50ml 1N HCl中的混合物剧烈搅拌2小时。使用3×50ml二乙醚萃取该溶液，将水溶液短时间地放置在旋转蒸发器(roto-vap)中除去痕量醚，随后冻干3天得到黄色泡沫状物，将该泡沫状物溶解在25ml无水乙醇中，冷却至0℃并用12N HCl乙醇溶液(3.46ml，41.5mmol)处理之。将该溶液温热至环境温度并在14小时后蒸去溶剂。一次加入乙醇-乙腈为1∶1的溶液，再次蒸发溶液，将残余物的压力抽至小于1mmHg的高真空，并保持12小时，得到1.3013g(96％产量)黄色玻璃状产物25。TLC(二氧化硅；二氯甲烷∶甲醇∶浓氢氧化铵＝27∶3∶1)R_f＝0.55。实施例51制备D，L-3-(叔丁氧基羰基)氨基-3-苄基-2-氧代-1-哌啶乙酸乙酯(26)；或D，L-叔丁氧羰基-α-苄基正缬氨酸(环)-甘氨酸-O-乙酯(26)

向化合物25(653.6mg，2.00mmol)在6mlTHF中的溶液中加入2ml饱和碳酸氢钠和二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl dicarbonate)(458.3mg，2.10mmol)。在室温将混合物搅拌17小时，用100ml乙酸乙酯稀释之，随后用2×10ml盐水萃取，用硫酸镁干燥，过滤并蒸发。在硅胶闪蒸色谱上纯化残余物，用梯度范围为9∶1-4∶1的己烷-乙酸乙酯作为洗脱液，得到597.5mg(77％产量)无色、无定形固体产物(化合物26)。TLC(二氧化硅；己烷∶乙酸乙酯为1∶1)R_f＝0.45。实施例52制备D，L-3-(叔丁氧基羰基)氨基-3-苄基2-氧代-1-哌啶乙酸(27)；或D，L-叔丁氧羰基-α-苄基正缬氨酸(环)-甘氨酸-OH(27)

在0℃，向化合物26(577.9mg，1.48mmol)在8ml乙醇中的溶液中加入1MLiOH溶液(3.7ml，3.7mmol)，在0℃将该溶液搅拌30分钟随后在室温下搅拌2小时。加入Dowex 50X8-400(H＋型，3.0g)，搅拌15分钟后滤出树脂，用新鲜的乙醇∶水为1∶1的溶液洗涤，蒸发滤液。将残余物的压力抽至小于1mmHg的高真空并保持20个小时，其间偶尔温和地加热。得到524.4mg(98％产量)无色、无定形固体产物27。TLC(二氧化硅；二氯甲烷/甲醇/乙酸为27∶3∶1)R_f＝0.55。实施例53制备N-[D，L-3-(叔丁氧基羰基)氨基-3-苄基2-氧代-1-哌啶乙酰]-N\+g-硝基-L-精氨醛乙基环醇(28)；或D，L-叔丁氧羰基-α-苄基正缬氨酸(环)-甘氨酸-N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇(28)

在室温，氮气氛中向化合物27(510.0mg，1.407mmol)在14ml无水乙腈中的溶液中加入N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇(452.4mg，1.69mmol)、1-羟基苯并三唑单水合物(215.9mg，1.41mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(405.2mg，2.12mmol)。将混合物搅拌15分钟后，加入N，N-二异丙基乙胺(727.4mg，5.65mmol，0.98ml)。将生成的澄清淡棕色溶液在室温下搅拌3天，然后用100ml乙酸乙酯稀释反应混合物，并用25ml 0.1N HCl(2次)、碳酸氢钠饱和溶液(2次)、水和盐水依次萃取。随后用硫酸镁干燥，过滤并蒸发，粗产物在硅胶闪蒸色谱上使用梯度范围为二氯甲烷/乙醇为98∶2-95∶5的混合溶液作为洗脱液纯化，得到644.9mg浅黄色泡沫状产物。用两小份二乙醚研制(trituration)，得到540.5mg(67％产量)无色、无定形固体产物28；TLC(硅胶；乙酸乙酯)R_f＝0.27。实施例54制备N-[D，L-3-(叔丁氧基羰基)氨基-3-苄基2-氧代-1-哌啶乙酰]-L-精氨醛乙基环醇醋酸盐(29)；或D，L-叔丁氧羰基-α-苄基正缬氨酸(环)-甘氨酸-L-精氨醛乙基环醇醋酸盐(29)

向化合物28(508.5mg，0.8833mmol)在40ml 4∶1∶1乙醇/乙酸/水中的溶液中，加入10％的钯炭催化剂(254mg)。在Parr振荡器上在60psi将混合物氢化8小时。过滤并蒸去溶剂。将残余物溶解在1∶1乙醇/乙腈的混合物中，再次蒸发。使用真空泵将压力抽至小于1mmHg并保持24小时，得到562.5mg(接近定量)无色、无定形固体产物29。TLC(二氧化硅；20∶10∶2的二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵)R_f＝0.45，0.30(两种异构体)。实施例55制备N-[D，L-3-氨基-3-苄基-2-氧代-1-哌啶乙酰]-L-精氨醛双三氟醋酸盐(30)；或D，L-α-苄基正缬氨酸(环)甘氨酸-L-精氨醛双三氟醋酸盐(30)

在环境温度，将化合物29(514.4mg，0.871mmol)加至30ml 3N HCl中。将该溶液搅拌3小时，过滤，在50×300mm C18柱上使用反相HPLC对滤液进行纯化，在1小时内使用梯度范围为0-18％乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)作为洗脱液，得到64mg(12％产量)无色、无定形固体产物30。RP/HPLC分析显示两种异构产物具有五个峰。质谱确认其具有402的理论分子量。

实施例56至64将描述合成N-[D，L-3-氨基-3-苄基-六氢-2-氧代-氮杂-1-乙酰]-L-精氨醛双三氟醋酸盐(39)；或D，L-α-苄基正亮氨酸(环)-甘氨酸-L-精氨醛双三氟醋酸盐(39)。合成的反应流程图见图11。实施例56制备N-亚苄基-α-氨基-ε-己内酰胺(31)

搅拌α-氨基-ε-己内酰胺(31.42g，0.245mol)和苯甲醛(26.00g，0.245mol)在490ml苯中的溶液，并用迪安-斯达克榻分水器共沸回流4小时。蒸去溶剂，将残余物的压力抽至小于1mmHg的真空并保持24小时，得到52.98g(定量)很粘的金黄色油状产物31。该物质是水解不稳定的，储存在0℃的氮气氛中。实施例57制备D，L-α-苄基-N-亚苄基-α-氨基-ε-己内酰胺(32)

在室温氮气氛中，在30分钟内向化合物31(21.63g，0.100mol)在400ml无水THF中的溶液中快速滴入双(三甲基甲硅烷基)胺基锂(105.0ml 1M THF溶液，0.105mol)以使温度保持在约30℃。在环境温度将生成的桔黄色溶液搅拌2小时，冷却至0℃，在30分钟内快速滴入溴苄(17.10g，0.10mol，11.9ml)在75ml无水THF中的溶液以使温度保持在小于5℃。在0℃将反应混合物搅拌2小时，随后温热至室温放置20小时。用100ml饱和NH4Cl中止反应，用1.5升乙酸乙酯稀释，用100ml水(2次)和盐水(2次)依次萃取；用硫酸镁干燥，过滤并蒸发，得到27.73g黄色固体粗产物。在二乙醚中重结晶，得到第一批13.80g无色固体，m.p.140-142℃。用二乙醚/己烷研制残余物，得到第二和第三批固体，使产物32的总重量达到14.66g(48％产量)。该物质是水解不稳定的，储存在0℃氮气氛中。实施例58制备D，L-α-氨基-α-苄基-ε-己内酰胺盐酸盐(33)

向化合物32(14.60g，0.0476mol)在50ml二乙醚中的溶液中加入200ml1N HCl。在室温剧烈搅拌该溶液5小时，随后用3×5ml二乙醚萃取。将水溶液蒸发至干，一次加入乙醇/乙腈为1∶1的混合物，再将溶液蒸发至干。将残余物的压力抽至小于1mmHg的真空并保持3天，其间偶尔温热之，得到12.9g(接近定量)金黄色泡沫状产物33。TLC(二氧化硅；二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵：27∶3∶1)R_f＝0.50。实施例59制备D，L-α-苄基-α-(苄氧羰基)氨基-ε-己内酰胺(34)

在2分钟内，向粗产物33(12.90g，约0.0476mol)在100mlTHF和100ml碳酸氢钠饱和溶液中的溶液中快速加入N-(苄氧基羰基氧)-琥珀酰亚胺(12.46g，0.050mol)。搅拌该溶液，在14小时内使温度由0℃升高至环境温度，蒸去THF。向剩余的水相中加入固体NaCl，用1×200ml和2×100ml乙酸乙酯萃取之。用50ml水(2次)和盐水分批萃取合并后的有机层，随后用硫酸镁干燥，过滤，并蒸发。用硅胶闪蒸色谱纯化粗产物，使用梯度范围为己烷/乙酸乙酯：4∶1-1∶1作为洗脱液，得到13.19g(79％产量)无色固体产物34，m.p.129-130℃，TLC(二氧化硅；乙酸乙酯/己烷：2∶1)R_f＝0.35。实施例60制备D，L-3-苄基-3-(苄氧羰基)氨基-六氢-2-氧代-氮杂-1-乙酸叔丁酯(35)，或D，L-苄氧羰基-α-苄基-正亮氨酸(环)-甘氨酸-O-叔丁酯(35)

在室温氮气氛下于10分钟内，向化合物34(1.616g，4.59mmol)在19ml无水THF中的溶液中快速滴入双(三甲基甲硅烷基)胺基锂(5.51ml 1M THF溶液，5.51mmol)以使温度保持在约27℃。在环境温度将生成的暗黄色溶液搅拌30分钟，在10分钟内加入溴乙酸叔丁酯(1.074g，5.51mmol，0.81ml)在7ml无水THF中的溶液。在环境温度将溶液搅拌20小时，用10ml饱和NH₄Cl溶液中止反应，用100ml乙酸乙酯稀释，有机相用25ml水(2次)和盐水(2次)依次萃取；用硫酸镁干燥，过滤并蒸发，残余物用硅胶闪蒸色谱纯化，使用己烷/乙酸乙酯：9∶1为洗脱液，得到1.290g(60％产量)粘性黄色油状产物35。TLC(二氧化硅；己烷/乙酸乙酯：1∶1)R_f＝0.50。实施例61制备D，L-3-苄基-3-(苄氧羰基)氨基-六氢-2H-2-氧代-氮杂-1-乙酸(36)，或D，L-苄氧羰基-α-苄基-正亮氨酸(环)-甘氨酸-OH(36)

在0℃，向化合物35(1.2603g，2.70mmol)在15ml二氯甲烷中的溶液中加入6ml三氟乙酸。在0℃保持10分钟后，移去冰浴并在环境温度将溶液搅拌1小时。蒸去溶剂，在硅胶闪蒸色谱上纯化残余物，使用二氯甲烷/乙醇：9∶1为洗脱液，得到887.8mg(80％产量)无色、无定形固体产物36。TLC(二氧化硅；二氯甲烷/甲醇/乙酸：27∶3∶1)R_f＝0.57。实施例62制备N-[D，L-3-苄基-3-(苄氧羰基)氨基-六氢-2-氧代-氮杂-1-乙酰]-N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇(37)，或D，L-苄氧羰基-α-苄基-正亮氨酸(环)-甘氨酸-N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇(37)

在室温，氮气氛中向化合物36(872.8mg，2.1 26mmol)在22ml无水乙腈中的溶液中加入N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇(683.0mg，2.55mmol)、1-羟基苯并三唑单水合物(325.6mg，2.126mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(611.0mg，3.19mmol)。将混合物搅拌15分钟后，加入N，N-二异丙基乙胺(1.099g，8.50mmol，1.48ml)。将生成的澄清淡棕色溶液在室温下搅拌18小时，然后用200ml乙酸乙酯稀释反应混合物，并用25ml 0.1N HCl(2次)、碳酸氢钠饱和溶液(2次)、水和盐水依次萃取。随后用硫酸镁干燥，过滤并蒸发，粗产物在硅胶闪蒸色谱上使用梯度范围为乙酸乙酯/己烷为2∶1至纯乙酸乙酯作为洗脱液纯化，得到967.2mg(73％产量)无色泡沫状产物37。TLC(二氧化硅；乙酸乙酯)R_f＝0.25。实施例63制备N-[D，L-3-氨基-3-苄基-六氢-2-氧代-氮杂-1-乙酰]-L-精氨醛乙基环醇二醋酸盐(38)，或D，L-α-苄基-正亮氨酸(环)-甘氨酸-L-精氨醛乙基环醇二醋酸盐(38)

向化合物37(960.2mg，1.54mmol)在100ml 4∶1∶1乙醇/乙酸/水中的溶液中，加入10％的钯炭(480mg)。在Parr振荡器上在55psi将混合物氢化21小时。过滤并蒸去溶剂。将残余物溶解在1∶1乙醇/乙腈的混合物中，再次蒸发。使用真空泵将压力抽至小于1mmHg并保持24小时，得到856.7mg(99％粗产量)黄色泡沫状产物38。TLC(二氧化硅；20∶10∶2的二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵)R_f＝0.40，0.35(两种异构体)。实施例64制备N-[D，L-3-氨基-3-苄基-六氢-2-氧代-氮杂-1-乙酰]-L-精氨醛双三氟醋酸盐(39)，或D，L-α-苄基-正亮氨酸(环)甘氨酸-L-精氨醛双三氟醋酸盐(39)

在环境温度，将化合物38(840.0mg，1.49mmol)加至50ml 3N HCl中。将该溶液搅拌3小时，过滤，在50×300mm C18柱上在1小时内使用反相HPLC对滤液进行纯化，使用梯度范围为0-75％乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)作为洗脱液，得到348.2mg(36％产量)无色、无定形固体产物39。RP/HPLC分析显示两种异构产物具有五个峰。质谱确认其具有416的理论分子量。

实施例65至72(a)将描述合成N-[((S)-3-N-苯基乙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酰]-L-精氨醛双三氟醋酸盐(47)；合成的反应流程图见图12。实施例65制备(S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-氧代-1-哌啶乙酸苄酯(40)

向化合物21(20.0g，0.0735mol；见实施例46)在700ml无水乙腈和30ml无水N，N-二甲基甲酰胺中的悬浮液中加入无水K2CO3粉末(12.68g，0.0918mol)，随后加入溴苄(13.81g，0.0808mol，9.61ml)。将混合物搅拌并剧烈地回流6小时，冷却、过滤并蒸发。用硅胶闪蒸色谱纯化残余物，使用梯度范围为40-50％的乙酸乙酯/己烷作为洗脱液，得到25.5g(96％产量)浅黄色油状产物40。TLC(硅胶；乙酸乙酯/己烷：1∶1)：R_f＝0.35。实施例66制备(S)-3-氨基-2-氧代-1-哌啶乙酸苄酯盐酸盐(41)在室温，向化合物40(4.00g，0.0110mol)在10ml乙酸乙酯中的溶液中一次加入5N HCl在乙酸乙酯中的溶液(50ml，新鲜制得的，0.25mol)。将该溶液搅拌3小时，蒸去溶剂，加入二氯甲烷，再次蒸去溶剂。用真空泵将残余物的压力抽至小于1mmHg并保持24小时，得到3.37g(接近定量)无色泡沫状产物41。TLC(硅胶；二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵：27∶3∶1)：R_f＝0.32。实施例67制备(S)-3-苯基乙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酸苄酯盐酸盐(42)

向化合物41(1.50g，5.02mmol)和苯基乙醛(0.724g，6.03mmol)在35ml1，2-二氯乙烷中的混合物中加入三乙胺(2.03g，21.1mmol，2.80ml)。在环境温度搅拌10分钟后，在5分钟内快速地加入三乙酰氧基硼氢化钠(1.49g，7.03mmol)。在室温将反应混合物搅拌15小时，加入30ml水中止反应。用50ml二氯甲烷稀释该混合物，分离有机层，用30ml碳酸氢钠饱和溶液，水和盐水依次洗涤之；用硫酸镁干燥，过滤并蒸发。残余物用硅胶闪蒸色谱纯化，用二氯甲烷/乙醇：95∶5洗脱，得到1.21g(66％产量)浅黄色油状产物42；TLC(硅胶；二氯甲烷/乙醇：9∶1)：R_f＝0.4。实施例68制备(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-2-氧代-1-哌啶乙酸苄酯(43)

向化合物42(1.19g，3.23mmol)在10ml四氢呋喃和10ml碳酸氢钠饱和溶液中的混合物中加入二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl dicarbonate)(1.41g，6.47mmol)。在室温将混合物搅拌1.5小时，用150ml乙酸乙酯稀释之，随后用30ml碳酸氢钠饱和溶液、1NHCl和盐水依次萃取，用硫酸镁干燥，过滤并蒸发。在硅胶闪蒸色谱上纯化残余物，用梯度范围为己烷∶乙酸乙酯＝2∶1作为洗脱液，得到1.06g(70％产量)无色油状产物43。TLC(二氧化硅；己烷∶乙酸乙酯为2∶1)R_f＝0.15。实施例69制备(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-2-氧代-1-哌啶乙酸(44)

向化合物43(1.06g，2.27mmol)在35ml甲醇中的溶液中加入10％钯炭催化剂(127mg)，在Parr振荡器上在45psi将混合物氢化2小时。过滤并蒸去溶剂。使用真空泵将压力抽至小于1mmHg并保持10小时使残余物干燥，得到0.836g(98％产量)无色泡沫状产物44。TLC(二氧化硅；27∶3∶1的二氯甲烷/甲醇/乙酸)R_f＝0.40。实施例70制备N-[(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-2-氧代-1-哌啶乙酰]-N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇(45)

在室温，氮气氛中向化合物44(836.0mg，2.22mmol)在20ml无水乙腈中的溶液中加入N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇(712.0mg，2.66mmo1)、1-羟基苯并三唑单水合物(340.0mg，2.22mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(638.0mg，3.33mmol)。将混合物搅拌10分钟后，加入N，N-二异丙基乙胺(1.15g，8.88mmol，1.55ml)。将生成的澄清淡棕色溶液在室温下搅拌18小时，蒸去溶剂，残余物溶解在150ml乙酸乙酯中，用25ml 1N HCl(2次)、碳酸氢钠饱和溶液(2次)、水和盐水依次萃取。随后用硫酸镁干燥，过滤并蒸发，粗产物在硅胶闪蒸色谱上使用二氯甲烷/异丙醇为95∶5的混合溶液作为洗脱液纯化，得到1.305g(99％产量)无色泡沫状产物45。TLC(二氧化硅；二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵：25∶5∶1)R_f＝0.65。实施例71制备N-[(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-2-氧代-1-哌啶乙酰]-L-精氨醛乙基环醇三氟醋酸盐(46)

向化合物45(933.0mg，1.58mmol)在20ml 4∶1∶1乙醇/乙酸/水中的溶液中，加入10％的钯炭(280mg)。在Parr振荡器上在45psi将混合物氢化20小时。过滤并蒸去溶剂。在1小时内将残余物在50×300mm C18柱上进行反相HPLC纯化，使用梯度范围为5-75％的乙腈/水(含0，1％三氟乙酸)作为洗脱液，得到668mg(64％产量)无色、无定形固体产物46。TLC(二氧化硅；20∶10∶2的二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵)R_f＝0.40。实施例72(a)制备N-[(S)-3-N-苯基乙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酰]-L-精氨醛三氟醋酸盐(47)

在环境温度，将化合物46(543.0mg，0.824mmol)加至20ml 3N HCl中。将该溶液搅拌3小时，过滤，在50×300mm C18柱上在1小时内使用反相HPLC对滤液进行纯化，使用梯度范围为0-75％的乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)作为洗脱液，得到334mg(63％产量)无色、无定形固体产物47。RP/HPLC分析显示产物具有3个峰。质谱确认其具有416的理论分子量。实施例72(b)制备N-[(S)-3-N-苯基丙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酰]-L-精氨醛三氟醋酸盐

按照实施例67至72(a)中的步骤，但使用3-苯基丙醛代替苯基乙醛合成标题化合物。RP/HPLC分析显示产物具有3个峰。质谱确认其具有430的理论分子量。

实施例73-80描述了合成N-[(S)-3-N-苯基乙基氨基-六氢-2-氧代氮杂-1-乙酰]-L-精氨醛双三氟乙酸盐(56)。合成反应流程图见图13。实施例73制备(S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-六氢-2-氧代-1-氮杂乙酸乙酯(49)

在环境温度下，在氮气氛中向化合物48(4.57g，0.020mol，见实施例27)在100ml无水四氢呋喃中的溶液快速滴入双(三甲基甲硅烷基)胺基锂(26.0ml1M在四氢呋喃中的溶液，Aldrich，0.026mol)以便将温度保持在约30℃。将该溶液搅拌15分钟，然后快速加入溴乙酸乙酯(6.68g，0.040mol，4.44ml)在10ml无水四氢呋喃中的溶液，以便将温度保持在约32℃。经过1小时反应以后，加入50ml氯化铵饱和溶液以中止反应，用400ml乙酸乙酯稀释之，接着用2×50ml水、1×50ml盐水萃取；用硫酸镁干燥，过滤并蒸发。粗产物用硅胶闪蒸色谱纯化，使用2∶1的己烷/乙酸乙酯洗脱，得到5.23g(83％产量)黄色粘稠油状产物49；TLC(硅胶；1∶1乙酸乙酯/己烷)：R_f＝0.4。实施例74制备(S)-3-氨基-六氢-2-氧代-1-氮杂乙酸乙酯盐酸盐(50)

在0℃，向化合物49(3.143g，0.0100mol)在20ml乙醇中的溶液中一次加入12N HCl的乙醇溶液(27.0ml，0.32mol)。将得到的溶液在0℃搅拌5分钟，接着在环境温度搅拌1小时。蒸去溶剂，加入无水乙腈(100ml)，再次蒸去溶剂。残余物用真空泵将压力抽至小于1mmHg并将该压力保持20小时，得到2.410g(96％产量)浅黄色泡沫状产物50。TLC(硅胶；25∶5∶1二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵)：R_f＝0.63。实施例75制备(S)-3-苯基乙基氨基-六氢-2-氧代-1-氮杂乙酸乙酯(51)

向化合物50(6.00g，23.9mmol)和苯基乙醛(4.21g，35.0mmol，4.1ml)在170ml 1，2-二氯乙烷中的混合物中加入三乙胺(9.67g，95.6mmol，13.3ml)，在环境温度搅拌10分钟后，在15分钟内快速分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(7.09g，33.5mmol)。在环境温度将反应混合物搅拌21小时，加入140ml水中止反应。用170ml二氯甲烷稀释混合物，分离有机层，用150ml碳酸氢钠饱和溶液、水、盐水依次洗涤；以硫酸镁干燥，过滤并蒸发。残余物用硅胶闪蒸色谱纯化，用二氯甲烷/乙醇：97∶3的溶液洗脱，得到5.22g(69％产量)浅黄色油状产物51，TLC(硅胶；二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵：27∶3∶1)：R_f＝0.55。实施例76制备(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-六氢-2-氧代-氮杂乙酸乙酯(52)

向化合物51(5.22g，16.4mmol)在50ml四氢呋喃和50ml碳酸氢钠饱和溶液中的混合物加二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl dicarbonate)(7.16g，32.8mmol)。在室温将混合物搅拌2小时，用350ml乙酸乙酯稀释之，随后用50ml饱和碳酸氢钠溶液，1N HCl和盐水依次萃取，用硫酸镁干燥，过滤并蒸发。在硅胶闪蒸色谱上纯化残余物，用己烷/乙酸乙酯＝2∶1作为洗脱液，得到5.77mg(84％产量)淡黄色油状产物52。TLC(二氧化硅；己烷/异丙醇为95∶5)R_f＝0.45。实施例77制备(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-六氢-2-氧代-氮杂乙酸(53)

在室温，向化合物52(5.77g，13.8mmol)在70ml乙醇中的溶液中加入1MLiOH溶液(31.0ml，31.0mmol)，在室温将该溶液搅拌2小时。加入Dowex50X8-400(H＋型，15.0g)，搅拌15分钟后滤去树脂，用新鲜的乙醇/水为1∶1的溶液洗涤，蒸发滤液。将残余物的压力抽至小于1mmHg的高真空并保持20个小时，其间偶尔温和地加热。得到5.08g(94％产量)无色、无定形固体产物53。TLC(二氧化硅；二氯甲烷/甲醇/乙酸为27∶3∶1)R_f＝0.5。实施例78制备N-[(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-六氢-2-氧代-氮杂-1-乙酰]-N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇(54)

在室温，氮气氛中向化合物53(1.50mg，3.84mmol)在40ml无水乙腈中的溶液中加入N^g-硝基-L-精氨醛乙基环醇(1.34g，4.99mmol)、1-羟基苯并三唑单水合物(0.52g，3.84mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(1.10g，5.76mmol)。将混合物搅拌15分钟后，加入N，N-二异丙基乙胺(1.99g，15.4mmol，2.68ml)。将生成的澄清淡棕色溶液在室温下搅拌22小时，蒸去溶剂，残余物溶解在300ml乙酸乙酯中，用25ml 1N HCl(2次)、碳酸氢钠饱和溶液(2次)和盐水依次萃取。随后用硫酸镁干燥，过滤并蒸发，粗产物在硅胶闪蒸色谱上纯化，使用梯度范围为二氯甲烷/乙醇为98∶2-96∶4的混合溶液作为洗脱液，得到1.64g(71％产量)无色泡沫状产物54。TLC(二氧化硅；二氯甲烷/甲醇/浓氨水：25∶5∶1)R_f＝0.7。实施例79制备N-[(S)-3-[N-(叔丁氧基羰基)-N-苯基乙基氨基]-六氢-2-氧代-氮杂-1-乙酰]-L-精氨醛乙基环醇醋酸盐(55)

向化合物54(1.64g，2.72mmol)在30ml 4∶1∶1乙醇/乙酸/水中的溶液中，加入10％的钯炭催化剂(250mg)。在Parr振荡器上在45psi将混合物氢化19小时。另外再加入10％钯炭(1.00g)并使氢化再持续21小时。过滤溶液并蒸去溶剂。将残余物溶解在无水乙腈中，再次蒸发。将残余物的压力抽至小于1mmHg并保持24小时，得到1.75g(接近定量)无色、无定形固体产物55。TLC(二氧化硅；20∶10∶2的二氯甲烷/甲醇/浓氢氧化铵)R_f＝0.45。实施例80制备N-[(S)-3-N-苯基乙基氨基-六氢-2-氧代-氮杂-1-乙酰]-L-精氨醛双三氟醋酸盐(56)

在环境温度，将化合物55(1.46g，2.36mmol)加至50ml 3N HCl中。将该溶液搅拌3.5小时，过滤，在50×300mm C18柱上在1小时内使用反相HPLC对滤液进行纯化，使用梯度范围为0-15％的乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)作为洗脱液，得到1.19g(77％产量)无色、无定形固体产物56。RP/HPLC分析显示产物具有3个峰。质谱确认其具有430的理论分子量。实施例81(S)-3-氨基-2-氧代哌啶-1-乙酸苄酯盐酸盐与磺酰或氨磺酰氯反应的通用步骤

向实施例66的化合物(8.96g，0.030mol)在30ml无水乙腈中的溶液中加入适量的实施例35所列的磺酰或氨磺酰氯(0.033mol)，在氮气氛中将溶液冷却至0℃。滴入三乙胺(6.68g，0.066mol，9.20ml)在25ml无水乙腈中的溶液使温度保持在小于5℃。在0℃将生成的混合物搅拌1小时，随后在环境温度搅拌约2-20小时，过滤，在真空中蒸去溶剂。残余物在硅胶闪蒸色谱上纯化，使用梯度范围为二氯甲烷和10％-约50％的乙酸乙酯在二氯甲烷中的溶液洗脱，得到产物。TLC(硅胶)确定其为纯产物。

使用本方法和实施例35所列的原料，可制得具有下列通式(R如实施例35所定义)的中间体：实施例82制备本发明化合物的通用步骤

按照实施例31至34所列的四步步骤(氢化，偶合，氢化和水解)，使用实施例81的中间体合成本发明下列化合物(作为它们的三氟乙酸盐)：N-(1-萘基-SO₂-正缬氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛(化合物82(a))N-(环己基氨基-SO₂-正缬氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛(化合物82(b))

N-(2-萘基-SO₂-正缬氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛(化合物82(c))N-(苯基-SO₂-正缬氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛(化合物82(d))

N-(对甲苯基-SO₂-正缬氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛(化合物82(e))

N-(2-甲氧羰基苯基-SO₂-正缬氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛(化合物82(f))实施例83(S)-3-氨基-2-氧代-六氢-1-氮杂乙酸苄酯盐酸盐与膦酰基氯化物的衍生物反应的通用步骤

下面所列的取代的膦酰基氯化物由文献所描述的方法制得，参见H.J.Musiol，F.Grams，S.Rudolph-Bohner and L.Moroder，J.Org.Chem.，59：6144-6146(1994)及其所引用的参考文献。向实施例29的化合物(9.38g，0.030mol)在300ml无水乙腈中的溶液中加入适当的下面所列的膦酰基氯化物的衍生物(0.033mol)，在氮气氛中将溶液冷却至0℃。滴入三乙胺(6.68g，0.066mol，9.20ml)在25ml无水乙腈中的溶液使温度保持在小于5℃。在0℃将生成的混合物搅拌1小时，随后在环境温度搅拌约2-20小时，过滤，在真空中蒸去溶剂。残余物在硅胶闪蒸色谱上纯化，使用梯度范围为二氯甲烷和10％-约50％的乙酸乙酯在二氯甲烷中的溶液洗脱，得到产物。TLC(硅胶)确定其为纯产物。

使用本方法和下面所列的原料，可制得具有下列通式的中间体：

R₁   R″     原    料(所需的量)苄基  OEt    BnPO(OEt)(Cl)      (7.21g)苄基  Me     BnPO(Me)(Cl)       (6.22g)苄基  NHMe   BnPO(NHMe)(Cl)     (6.72g)苄基  S-iPr  BnPO(S-iPr)(Cl)    (8.21g)实施例84制备本发明化合物的通用步骤

按照实施例31至34所列的四步步骤(氢化，偶合，氢化和水解)，使用实施例83的中间体合成本发明下列化合物(作为它们的三氟乙酸盐)：

N-(苄基-PO-(OEt)-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛，

N-(苄基-PO-(Me)-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛，

N-(苄基-PO-(NHMe)-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛，

N-(苄基-PO-(S-i-Pr)-正亮氨酸(环)-甘氨酸)-L-精氨醛。实施例A化合物在体外凝血酶抑制试验中的动力学分析

通过测定抑制常数K_i评价实施例8的化合物，后文称BzlSO₂-正Val(环)-Gly-Arg-al和实施例34的化合物，后文称N-(BnSO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛作为凝血酶催化活性的抑制剂的能力。

使用购自Pentapharm Ltd.的生色底物Pefachrome t-PA(CH₃SO₂-六氢酪氨酸-甘氨酰-L-精氨醛-对硝基酰苯胺)测定酶活性。使用前，此底物在去离子水中再生。由Enzyme Research Laboratories，Inc.购得纯化的人α-凝血酶(比活性3000U/mg)。全部试验中使用的缓冲液都是HBSA(10mM HEPES，pH7.5，150mM氯化钠，0.1％牛血清白蛋白)。

在Corning微量滴定板的合适孔格中，混合50微升HBSA，50微升被测化合物在HBSA中的一定浓度的稀释液(或是用于V。(未受抑制的速度)测定的纯HBSA)和50微升生色底物(250mM，5×Km)。在0时间，孔中加入50微升稀释于HBSA中的α凝血酶，使其在总体积200微升中的最终浓度为0.5nM。使用Thermo Max^Kinetic Microplate Reader测定40分钟内在405nm波长的吸光度变化，由此测定40分钟内生色底物的水解速度。根据Williams和Morri-son在Methods in Enzymology，63：437(1979)中提出的关系式，使用40分钟内测得的稳态速度(Vs)测定被测化合物的Ki。在本试验过程中，底物的水解程度低于5％。

表1列出了BzlSO₂-正Val(环)-Gly-Arg-al和N-(BnSO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛的Ki。此数据显示了这些化合物作为有效的人α凝血酶体外抑制剂的效果。

                   表    1

化合物	Ki(nM)*
		BzlSO2-正Val(环)-Gly-Arg-al	1.01±0.272
N-(BnSO2-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛	0.538±0.080

*平均值±SD，n＝3实施例B用于测定特异性的体外酶试验

测定被测化合物抑制此酶活性50％的浓度(IC₅₀)，将该值与对以下某些或全部相关的丝氨酸蛋白酶测得的浓度相比较：重组组织血纤维蛋白溶酶原活化剂(rt-PA)、血纤维蛋白溶酶、活性蛋白C(aPC)、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，由此测定本发明化合物作为凝血酶催化活性的选择性抑制剂的能力。

全部试验中使用的缓冲液都是HBSA(10mM HEPES，pH7.5，150mM氯化钠，0.1％牛血清白蛋白)。在Corning微量滴定板的合适孔格中，在0时间，混合50微升HBSA，50微升被测化合物在HBSA中一定浓度(覆盖了一很广的浓度范围)的稀释液(或是用于V。(未受抑制的速度)测定的纯HBSA)和50微升稀释于HBSA中的酶进行IC₅₀的测定。在环境温度保温30分钟后，加入50微升下文中规定浓度的底物，使其总体积为200微升。在最初5分钟内(此期间，少于5％所加入的底物被利用)使用一Thermo Max^Kinetic Microplate Reader测定405nm处的吸光度变化，由此测定生色底物水解初速度。以使得水解初速度降低50％时所加入底物的浓度定义为IC₅₀。1.凝血酶(fIIa)试验

使用购自Pentapharm Ltd.的生色底物Pefachrome t-PA(CH₃SO₂-D-六氢酪氨酸-甘氨酰-L-精氨醛-对硝基苯胺)测定酶活性。使用前，此底物在去离子水中再生。由Enzyme Research Laboratories，Inc.购得纯化的人α凝血酶。全部试验中使用的缓冲液都是HBSA(10mM HEPES，pH7.5，150mM氯化钠，0.1％牛血清白蛋白)。

在合适的测试孔中混合HBSA(50微升)、α-凝血酶(50微升)和抑制剂(50微升)(覆盖了较广的浓度范围)，并在室温下保温30分钟，然后加入底物Pe-fachrome-t-PA(50微升)进行IC₅₀的测定。在前5分钟(此期间，少于5％的加入底物被利用)使用一Thermo Max^Kinetic Microplate Reader测定405nm波长的吸光度变化，由此测定Pefachrome-t-PA水解的初速度。将使水解初速度降低50％所加入的抑制剂浓度定义为IC₅₀。2.重组组织血纤维蛋白溶酶原活化剂(rt-PA)

使用底物Pefachrome t-PA(CH₃SO₂-六氢酪氨酸-甘氨酰-L-精氨醛-对硝基酰苯胺，购自Pentalharm)测定rt-PA的催化活性。试验前，底物在去离子水中再生，然后稀释在HBSA中，试验中其最终浓度为500μM(约3倍于Km)。由Genentech Inc.购得人rt-PA(Activase^)。酶在去离子水中再生，再稀释在HB-SA中，然后用于试验，其最终浓度为1.0nM。3.血纤维蛋白溶酶试验

使用生色底物，即Kabi Diagnostica的S-2251(D-缬氨酰-L-亮氨酰-L-赖氨酸-对硝基酰苯胺)，测定血纤维蛋白溶酶的催化活性。底物在去离子水中再生，再稀释在HBSA中，然后用于试验，其最终浓度为300μM(约2.5倍于Km)。由Enzyme Research Laborataries，Inc.购得纯化的人血纤维蛋白溶酶。将酶稀释在HBSA中，然后用于试验，其最终浓度为1.0nM。4.活性蛋白C(aPC)

使用生色底物，即Pentapharm Ltd.的Pefachrome PC(δ-苄氧基羰基-D-赖氨酸-L-脯氨酰-L-精氨醛-对硝基酰苯胺)，测定aPC的催化活性。底物在去离子水中再生，再稀释在HBSA中，然后用于试验，其最终浓度为250μM(约3倍于Km)。由Hematologic Technologies，Inc.购得纯化的人aPC。将酶稀释在HBSA中，然后用于试验，其最终浓度为1.0nM。5.胰凝乳蛋白酶

使用生色底物，即Kabi Diagnostica的S-2586(甲氧基-琥珀酰-L-精氨酸-L-脯氨酰-L-酪氨酰-对硝基酰苯胺)，测定胰凝乳蛋白酶的催化活性。底物在去离子水中再生，再稀释在HBSA中，然后用于试验，其最终浓度为100μM(约9倍于Km)。由Worthington Biochemical Corp.购得纯化的(3X-结晶的；CDI)牛胰a-凝乳蛋白酶。将酶以无离子水再生，稀释在HBSA中，然后用于试验，其最终浓度为1.0nM。6.胰蛋白酶

使用生色底物，即Kabi Diagnostica的S-2222(苯甲酰-L-异亮氨酸-L-谷氨酸-(γ-甲酯)-L-精氨醛-对硝基酰苯胺)，测定胰蛋白酶的催化活性。底物在去离子水中再生，再稀释在HBSA中，然后用于试验，其最终浓度为250μM(约4倍于Km)。由Worthington Biochemical Corp.购得纯化的(3X-结晶的；TRL3)牛胰胰蛋白酶。将酶以无离子水再生，稀释在HBSA中，然后用于试验，其最终浓度为0.5nM。7.因子Xa

使用生色底物，即Kabi Pharmacia Hepar Inc.(Franklin，OH)的S-2765(N-苄氧基羰基-D-精氨酸-L-甘氨酸-L-精氨醛-对硝基苯胺)，测定因子Xa的催化活性。使用前全部底物都在去离子水中再生。S-2765的最终浓度为250μM(约5倍于Km)。由Enzyme Research Laboratories，Inc.(South Bend，IN)购得纯化的人的因子X，根据文献记载活化和制备因子Xa(FXa)(Bock，P.E.，Craig，P.A.，Olson，S.T.，和Singh，P.Arch.Biochem.Biophys.273：375-388(1989))。8.结果

表2列出了测得的对上述酶的IC₅₀，证明了与这些相关的丝氨酸蛋白酶相比，抑制α凝血酶作用的高度特异性。

                       表  2N-(BnSO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例34，A栏)，N-(环己基甲基磺酰-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例36(i)，B栏)和BzlSO₂-正Val(环)-Gly-Arg-al(实施例8和18，C栏)对人α凝血酶(与选定的丝氨酸蛋白酶相比)酰胺分解活性抑制作用的IC₅₀

酶	A IC50(nM)	BIC50(nM)	C IC50(nM)
				α凝血酶	0.93	4.54	12.4
rt-PA	NI*	NI*	NI*
				血纤维蛋白溶酶	NI*	NI*	NI*
aPC	NI*	NI*	NI*
				胰凝乳蛋白酶	NI*	NI*	NI*
胰蛋白酶	72	7.86	1550

*-在抑制剂最大试验浓度(2500nM)没有观测到抑制作用。

下文表3显示具有不同R₁和X基团以及环大小的本发明化合物对凝血酶、fXa和胰蛋白酶的特异性。以下数据证明了化合物对凝血酶的特异性。

                                         表3

化合物的实施例号	R1-X基团；Y为氢(除非另作说明)	环的大小	IC50(nM)，凝血酶	IC50(nM)，血纤维蛋白溶酶	IC50(nM)aPC	IC50(nM)rt-PA
							8,18	BnSO2	6	6.2	nd	＞2500	＞2500
34	BnSO2	7	0.71	nd	nd	nd
							36(a)	PhSO2	6	159	＞2500	＞2500	＞2500
36(i)	ChxCH2SO2	7	4.54	＞2500	nd	nd
							36(n)	PhNHSO2	7	14.2	＞2500	nd	nd
36(p)	Bn(3-CF3)SO2	7	1.9	＞2500	＞2500	＞2500
							36(q)	Bn(2-Me)	7	1.71	nd	nd	nd
36(r)	Bn(3-Me)	7	0.93	nd	nd	nd
							55	R1-X是H；Y是Bn	6	2.07	＞2500	＞2500	＞2500
64	R1-X是H；Y是Bn	7	5.41	＞2500	＞2500	＞2500
							72(a)	PhCH2CH2	6	3.09	＞2500	＞2500	＞2500

nd即未测定。实施例C化合物在人和大鼠血浆中的离体抗凝作用

使用正常人和大鼠的混合血浆，在较大的抑制剂浓度范围内测定活化部分凝血活酶时间(APTT)的延长，由此测定BzlSO₂-正Val(环)-Gly-Arg-al(实施例8)和N-(BnSO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例34)的离体抗凝作用。

由George King Biomedical，Overland Park，KA购得新鲜冷冻的加柠檬酸盐的正常人混合血浆。利用标准方法，从麻醉的大鼠收集加柠檬酸盐的全血制备正常大鼠的混合血浆。将血浆快速冷冻，保存于-80℃。

根据制造者的说明书，使用Coag-A-Mate RA4自动血凝度计(General Di-agnostics，Organon Technica，Oklahoma City，OK)，以自动APTT试剂(Organon Technica，Durham，NC)为血凝引发剂，测定APTT。以快速解冻的血浆制备一系列被测化合物的稀释液，然后取200微升加入试验板的孔中。如图5和图7所示，在鼠和人的血浆中，BzlSO₂-正Val(环)-Gly-Arg-a1和N-(Bn-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛都分别以剂量依赖性的方式延长了APTT，这表明了其在两种哺乳动物中的抗凝血作用。实施例D化合物在血栓形成的实验大鼠模型中抗血栓形成能力的评价

使用如下建立的急性血管内血栓形成实验模型测定BzlSO₂-正Val(环)-Gly-Arg-al(实施例8)和N-(BnSO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛(实施例34)的抗血栓形成作用(防止血栓形成)。1.FeCl₃诱导的血小板依赖性动脉血栓形成的大鼠模型

这是血小板依赖性动脉血栓形成的标准模型，已用于评价直接凝血酶抑制剂之类可能的抗血栓形成的化合物。Kurz，K.D.，Main，B.W.和Sandusky，G.E.，Thromb.Res.，60：269-280(1990)。在此模型中，用一张吸收了FeCl₃新鲜溶液的滤纸局部处理大鼠的颈动脉片段，由此在其中形成富血小板的闭塞性血栓。FeCl₃被认为扩散入被处理的动脉片段，引起受作用的血管表面的去内皮化作用。从而导致血液与内皮下结构接触，并由此导致血小板的粘附，凝血酶的形成和血小板的凝聚，由此形成闭塞性血栓。利用超声波流量计监测被测化合物对使用FeCl₃后发生的闭塞性血栓形成的作用，并以此为一级终点。使用流量计来测定颈动脉血流量是对使用凝块形成的热测定的原始方法的改进。Kurz，K.D.，Main，B.W.和Sandusky，G.E.，Thromb.Res.，60：269-280(1990)。

雄性Harlan Sprague Dawley大鼠(420-450g)在使用前至少适应72小时，接受手术前禁食12小时，但可自由饮水。准备动物，用Nembutal麻醉，然后插入导管以便测定血压、给以药物和麻醉剂。沿中线切开颈部，利用钝器解剖术和摊开技术从颈动脉鞘分离一段2cm的血管，由此分离得左颈动脉。在分离的血管的近心端(基部)和远心端内设丝缝合线留出空隙，以便在血管的近端附近设置超声波流量探头(Transonic)。然后用固定臂将探头固定。

手术后，将动物随机分成对照组(盐水)和用被测化合物(BzlSO₂-正Val(环)-Gly-Arg-al或N-(BnSO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛)处理组，每剂量每组至少6个动物。在放置了流量探头之后，在刺激血栓形成前5分钟，根据表3中的剂量，将被测化合物以静脉推注单剂量的形式给药。在t＝0时，将一张直径3mm的浸有10微升35％的FeCl₃新鲜水溶液的滤纸(Whatman#3)贴于分离的颈动脉片段上距流量探头的远端。进行60分钟的血压、血流、心率和呼吸监测。

记录闭塞的发生(即测得血流量为零)，作为一级终点。2.结果

表4和表5中血栓形成性闭塞发生的减少证明了BzlSO₂-正Val(环)-Gly-Arg-a1和N-(BnS0₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛作为抗血栓形成剂在此体内模型中防止血栓形成的效果。表4.BzlSO₂-正Val(环)-Gly-Arg-al在大鼠体内血栓形成的FeCl₃模型中的结果

处理组	剂量(mg/kg)	n	闭塞的发生
				盐水	-	6	6/6
BzlSO2-正Val(环)-Gly-Arg-al	0.3	6	6/6
				BzlSO2-正Val(环)-Gly-Arg-al	1.0	6	2/6
BzlSO2-正Val(环)-Gly-Arg-al	3.0	6	1/6*
				BzlSO2-正Val(环)-Gly-Arg-al	5.0	6	0/6*

*-用Fishers检验，与盐水对照组p≤0.05表5.N-(BnSO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛在大鼠体内血栓形成的FeCl₃模型中的结果

处理组	剂量(mg/kg)	n	闭塞的发生
				盐水	-	6	6/6
N-(BnSO2-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛	0.3	6	6/6
				N-(BnSO2-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛	1.0	6	6/6
N-(BnSO2-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛	3.0	6	2/6
				N-(BnSO2-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛	5.0	6	2/6

将闭塞的发生对给以的剂量作图，可测得在此模型中防止50％血栓形成性闭塞的有效剂量(ED₅₀)。这就可以直接将BzlSO₂-正Val(环)-Gly-Arg-al和N-(BnSO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛的抗凝血作用与前文所述曾在此模型中进行评价的其它抗血栓形成剂进行比较。表6列出了几种已知抗凝血剂的ED₅₀，与本发明化合物进行比较。表6.根据ED₅₀，就动脉血栓形成的FeCl₃模型中的防止血栓作用，被测化合物效果与其它抗血栓形成剂的比较

化合物	ED50 a
		标准肝素	200U/kg
Argatroban	3.8mg/kg
		水蛭素tm	3.0mg/kg
BzlSO2-正Val(环)-Gly-Arg-al	0.75mg/kg
		N-(BnSO2-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛	2.1mg/kg

ED₅₀ ^a即在50％的试验动物中防止完全血栓形成性闭塞发生的剂量。

表6中的数据清楚地表明了本发明化合物在此试验模型中防止闭塞性血栓形成的作用。此数据与防止人血栓形成的关联可由其与此表中其它抗凝血剂的比较进行推断，如以下文献所述，这些抗凝血剂曾在此试验模型中以相同方式进行过评价，并已被临床证明具有防止血栓形成的抗血栓形成作用：Heparin-Hirsh，J.N.Engl.J.Med.，324：1565-1574(1992)，Cairns，J.A.等，Chest，102：456S-481S(1992)；Argtroban-Gold，H.K.等，J.Am.Coll.Car-diol.，21：1039-1047(1993)；和Hirulog^tm-Sharma，G.V.R.K.等，Am.J.Cardiol.，72：1357-1360(1993)和Lidon，R.M等，Circulation，88：1495-1501(1993)。本发明化合物与临床有效的抗血栓形成剂标准肝素、Arga-troban和Hirulog^tm在相同的实验性血栓形成的啮齿类模型中的体内比较，结合前文实施例C所述的本发明化合物在大鼠和人血浆中都证明具有抗凝血作用，将使本领域熟练技术人员推定此化合物将是人用的有效的抗血栓形成剂。实施例E化合物的口服活性

给狗口服实施例34的化合物后，对其药效学参数和药物动力学参数进行了评价。成年猎犬(9-12kg)被单独饲养于标准笼中，喂以标准的经质检的商品狗食，任其随意饮用自来水。通过胃管，将20mg/kg口服剂量的被测化合物溶于55ml的去离子水中，对狗给药，然后用水冲洗。在另一方案中，将5mg/kg的被测化合物溶于5ml 0.9％的氯化钠中，通过留置的隐静脉导管快速静脉推注给药。两种给药途径使用相同的狗，在将狗用于两种不同的治疗方案之间有一周的休息间期。

实验期内，以柠檬酸钠(最终浓度为0.38％)为抗凝血剂(9体积的血液用1体积的柠檬酸钠)，由头静脉采集血样。与该抗凝血剂混合后，将每一份血样浸入冰水浆中快速冷却。采集后10分钟内离心分离血浆(4℃，2400rpm，10分钟)，然后转移至冷冻试管中，在分析前保存于-70℃。

从血浆中萃取化合物，利用HPLC分离，利用一荧光基团进行柱后衍生，由此测定化合物的血浓度。利用APTT试验测定血液的凝固时间，此试验测定化合物使活化部分凝血活酶时间(APTT)的延长。由George King Biomedical，Overland Park，KS购得新鲜冷冻的加柠檬酸盐的正常人混合血浆。根据制造者的说明书，使用Coag-A-Mate RA4自动血凝度计(General Diagnostics，Organon Technica，Oklahoma City，OK)，以自动APTT Platelin^L试剂(Organon Technica，Durham，NC)为血凝引发剂，测定APTT。以快速解冻的血浆制备每一血样的一系列稀释液，然后取200微升APTT试剂加入试验板的孔中，由此进行试验。

比较静脉注射和口服后的AUC值(曲线下面积，表示一段时间内化合物在血液中的水平)，由此计算通过口服途径给药后供试化合物的全身生物利用度。总体上说，在就剂量差异进行校正之后，给予的供试化合物表现出约66％的生物利用度(口服AUC与静脉注射AUC之比)。此外，被测的实施例34化合物能被狗迅速吸收，因为在口服(两种剂量)20至30分钟内，APTT就显著增加，并在较高水平维持长达2小时。给药30至40分钟后，化合物在血液中的水平达到最大值。APTT测定的数据证明了被测化合物的血浆中水平和抗凝血作用之间具有良好的相关性(r²＝0.64)。

Claims (38)

1.一种化合物，其特征在于，它具有以下结构式：

其中

(a)X选自-S(O)₂-、-N(R′)-S(O)₂-、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-NH-C(＝O)-、-P(O)(R″)-和直接连接键，其中的R′氢原子、1至约4个碳原子的烷基、约6至14个碳原子的芳基或约6至16个碳原子的芳烷基，R″是NR′、OR′、R′、或SR′，条件是R″不是NH、OH、H或SH；

(b)R₁选自(1)1至约12个碳原子的烷基，(2)经约5至8个碳原子的环烷基取代的1至约3个碳原子的烷基，其环碳原子可任意被羟基、氨基、胍基、脒基或1至约3个碳原子的烷氧基或烷基所取代，(3)3至约15个碳原子的环烷基，其环碳原子可任意被羟基、氨基、胍基、脒基或1至约3个碳原子的烷氧基或烷基所取代，(4)4至约10个环原子的杂环烷基，环原子选自碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮和S(O)_i，其中的i是0、1或2，环碳原子可任意被羟基、1至约3个碳原子的烷氧基或烷基、氨基、胍基或脒基取代，(5)4至约10个环原子的杂环基，环原子选自碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮和S(O)_i，其中的i是0、1或2，环碳原子可任意被羟基、1至约3个碳原子的烷氧基或烷基、氨基、胍基或脒基取代，(6)可以经约5至8个碳原子的环烷基取代的约3至6个碳原子的链烯基，环碳原子可以被羟基、氨基、胍基、脒基或1至约3个碳原子的烷氧基或烷基取代，(7)约6至约14个碳原子的芳基，可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代，(8)5至14个原子的杂芳基，环原子选自碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮和S(O)_i，其中的i是0、1或2，可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代，(9)芳环上可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代的约7至15个碳原子的芳烷基，(10)6至11个原子的杂芳烷基，环原子为碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮和S(O)_i，其中的i是0、1或2，可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代，(11)芳环上可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代的约8至15个碳原子的芳链烯基，(12)7至12个原子的杂芳链烯基，环原子为碳原子和杂原子，其中的杂原子选自氧、氮和S(O)_i，其中的i是0、1或2，可以分别被Y₁、Y₂和/或Y₃单取代、二取代或三取代，(17)1至约12个碳原子的全氟烷基，(18)约6至约14个碳原子的全氟芳基，(19)约7至15个碳原子的全氟芳烷基，(20)氢原子，和(21)

，其中 是具有3至6个环碳原子的5至7元的杂环，其中的V是-CH₂-、-O-、-S(＝O)-、-S(O)₂-或S，

其中的Y₁、Y₂和Y₃是：

(i)各自选自氢原子、卤原子、氰基、四唑基、氨基、胍基、脒基、甲基氨基和甲基胍基，-CF₃、-CF₂H、-CF₂CF₃、-CH(CF₃)₂，-C(OH)(CF₃)₂、-OCF₃、-OCF₂CF₃、-OC(O)NH₂、-OC(O)NHZ₁、-OC(O)NZ₁Z₂、-NHC(O)Z₁、-NHC(O)NH₂、-NHC(O)NHZ₁、-NHC(O)NZ₁Z₂、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-C(O)NHZ₁、-C(O)OZ₁、-P(O₃)H、-P(O)₃H₂、-P(O)₃(Z₁)₂、-S(O)₃H、-S(O)_mZ₁、-Z₁、-OZ₁、-OH、-NH₂、-NHZ₁和-NZ₁Z₂，其中m是0、1或2，Z₁和Z₂各自选自1至约12个碳原子的烷基、约6至14个碳原子的芳基、其中有1至约9个碳原子的约5至14个原子的杂芳基、约7至15个碳原子的芳烷基和约6至11个原子的杂芳烷基(其中有约3至9个为碳原子)，或

(ii)Y₁和Y₂一起为-OC(Z₃)(Z₄)O-，其中Z₃和Z₄各自选自氢原子、1至约12个碳原子的烷基、约6至14个碳原子的芳基、具有1至约9个碳原子的5至约14个原子的杂芳基、约7至15个碳原子的芳烷基、约6至11个原子的杂芳烷基(其中有约3至9个为碳原子)，

(c)Q是-(CH₂)_n-(其中n是整数1至4)，或-(CH₂)_qR₄-，其中q是1或2，R₄是-S(O)_p-、-O-、-N(R₅)-，其中p是0、1或2，R₅选自氢原子、1至4个碳原子的烷基和1至4个碳原子的酰基；

(d)R₂选自氢原子、1至4个碳原子的烷基或2至4个碳原子的链烯基；和(e)Y选自R₁取代基，条件是Y不是 以及它们的药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的X选自一直接连接键、-SO₂-、-NH-S(O)₂-、和-N(R′)-S(O)₂-。

3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，其中的X是一直接连接键或-SO₂-。

4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的R₁选自烷基，芳烷基和芳基。

5.根据权利要求4所述的化合物，其特征在于，其中的R₁选自取代或未取代的苯基或萘基。

6.根据权利要求5所述的化合物，其特征在于，其中的R₁被选自-C(O)OH、-C(O)OZ₁、-CH₃、-OCH₃和-CF₃的取代基所取代。

7.根据权利要求4所述的化合物，其特征在于，其中的R₁是芳烷基。

8.根据权利要求7所述的化合物，其特征在于，其中的R₁是取代或未取代的苄基。

9.根据权利要求8所述的化合物，其特征在于，其中的R₁是环己基或环己基甲基。

10.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的Q是-(CH₂)₂-或-(CH₂)₃-。

11.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的R₂是氢原子。

12.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的Y选自

(a)氢原子

(b)苯基-(CH₂)_i-，其中的i是整数0至3，苯基可以被Y₁、Y₂和/或Y₃分别单取代、二取代或三取代，

(c)杂芳基-(CH₂)_i-，其中的i是整数0至3，杂芳基可以被Y₁、Y₂和/或Y₃分别单取代、二取代或三取代，

(d)杂环烷基-(CH₂)_i-，其中的i是整数0至3，杂环烷基可以被羟基、有1至约3个碳原子的烷氧基或烷基取代，

(e)C₅至C₈环烯基，可以被Z₅、Z₆和/或Z₇取代，以及

(f)C₅至C₈环烷基，可以被Z₅、Z₆和/或Z₇分别单取代、二取代或三取代，其中的Z₅、Z₆和/或Z₇分别选自-R₆、-OR₆和-CO₂R₆，其中R₆选自氢原子、甲基和1至3个碳原子的烷基，以及

(g)-(CH₂)_b-Z₅，其中b是整数0至6。

13.根据权利要求12所述的化合物，其特征在于，其中的Y是芳烷基或环烷基。

14.根据权利要求13所述的化合物，其特征在于，其中的Y是取代或未取代的苄基或1-萘基甲基。

15.根据权利要求14所述的化合物，其特征在于，其中的Y被选自-C(O)OH、-C(O)OZ₁、-CH₃、-OCH₃和CF₃的取代基所取代。

16.根据权利要求13所述的化合物，其特征在于，其中的Y是具有约5至8个环碳原子的环烷基。

17.根据权利要求16所述的化合物，其特征在于，其中的Y被选自-C(O)OH、-C(O)OZ₁、-CH₃和-OCH₃的取代基所取代。

18.根据权利要求12所述的化合物，其特征在于，其中的Y是氢原子。

19.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的X是-S(O)₂-、R₁是取代或未取代的芳烷基，Q是-(CH₂)₂-，R₂是氢原子。

20 根据权利要求19所述的化合物，其特征在于，其中的R₁是取代或未取代的苄基。

21根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的X是-S(O)₂-，R₁是取代或未取代的芳烷基，Q是-(CH₂)₃，R₂是氢原子。

22.根据权利要求21所述的化合物，其特征在于，其中的R₁是取代或未取代的苄基。

23.一种化合物，其特征在于，它选自：

(a)N-苄基磺酰-正Val(环)-Gly-L-精氨醛，

(b)N-(正Val(环)-Gly)-L-精氨醛，

(c)D，L-a-苄基-正Val(环)-Gly-L-精氨醛，

(d)D，L-a-苄基-正Leu(环)-Gly-L-精氨醛，

(e)N-(1-萘基-SO₂-正Val(环)-Gly-L-精氨醛，

(f)N-(BnSO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛，

(g)N-(2-甲氧羰基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛，

(h)N-(2-三氟甲基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛，

(i)N-(环己基甲基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛，

(j)N-(2-噻吩甲基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛，

(k)N-(苯基氨基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛，

(l)N-(3-甲氧羰基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛，

(m)N-(3-三氟甲基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛，

(n)N-(2-甲基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛，

(o)N-(3-甲基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛，

(p)N-(3-甲氧基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛，

(q)N-(2-氯苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛，

(r)N-(2-甲基-5-氟苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛，

(s)N-(2-甲基-5-甲氧基苄基-SO₂-正Leu(环)-Gly)-L-精氨醛，

(t)N-〔(S)-3-N-苯基乙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酰〕-L-精氨醛，

(u)N-〔(S)-3-N-苯基丙基氨基-2-氧代-1-哌啶乙酰〕-L-精氨醛，

(v)N-〔(S)-3-N-苯基乙基氨基-六氢-2-氧代-氮杂-1-乙酰〕-L-精氨醛。

24.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的X是-S(O)₂-。

25.根据权利要求24所述的化合物，其特征在于，其中的Q是-CH₂-。

26.根据权利要求22所述的化合物，其特征在于，其中的Q是-CH₂S(O)_n-。

27.根据权利要求24所述的化合物，其特征在于，其中的Q是-(CH₂)₂-或-(CH₂)₃-。

28.根据权利要求27所述的化合物，其特征在于，其中的R₁是芳基或芳烷基。

29.根据权利要求28所述的化合物，其特征在于，其中的R₂是氢原子。

30根据权利要求29所述的化合物，其特征在于，其中的R₁被Y₁、Y₂和/或Y₃分别单取代、二取代或三取代，Y₁、Y₂和/或Y₃分别选自-C(O)OH、-C(O)OZ₁、-S(O)_mZ₁和-S(O)₃H。

31.根据权利要求29所述的化合物，其特征在于，其中的R₁是取代的萘基或取代的苄基。

32.根据权利要求29所述的化合物，其特征在于，其中的R₁是未取代的萘基或未取代的苄基。

33.根据权利要求31所述的化合物，其特征在于，其中的R₁是取代的苄基。

34.根据权利要求32所述的化合物，其特征在于，其中的R₁是苄基。

35.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中的X是-S(O)₂-，R₁是芳烷基，R₂是氢原子。

36.根据权利要求35所述的化合物，其特征在于，其中的R₁是未取代的苄基或取代的苄基。

37.根据权利要求35所述的化合物，其特征在于，其中的R₁被Y₁、Y₂和/或Y₃分别单取代、二取代或三取代，Y₁、Y₂和/或Y₃分别选自-C(O)OH、-C(O)OZ₁、-S(O)_mZ₁和S(O)₃H。

38.根据权利要求37所述的化合物，其特征在于，其中的Q是-(CH₂)₂-或-(CH₂)₃-。

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