CN1151154A

CN1151154A - 新型抗肿瘤及抗白血病物质、其制备方法及其药物组合物

Info

Publication number: CN1151154A
Application number: CN95193728A
Authority: CN
Inventors: J·雷博尔; J·普罗沃斯特
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1994-06-23
Filing date: 1995-06-20
Publication date: 1997-06-04
Also published as: JPH10504536A; WO1996000205A1; EP0767773A1; US5716994A; AU2798095A; PL317895A1; CA2192711A1; FI965166A0; CZ380696A3; FI965166A; SK166796A3; TW374764B; BR9508364A; HUT76337A; MX9606534A; NO965504D0; NO965504L; HU9603541D0; BG101071A

Abstract

本发明涉及3-(3-羟基-4-甲氧基苄基)-7-亚甲基-1-乙烯基-2，3，3a，4，7，7a-六氢化茚-4-酮：和3-(3-羟基-4-甲氧苄基)-4-羟基-7-甲基-1-乙烯基-1，2-二氢化茚：及其立体异构体、由植物水车前得到它们的方法及其药物组合物。

Description

新型抗肿瘤及抗白血病物质、其制备方法及其药物组合物

本发明涉及3-(3-羟基-4-甲氧基苄基)-7-亚甲基-1-乙烯基-2，3，3a，4，7，7a-六氢化茚-4-酮：

和3-(3-羟基-4-甲氧苄基)-4-羟基-7-甲基-1-乙烯基-1，2-二氢化茚：及其立体异构体、由植物水车前得到它们的方法及其药物组合物。

更具体地，本发明涉及具有下列特征的化合物I：

-旋光本领：[α]²⁰ _(Na589)＝-20,8±1,0(CH₂Cl₂，c＝0,5)

[α]²⁰ _(Hg436)＝-32±1,2(CH₂Cl₂，c＝0,5)

-红外光谱：主要特征吸收谱带位于3400，3070，

2925，2840，1660，1580，1500，1435，1270，1125和1025cm^-1.

-质谱(DCI NH₃)：328(M＋NH₄)⁺

(EI)：311(M＋NH₄-OH)⁺

-质子核磁共振光谱(600 MHz；CDCl₃；δ

ppm)：6,99(d，J＝9Hz，1H)；6,80(d，J＝2Hz，1H)；6,77(d，J＝8Hz，1H)，6.69

(dd，J＝2 et 8Hz，1H)；5,94(d，J＝9Hz，1H)；5,78(m，1H)；5053(s，1H)；5,32

(m，2H)；4,98(d，J＝10Hz，1H)；4,95(d，J＝17Hz，1H)；3,88(s，3H)；3,07(m，

1H)；2,88(dd，J＝6 et 8Hz，1H)；2,80(t，J＝8 et 8Hz，1H)；2,62(m，1H)；2,51

(m，2H)；1,74(m，1H)；1,58(m，1H).

更具体地，本发明涉及具备下列特征的化合物II：

-旋光本领：[α]²⁰ _(Na589)＝+32,3±1,3(CH₂Cl₂；c＝0.5)

[α]²⁰ _(Hg436)＝+75,0±1,8(CH₂Cl₂；c＝0,5)

-红外光谱：主要特征吸收谱带位于3419，3074，

1635，1592，1495，1271，1126 et 1029cm^-1.

-质谱(DCI NH₃)：328(M＋NH₄)⁺

(EI)：310(M)⁺

-质子的核磁共振谱(600MHz；CDCl₃；δppm；

耦合常数J Hz)：1,95(m，1H)；2,05(m，1H)；2,18(s，3H)；2,62(d，

J＝8 et 13，1H)；3,16(dd，J＝6 et 13，1H)；3,58(m，1H)；3,83(m，1H)；3,88(m，

1H)；4,25(s，1H)；4,98(d，J＝8，1H)；5,01(d，J＝16，1H)；5,58(s，1H)；5,78(dd，

J＝8 et 16，1H)；6,53(d，J＝7，1H)；6,69(dd，J＝7 et 1，1H)；6,79(d，J＝7，1H)；

6,82(dd，J＝1，1H)；6,85(d，J＝7，1H)

-紫外光谱：

λmax＝282nm(ε＝4650)；225nm(肩峰)；207(ε＝48800)(c＝

10,1g/cm³；甲醇)

λmax＝282nm；225nm(肩峰)；206nm(c＝10,1mg/cm³；

甲醇-盐酸)

λmax＝297nm(肩峰)；288nm；243nm(肩峰)；214nm(c＝

10,1mg/cm³；甲醇-苟性钾)

3-(3-羟基-4-甲氧苄基)-7-亚甲基-1-乙烯基-2，3，3a，4，7，7a-六氢化茚-4-酮和3-(3-羟基-4-甲氧基苄基)-4-羟基-7-甲基-1-乙烯基-1，2-二氢化茚可以通过借助适宜溶剂萃取植物水车前、随后将所得到的萃取液中的上述两种化合物进行分离而得到。

属于水鳖科的水车前是一种开花后沉入水下生长的或部分漂浮的水生植物。对于水下部分来说，水车前的叶子是成形根部，呈缩小的冠状。漂浮的长的部分为有叶柄的、椭圆形和披针形、长方形或心形，花朵为雌雄同体的和单生的、无柄的、具有长的带柄的佛焰苞，由3个线形和长方形萼片和3个宽大的卵球形或环形花瓣构成。

按照本发明，以整个植物形式存在的水车前通常被干燥和被粉碎并且被选自C_1-4脂族醇和C_1-6脂族醚的溶剂处理一次或多次以便于浓缩之后提供一种干燥萃取物，它被C_5-8脂族烃或C_5-7脂环烃溶解以便得到一种溶液，该溶液中的不溶物通过过滤被分离，经过浓缩该溶液得到干燥萃取液，借助色谱法分离得到化合物I或II。

为了实施本发明方法制备化合物I，特别有利的作法是借助乙醇萃取整个植物并且用脂族烃如己烷处理所得到的干燥提取液。

为了实施本发明方法制备化合物II，特别有利的作法是借助甲基叔丁基醚萃取整个植物并且用与腈如乙腈结合使用的脂族烃如庚烷处理所得到的干燥萃取液。

一般借助高性能液相色谱或离心分配色谱由采用视需要与腈结合使用的脂族烃处理得到的萃取液分离化合物I或II。

化合物I和II具有显著的生物特性。

在体外，化合物I和II能够抑制微管蛋白聚合。

来自猪脑浆的微管蛋白通过按照M.L.SHFLANSKI等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，70,765-768(1973)的方法进行三次聚合一解聚过程、随后按照M.D.WEINGARTEN等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72,1858-1862(1975)的方法在磷纤维素上进行色谱提纯。

处在缓冲液(Mes 0.05M(pH＝6.8)、MgCl₂ 0.25mM、EGTA 0.5mM、甘油3.4M、GTP1mM)中的浓度为8.5μM的微管蛋白在37℃于加入MgCl₂(6mM)之后聚合30分钟，以处在无水乙醇中的1mg/cm³溶液形式存在的化合物I或II的浓度由0.8μM升至16μM。

借助分光光度计于350nm处观察到的浊度上升可以说明微管蛋白形成微管。

化合物I和II能够抑制微管蛋白聚合，这可以通过潜伏期延长、聚合速度降低以及在静置状态下浊度更低得到证实。化合物I对微管蛋白的聚合产生50％抑制作用的浓度低于5μM，甚至低于1μM。

在体外，化合物I和II对鼠类白血病细胞系P388和抗性系P388/DOX的细胞毒性低于1μg/cm³，对化合物I来说甚至低于1ng/cm³。

下列实施例描述本发明。

实施例1

8.8kg整个植物被干燥并被细碎的水车前被置于配有Tergal^网和60升99.9％乙醇的单片滤器中搅拌，在环己烷存在下变性一小时。在2巴的氮气压力下过滤后，用60升乙醇再次萃取植物1小时，随后用30升乙醇萃取12小时。用30升乙醇洗涤植物。

在温差散热蒸发器中浓缩如此得到的乙醇溶液直至体积降至15升为止，随后在40℃减压浓缩至干。

如此得到的80g绿色半液萃取溶于3升己烷。过滤不溶物(7g)后，将滤液浓缩至干。得到73g产物(萃取物A)，其对微管蛋白的聚合的抑制活性(CI₅₀)为75μg/cm³。

用200cm³环己烷溶解9.4g萃取物A。滤除惰性不溶物(2g)后，将环己烷溶液置于二氧化硅Merck(0.040～0.063mm)200g柱上(直径/高度比值为15)。以5％CH₂Cl₂的梯度增长的环己烷/CH₂Cl₂混合物进行洗提，得到500cm³馏分。合并用环己烷-CH₂Cl₂ 45-55、40-60和35-65(体积)混合物洗提得到的馏分并在约20℃减压浓缩至干。得到1.2g其活性为2.5μg/cm³的产物。

将此产物溶于5cm³CH₂Cl₂/MeOH(99/1体积)混合物并且在50g二氧化硅Merck60H柱上(直径/高度比值为1.5)进行色谱提纯(使用同种溶剂制备)。用CH₂Cl₂-MeOH(99-1体积)混合物洗提，得到2cm³馏分。合并馏分41～68并且减压浓缩至干。得到70mg活性为1μg/cm³的产物，用柱BIORAD C18 HL-90-10进行高性能液相色谱提纯，用乙腈-水混合物以3cm³/分钟的流速进行洗提，借助紫外吸收于254nm处检测。与19分钟的滞留峰值对应的峰值收集提供14mg浅黄色半固体纯态3-(3-羟基-4-甲氧基苄基)-7-亚甲基-1-乙烯基-2，3，3a，4，7，7a-六氢化茚-4-酮，其特征如下：

-旋光本领：[α]²⁰ _(Na589)＝-20,8±1,0(CH₂Cl₂，c＝0,5)

[α]²⁰ _(Hg436)＝-32±1,2(CH₂Cl₂，c＝0,5)

-红外光谱：主要特征吸收谱带位于3400，3070，

2925，2840，1660，1580，1500，1435，1270，1125 et 1025cm^-1.

-质谱(DCI NH₃)：328(M＋NH₄)⁺

(EI)：311(M＋NH₄-OH)⁺

质子核磁共振谱(600MHz；CDCl₃；δ

ppm)：6,99(d，J＝9 Hz，1H)；6,80(d，J＝2Hz，1H)；6,77(d，J＝8Hz，1H)，6.69

(m，2H)；1,74(m，1H)；1,58(m，1H).

所得到的产物可以借助Merck F254二氧化硅薄层色谱被直观表示，用CH₂Cl₂-MeOH(99-1体积)混合物洗提，于100℃加热炉上加热后用0.1％硫酸铈的乙醇溶液进行显色。产物呈Rf＝0.5的紫红色亮斑。

实施例2

将2g实施例1得到的萃取物A溶于10cm³乙酸乙酯/庚烷/甲醇/水(1/2/2/1体积)并且用具有245cm³柱的CPCSANKI装置进行逆流分配色谱提纯，操作条件如下：

固定相：重相

流动相：轻相

方向上升

旋转速度： 1000转/分钟

流量： 3cm³/分钟

滞留： 80％

方向反转： 170分钟

在二相平衡的条件下进行注射。每2分钟收集馏分。薄层色谱和测定表明馏分56～85含有(3-羟基-4-甲氧苄基)-7-亚甲基-1-乙烯基-2，3，3a，4，7，7a-六氢化茚-4-酮。在实施例1所述条件下借助HPLC提纯产物得到2mg纯化合物I。

实施例3

85kg整个植物被干燥并被细碎的水车前被置于配有Tergal^网和400升甲基叔丁基醚的单片滤器中搅拌一小时，静置接触12小时。在2巴氮气压力下过滤后，再次用400升甲基叔丁基醚萃取植物1小时。静置接触12小时。用200升甲基叔丁基醚洗涤植物。

在温差散热蒸发器中浓缩该醚溶液直到体积为15升为止，随后在40℃减压浓缩至干。

因此得到754g绿色半液萃取，被溶于30升庚烷/乙腈(1/1体积)混合物。滤除惰性不溶物后，将滤液浓缩至干。得到270g油状棕绿色产物。

将10g萃取物溶于150cm³乙酸乙酯/庚烷/甲醇/水(2/3/3/2体积)混合物，随后用被分为3个筒管的体积为2500cm³的SECC800型ITO^装置进行逆流分配色谱提纯，操作条件如下：

固定相：重相

流动相：轻相

方式：上升

转速： 380转/分钟

流速： 8cm³/分钟

滞留： 46％

在2相平衡条件下进行注入。每8分钟收集馏分。回收30份馏分后停止分离。合并馏分19～26并浓缩至干。得到3.5g油状萃取物，借助二氧化硅Amicon(0.030-0.070mm)柱(3cm高，直径为1.2cm)进行色谱分离化合物II。用庚烷洗提(甲基叔丁基醚梯度增长)，得到5cm³馏分。合并用庚烷/甲基叔丁基醚(8-2，体积)混合物洗提的馏分22和23并且减压浓缩至干。得到0.5mg浅黄色固体化合物II，其特征如下：

-旋光本领：[α]²⁰ _(Na589)＝+32,3±1,3(CH₂Cl₂；c＝0.5)

[α]²⁰ _(Hg436)＝+75,0±1,8(CH₂Cl₂；c＝0,5)

-红外光谱：主要特征吸收谱带位于3419，3074，

1635，1592，1495，1271，1126 et 1029cm^-1.

-质谱(DCI NH₃)：328(M＋NH₄)⁺

(EI)：310(M)⁺

-质子核磁共振谱(600MHz；CDCl₃；δ

ppm；耦合常数J Hz)：1,95(m，1H)；2,05(m，1H)；2,18(s，3H)；

2,62(d，J＝8 et 13，1H)；3,16(dd，J＝6 et 13，1H)；3,58(m，1H)；3,83(m，1H)；

3,88(m，1H)；4,25(s，1H)；4,98(d，J＝8，1H)；5,01(d，J＝16，1H)；5,58(s，1H)；

5,78(dd，J＝8 et 16，1H)；6,53(d，J＝7，1H)；6,69(dd，J＝7 et 1，1H)；6,79(d，J＝

7，1H)；6,82(dd，J＝1，1H)；6,85(d，J＝7，1H)

-紫外光谱：

λmax＝282nm(ε＝4650)；225nm(肩峰)；207(ε＝48800)(c＝

10,1g/cm³；甲醇)

λmax＝282nm；225nm(肩峰)；206nm(c＝10,1mg/cm³；

甲醇盐酸)

λmax＝297nm(肩峰)；288nm；243nm(肩峰)；214nm(c＝

10,1mg/cm³；甲醇-苟性钾)。

可以借助二氧化硅Merck F254的薄层色谱使所得到的产物可被看到，用CH₂Cl₂-甲醇(99-1体积)混合物洗提，用酚的特定GIBBS试剂进行显色。产物呈Rf＝0.48的蓝色亮斑。

化合物I和II具备明显的抑制不正常细胞增殖的活性并且能够对与不正常细胞增殖相关的病症患者产生治疗作用。这些病症包括不同组织和/或器官的恶性细胞或非恶性细胞的不正常细胞增殖，这些器官和/或组织包括，但不限于肌肉组织、骨骼或结缔组织、皮肤、脑、肺、性器官、淋巴系统或肾、乳房细胞或血细胞、肝、消化器官、肾上腺、胰腺或甲状腺。这些病症还包括固体肿瘤、牛皮癣、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、前列腺癌、肠癌、胃癌、肾癌或睾丸癌、Kaposi肉瘤、胆管癌、绒毛膜癌、神经母细胞癌、Wilms肿瘤、Hodgkin病、黑素瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴性白血病、急性或慢性颗粒细胞淋巴瘤。本发明的新型化合物特别适用于治疗乳腺癌、肠癌、肾癌或卵巢癌。本发明化合物可被用于防治或延缓这些病症的出现或复发或用于治疗这些疾病。

本发明的化合物可以依据适用于所选用的给药途径的不同形式被施用于患者，这些给药途径以非肠胃方式为佳。非肠胃给药包括静脉内给药、腹膜内给药、肌肉或皮下给药。更优选腹膜内或静脉内给药。

本发明还包括含有其数量足以适用于人体或兽体治疗的化合物I或II的药物组合物。该组合物可按照常规方法采用一种或多种药物可接受的助剂、载体或赋形剂来制备。适宜的载体包括稀释剂、无菌含水介质和无毒溶剂。该组合物优选以水溶液或悬浮液、可被注射溶液的形式存在，其中含有乳化剂、着色剂、防腐剂或稳定剂。

可以依据产物的溶解性和化学性质、具体的给药途径和有经验的药剂实践选择助剂或赋形剂。

对于非肠胃给药来说，可以使用含水或不含水无菌溶液或悬浮液。为了制备非水溶液或悬浮液，可以使用天然植物油如橄榄油、芝麻油或石蜡油或可注射有机酯如油酸乙酯。这些水溶液适合于在宜于通过例如足量NaCl或葡萄糖调节其PH值和实现等渗性的条件下进行静脉内注射。可以通过加热或其它任何不改变组成的方式进行灭菌处理。

当然，所有进入本发明组合物的化合物都应该是纯态的或者对其用量来说是无毒的。

该组合物可以含有至少0.001％治疗活性化合物。组合物中活性化合物的数量符合剂量学标准。优选地，该组合物的制备方式导致非肠胃给药单位剂量含约0.01-100mg活性化合物。

治疗过程可以与包括抗致瘤药疗法、单克隆抗体疗法、免疫治疗或放射治疗在内的其它疗法或生物响应改性疗法共同进行。响应改性剂包括，但不限于淋巴细胞活素和细胞因子如白介素、干扰素(α、β或δ)和TNF。其它在治疗由于细胞不正常增值造成的疾病过程中适用的化学治疗剂包括，但不限于烷基化剂如氮芥类例如氮芥、环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥，磺酸烷基酯如白消安，亚硝替脲如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀和链佐星，三氮烯如达卡巴嗪，抗代谢物如叶酸类似物例如甲氨蝶呤，嘧淀类似物如氟尿嘧啶和阿糖胞苷，嘌呤的类似物如巯嘌呤和硫鸟嘌呤，天然化合物如长春花属生物碱如长春碱、长春新碱和Vendesine，表鬼臼毒素如依托泊甙和替尼泊甙，抗生素如放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素和丝裂霉素C，酶如L-天冬酰胺酶，其它试剂如铂的配合物例如顺铂、被取代尿素例如羟基脲，甲肼衍生物如丙卡巴肼，肾上腺皮质抑制剂如米托坦和氨鲁米特，激素与拮抗剂如肾上腺皮质类固醇如泼尼松，黄体制剂如羟孕酮己酸酯、甲氧孕甾酮乙酸酯和甲地孕酮乙酸酯，雌激素如己烯雌酚和乙炔雌二醇；抗雌激素如他莫昔芬，雄激素如丙酸睾酮和氟甲睾酮。

实施本发明方法的剂量可以进行预防治疗或产生最大治疗响应。剂量根据给药形式和待治疗客体的具体特征确定。一般地，其剂量对于由于不正常细胞增殖导致的疾病具有疗效。本发明化合物可以随时被施用以便产生所需疗效。一些患者可以对较重或较轻剂量迅速产生反应，随后需要少量药剂维持药物作用或完全不需要这种维持作用。一般地，在治疗初期采用小剂量，必要时，剂量越来越大，直至产生最佳疗效为止。对于其它患者而言，根据患者的生理需要每日可以保持1-8次用药、以1-4次为佳，对于某些患者同样可能的是有必要每日只用药1-2次。

人体静脉内给药剂量通常为0.05～50mg/kg，以0.01-5mg/kg为佳，以0.1-2mg/kg为更佳。当然，为选择更适宜的剂量，应该考虑给药途径、患者体重、其总体健康状况、其年龄和可以影响疗效的所有因素。

下列实施例描述本发明组合物。

实施例

将40mg实施例1得到的化合物溶于1cm³Emlphor EL 620和1cm³乙醇中，随后用18cm³生理盐水稀释该溶液。

通过导入生理溶质之中将该组合物灌注1小时。

Claims

1.3-(3-羟基-4-甲氧基苄基)-7-亚甲基-1-乙烯基-2，3，3a，4，7，7a-六氢化茚-4-酮

和3-(3-羟基-4-甲氧基苄基)-4-羟基-7-甲基-1-乙烯基-1，2-二氢化茚

及其立体异构体形式。

2.3-(3-羟基-4-甲氧基苄基)-7-亚甲基-1-乙烯基-2，3，3a，4，7，7a-六氢化茚-4-酮，其特征在于：

-旋光本领：[α]²⁰ _(Na 589)＝-20,8±1,0(CH₂Cl₂，c＝0,5)

[α]²⁰ _(Hg436)＝-32±1,2(CH₂Cl₂，c＝0,5)

-红外光谱：主要特征吸收谱带位于3400，3070，

2925，2840，1660，1580，1500，1435，1270，1125 et 1025 cm^-1.

-质谱( DCI NH₃)：328(M＋NH₄)⁺

(EI)：311(M＋NH₄-OH)⁺

- 质子的核磁共振谱(600 MHz；CDCl₃；δen

(dd，J＝2et 8Hz，1H)；5,94(d，J＝9Hz，1H)；5,78(m，1H)；5053(s，1H)；5,32

(m，2H)；1,74(m，1H)；1,58(m，1H).

3·3-(3-羟基-4-甲氧基苄基)-4-羟基-7-甲基-1-乙烯基-1，2-二氢化茚，其特征在于：

-旋光本领：[α]²⁰ _(Na589)＝+32,3±1,3(CH₂Cl₂；c＝0.5)

[α]²⁰ _(Hg436)＝+75,0±1,8(CH₂Cl₂；c＝0,5)

-红外光谱：主要特征吸收谱带位于3419，3074，

1635，1592，1495，1271，1126 et 1029 cm^-1.

-质谱(DCI NH₃)：328(M＋NH₄)⁺

(EI)：310(M)⁺

- 质子核磁共振谱(600 MHz；CDCl₃；δppm；

耦合常数J Hz)：1,95(m，1H)；2,05(m，1H)；2,18(s，3H)；2,62(d，

6,82(dd，J＝1，1H)；6,85(d，J＝7，1H)

-紫外光谱：

λmax＝282 nm(ε＝4650)；225 nm(肩峰)；207(ε＝48800)(c＝

10,1g/cm³；甲醇)

λmax＝282nm；225nm(肩峰)；206nm(c＝10,1mg/cm³；

甲醇-盐酸)

λmax＝297nm(肩峰)；288nm；243nm(肩峰)；214nm(c＝

10,1mg/cm³；甲醇-苟性钾)

4.权利要求1，2或3中任一项的化合物的制备方法，其特征在于借助适宜溶剂萃取植物水车前，随后由所得到的萃取物中分离权利要求1的化合物。

5.按照权利要求4的方法，其特征在于借助选自C_1-4脂族醇和C_1-6脂族醚的溶剂萃取植物，于浓缩之后得到的干燥萃取物溶解于选自C_5-8脂族烃或C_5-7脂环族烃、视需要而定与C_1-4腈缔合的溶剂之中，得到的溶液经浓缩、分离不溶物之后得到萃取物，借助色谱技术分离3-(3-羟基-4-甲氧苄基)-7-亚甲基-1-乙烯基-2，3，3a，4，7，7a-六氢化茚-4-酮或3-(3-羟基-4-甲氧苄基)-4-羟基-7-甲基-1-乙烯基-1，2-二氢化茚。

5.药物组合物，其特征在于含有纯的或与一种或多种稀释剂或助剂以及视具体情况而定与一种或多种治疗活性化合物自身结合的权利要求1，2或3中之一的化合物。