CN115089578B - 一种用于非酒精性脂肪肝病的化合物、组合物及其用途 - Google Patents

一种用于非酒精性脂肪肝病的化合物、组合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN115089578B
CN115089578B CN202210878875.6A CN202210878875A CN115089578B CN 115089578 B CN115089578 B CN 115089578B CN 202210878875 A CN202210878875 A CN 202210878875A CN 115089578 B CN115089578 B CN 115089578B
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
preparation
use according
glp
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210878875.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115089578A (zh
Inventor
章毅
温芝潼
薛欢
路志红
郭超
赵昕
刘云峰
乔希
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi Medical University
Original Assignee
Shanxi Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanxi Medical University filed Critical Shanxi Medical University
Priority to CN202210878875.6A priority Critical patent/CN115089578B/zh
Publication of CN115089578A publication Critical patent/CN115089578A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115089578B publication Critical patent/CN115089578B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/12—Oxygen or sulfur atoms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本发明公开一种用于治疗非酒精性脂肪肝病的式I化合物及其药学上可接受的盐、氘代化合物、溶剂合物、立体异构体。进一步的，本发明公开了化合物ZL001以及包括化合物ZL001为活性成分的组合物在制备治疗非酒精性脂肪肝病中的用途。本发明研究结果证实，化合物ZL001具有显著的缓解/治疗小鼠的非酒精性脂肪肝病的症状。

Description

一种用于非酒精性脂肪肝病的化合物、组合物及其用途
技术领域
本发明属于医药化学领域，具体涉及一种用于治疗非酒精性脂肪肝病的化合物、组合物及其用途。
背景技术
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是指酒精外和其他明确的损肝因素导致的肝细胞内脂肪过度沉积的临床病理综合征。包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。随着社会进步和经济发展，NAFLD已经成为全球性慢性肝病的重要病因。NAFLD相关并发症主要包括高脂血症、肥胖和II型糖尿病。目前还没有明确的治疗NAFLD的药物上市。因此，对NAFLD的治疗药物一直是研究的热点。
胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)激动剂是近年来糖尿病治疗领域的研发热点，产生了多款明星药物，比如度拉糖肽、司美格鲁肽。有研究证明GLP-1R激动剂，除了是潜在的治疗糖尿病的药物，还和多种临床适应症相关，比如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
目前临床的GLP-1R激动剂用于治疗NAFLD，基本都是多肽的大分子。比如专利CN114437181A中所报道的。但基于多肽的大分子GLP-1R激动剂相对于小分子药物，具有一些先天性的劣势。小分子GLP-1R激动剂替代多肽类GLP-1类似物一个明显优势在于它可以口服给药，从而避免皮下注射的不适感，增加患者的依从性。此外，小分子药物一般更加稳定。但是小分子GLP-1R激动剂的开发起步早，但进展缓慢。这是因为GLP-1R需要受体具有特定的构型/构象才能活化，小分子的GLP-1R从化合物结构的开发是非常困难的，这也是很少能见到小分子的GLP-1R激动剂的报道，临床使用的就更加少见。
发明人在前的专利CN 202110103556.3，报道了一种已知的化合物(以下命名为ZL001)，作为GLP-1R激动剂的作用。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)可增强β细胞胰岛素分泌，还能通过作用于α细胞减少胰高血糖素分泌，进而减少肝糖输出，以及作用于中枢和胃，抑制食欲并减缓胃排空，从而降低β细胞负荷。因此GLP-1R受体激动剂是一种有效的降血糖药物。化合物ZL001是一种专利已经过期的工具药化合物，具有p38MAPK和JNKs信号通路。有许多文献报道了化合物ZL001的生理活性，暗示了其具有可能的治疗癌症的活性。发明人预料不到地发现了化合物ZL001是一种小分子的GLP-1R激动剂，并且已经验证了其能够治疗/缓解糖尿病，其降低血糖的作用呈现血糖浓度依赖性，这样在治疗糖尿病时，还能预防低血糖的发生。基于化合物ZL001是一种潜在的GLP-1R激动剂，发明人继续对化合物ZL001的其他临床适应症进行了研究，发现化合物ZL001对非酒精性脂肪肝病具有很好的治疗/缓解作用。
发明内容
化合物ZL001是发明人在先发明专利CN 202110103556.3记载的化合物，其呈现出与GLP-1受体的相关性，能够呈现出血糖浓度依赖的刺激胰岛素分泌的特性。基于ZL001是一种潜在的小分子GLP-1受体激动剂，并且相比于多肽类GLP-1受体激动剂具有临床上的优势和工业上成本降低的商业化前景，在本发明中，发明人对ZL001化合物在治疗非酒精性脂肪肝病中的用途进行探究。研究结果表明，ZL001具有显著的缓解/治疗NASH小鼠的的非酒精性脂肪肝病的症状，并且其治疗活性是通过GLP-1受体激动剂发挥作用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种用于治疗非酒精性脂肪肝病式I化合物，或其药学上可接受的盐、氘代化合物、溶剂合物、立体异构体，
R1选自氢、任选取代的C1-6烷基、-C(O)R4；
R2选自氢、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C1-6烷氧基、-NH-R4；
R3选自氢、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C1-6烷氧基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的杂芳基、-C(O)R4；
R4选自H、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C1-6烷氧基；
R5、R6、R7、R8独立地选自卤原子、硝基、-COOR9、CONHR9、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C1-6烷氧基；
R9选自H，任选取代的C1-6烷基。
优选的，所述化合物结构式Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ所示：
R1为H，R2为甲基、乙基中的一种，R3为H；
Ra选自H、任选取代的C1-6烷基；
Rb选自H、任选取代的C1-6烷基。
在本发明的最优选实施方式中，所述化合物结构如下：
本发明将如上结构的化合物命名为ZL001，其CAS号为22862-76-6。
本发明所述的“任选取代”是指任意的H原子被羟基、卤原子、硝基、C1-4的烷基，C1-4的烷氧基所取代。
第二方面，本发明提供一种用于治疗/缓解非酒精性脂肪肝病的组合物，所述组合物中包含式I化合物(或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体)作为治疗活性成分，以及药剂学上可接受的辅料。
所述药剂学上可接受的辅料选自赋形剂、稳定剂、载体、矫味剂，溶剂、增溶剂、乳化剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、渗透压调节剂、防腐剂、助悬剂、pH调节剂、缓冲剂、增稠剂、保湿剂、稀释剂中一种或两种以上的组合。
所述药物组合物可以制备成如下形式的药物制剂：片剂、胶囊剂、糖浆剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、霜剂、膏剂、凝胶剂、乳剂。
所述药物制剂优选为单位剂量制剂，单位剂量是指针对人或其他哺乳动物的单一剂量适合的单位。单位剂量制剂中式Ⅰ所示的化合物(或其药学上可接受的盐、氘代化合物、溶剂合物、立体异构体)含量为0.01-1000mg，优选1-100mg。
所述单位剂量制剂可以是包装好的制剂，诸如包装在瓶、袋、盒或者安瓿中的片剂、胶囊或者粉剂。单位剂量制剂可以是胶囊，片剂或者其可以是在包装形式中的适当数目的任何剂型。
第三方面，本发明提供一种式I化合物、或者式II化合物、或者式III化合物，或者式IV化合物(或其药学上可接受的盐、氘代化合物、溶剂合物、立体异构体)，或者包括上述化合物的组合物在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的用途。
所述药物具有治疗和/或缓解非酒精性脂肪肝病的作用。
所述非酒精性脂肪肝病包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
所述药物的剂量按照式I化合物(其药学上可接受的盐、氘代化合物、溶剂合物、立体异构体)计，对人的剂量为0.5-10mg/kg/d，优选为1-5mg/kg/d。
在本发明的实践中，优选地，所述药物可通过经口给药方式进行给药。ZL001作为一种小分子的GLP-1R激动剂，相比于现有技术中多肽大分子的GLP-1R激动剂，具有更好的稳定性和患者的依从性，非常适合口服给药。比如胶囊剂、颗粒剂、片剂、冲剂、丸剂、悬浮剂、糖浆剂、乳液剂、喷雾剂。但是其他非口服的给药方式也在本发明的实质内容中，比如注射、鞘内等给药方式。
本领域技术人员可以理解，根据病患的年龄和临床表现，可以对剂型和剂量进行合乎常理的变化。口服，肺部、直肠、静脉、吸入、舌下、鞘内、鼻内都是可以应用的给药方式。
所述组合物中，作为治疗活性成分的式I化合物，或者式II化合物、或者式III化合物，或者式IV化合物，包括它们的以药学上可接受的盐，氨基的酰胺化产物，羧基的酯化产物作为治疗活性成分。药物组合物中，治疗活性成分占药物组合物的1-95％，优选地，治疗活性成分占药物组合物的5-50％；更优选地，治疗活性成分占药物组合物的10-30％。比如在一个具体实施例中，治疗活性成分占药物组合物的10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％。
在本发明另一个实施方式中，药物组合物中的杂质＜1％，优选小于0.5％，更优选＜0.2％，最优选＜0.1％。杂质可能是药物制剂制备时，由其他原辅料引入，也可能是在存放过程中产生的副产物。本领域技术人员可以理解的是，所述药物组合物中的杂质，是非治疗活性成分的存在，式(I)化合物的药学上可接受的衍生物，比如酯化产物，酰胺化产物，溶剂合物，同位素取代物(比如氘代产物)，并不是所述的杂质。
ZL001分子量＜300，涉及ZL001化合物的专利已经到期。ZL001作为一种已知的p38MAPK和JNKs信号通路的工具药，其通过p38和JNK信号通路参与多种细胞活动，如细胞增殖与分化、凋亡等，暗示ZL001具有潜在的抗肿瘤活性，可用于抗肿瘤药物的开发。ZL001具有激动GLP-1受体的作用是发明人首次发现，可以作为GLP-1受体激动剂在药物中使用。基于ZL001的GLP-1受体激动剂作用，本发明提出了ZL001在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物的新用途，并且通过实验验证发现ZL001具有显著的治疗/缓解NAFLD的作用，将其作为一种新型的治疗非酒精性脂肪肝病的药物具有潜在的科研价值和商业价值。
附图说明
图1是ForteBio Octet分子互作检测ZL001与GLP-1R的亲和力结果；
图2是在有或没有GLP-1R阻断剂Exendin(9-39)干预的情况下，ZL001对大鼠胰岛素分泌的影响；
图3是不同剂量ZL001对C57BL/6小鼠葡萄糖耐量(OGTT)的影响；
图4是GLP-1R基因敲除小鼠分别灌胃生理盐水、ZL001或皮下注射Liraglutide的血葡萄糖水平检测；
图5是不同剂量ZL001、对照品干预后，NASH小鼠肝脏外观的对比；
图6是不同剂量ZL001及对照药物对NASH小鼠肝脏、附睾脂肪质量及相对质量的影响；
图7是不同剂量ZL001、对照品干预后，NASH小鼠主要肝功四项指标的变化；
图8是不同剂量ZL001、对照品干预后，NASH小鼠三项肝功相关生化指标的变化；
图9是不同剂量ZL001、对照品干预后，NASH小鼠血脂的变化；
图10是不同剂量ZL001及对照药物对NASH小鼠肝内脂质含量的影响；
图11是不同剂量ZL001、对照品干预后，NASH小鼠肝脏HE染色表现出的肝脂质蓄积、肝内炎症情况；
图12是不同剂量ZL001、对照品干预后，NASH小鼠肝脏炎症评级结果；
图13是不同剂量ZL001、对照品干预后，NASH小鼠肝脏天狼猩红染色表现出的肝内纤维化情况；
图14是不同剂量ZL001、对照品干预后，NASH小鼠肝脏纤维化评级结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1化合物ZL001与GLP-1受体的相关性验证
1、ForteBio Octet分子互作检测ZL001与GLP-1R的亲和力
构建大鼠GLP-1R载体：从NCBI中获取GLP-1R CDS区的mRNA序列，将全基因合成法与PCR技术连用，来获得大鼠GLP-1R的序列片段。琼脂糖凝胶电泳并切胶回收GLP-1R rat基因片段。将目的基因GLP-1R克隆到载体pEX-3中，用EcoRI和BamHI酶对PEX-3进行酶切，电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收载体pEX-3，将扩增好的片段克隆到线性化的pEX-3载体上。用氯化钙法制备感受态细胞。把重组连接产物转化为感受态细胞，挑取克隆菌落，小抽质粒并做鉴定挑出阳性克隆。重组质粒测序验证并大量抽提，取200ul的阳性克隆的菌液进行测序，并用甘油保存剩余的菌液，比对测序结果和目的基因序列，完全正确后，用剩余的菌液接菌至LB培养基，大量抽提至足够量的重组质粒。无细胞GLP-1R蛋白的表达：采用杭州谨澳生物科技Z1高保真DNA聚合酶G-POL-001或Z2超保真DNA聚合酶G-POL-002对目的基因进行扩增，TOB无细胞真核表达系统成功过表达目的蛋白，后用SDS-PAGE观测表达结果。Westernblot验证表达结果。
GLP-1R蛋白纯化与浓缩：1)构建N端含his-tag和Tev酶切位点的大鼠GLP-1R载体:采用杭州谨澳生物科技公司的QR分子克隆和诱变试剂盒，在已构建的GLP-1R质粒的目的基因片段的N端加6个his标签和Tev酶切位点，并将其亚克隆至PET载体，以此来构建新的大鼠GLP-1R载体。2)N端含His标签和Tev酶切位点的GLP-1R蛋白的表达及纯化：采用杭州谨澳生物科技有限公司的E.coli透析式无细胞蛋白表达体系成功表达GLP-1R蛋白；使用Histrap柱对目的蛋白进行纯化。获得纯化样品后，取3μl，上样至SDS-PAGE观测纯化结果。
使用杭州双天生物技术有限公司购入的Fortebio Octet RE96E检测仪来进行检测。1)纯化的GLP-1R蛋白的生物素化，按照1：1的摩尔比对目的蛋白进行生物素化。加入适量生物素化试剂于30℃水浴2h.反应结束后，用重力脱盐柱去除多余生物素，用PBS进行洗脱，来进行SSA芯片的固化。2)稀释化合物ZL001，用DMSO溶解ZL001，直至完全溶解，溶解后用PBST稀释100倍，再用1％DMSO+PBST稀释成100μM,用于后续检测。3)SSA芯片固化GLP-1R蛋白来检测ZL001，将21.2μM、42.4μM、84.8μM、169.5μM、339μM的ZL001溶液和相关试剂按照一定顺序加入样品板，设定仪器程序并运行。4)采用Fortebio data analysis 10.0软件来处理实验数据。
实验结果：对小分子(分子量<2kDa)来说，亲和力一般在10-4-10-7M。KD值体现了客观存在的亲和力水平。为了准确的计算化合物与GLP-1R的亲和力，实验选用了5个浓度点(21.2μM、42.4μM、84.8μM、169.5μM、339μM)来进行拟合。图1ForteBio Octet分子互作检测ZL001与GLP-1R的亲和力，ZL001与GLP-1R的结合是一个可逆的过程，二者的结合时间为60s，解离时间为60s，呈现快速结合和快速解离的特点。ZL001与GLP-1R的亲和力常数KD值为2.41×10-4。
2、胰岛素分泌试验
一、溶液配制：
1)Collagenase P的配制：称取50mg Collagenase P粉末和500mg BSA粉末于50mL无菌离心管内，在超净工作台内加入50mL RPMI 1640培养基溶解，混合均匀后即配制成1mg/mL Collagenase P。用0.22μm的无菌滤器过滤，每管10mL分装，密封后放置于-20℃冰箱中备用。
2)DispaseⅡ溶液的配制：称取50mg DispaseⅡ粉末于50mL离心管中，无菌状态下加入10mL PBS(含EDTA,无Ca2+、Mg2+)，混合均匀后即配制成5mg/mL的DispaseⅡ溶液。过滤，每管200μL分装，密封后放置于-20℃冰箱中备用。
3)EDTA溶液的配制：称取0.05583g EDTA粉末于50mL离心管中，无菌状态下加入50mL PBS(含EDTA,无Ca2+、Mg2+)，混匀后即配制成30mmol/L的EDTA溶液。过滤，每管1mL分装，密封后放置于-20℃冰箱中备用。
4)KRBH(Krebs-Ringer Bicarbonate HEPES)缓冲液的配制:128.8mmol/L NaCl，10HEPES，4.8KCl，2.5mmol/L CaCl2，1.2mmol/LKH2PO4，1.2mmol/L MgSO4，5mmol/LNaHCO3，调节溶液pH至7.4，根据实验需要添加2％BSA。
5)1mol/L葡萄糖的配制：称取9g葡萄糖粉末于50mL离心管中，无菌状态下加入50mL三蒸水，混合均匀。过滤，每管1mL分装，密封后放置于-20℃冰箱中备用。
6)含10％胎牛血清的1640培养基的配制：取500mL RPMI 1640培养基于超净工作台内，取出55mL后加入50mL胎牛血清和5mL 100×青链霉素混合液，充分摇匀后封口，置于4℃冰箱中备用。
二、大鼠胰岛组织的分离与培养
1)准备工作：a)打开恒温振荡器使之温度上升且保持至37℃，调节振荡频率至80r/min。b)于-20℃冰箱中取出Collagenase P至常温解冻后，抽至20mL注射器内，将PE导管连接在注射器针头处，排除空气后放至冰块上备用。c)准备无菌工作台，放置好实验所需的手术器械。
2)取雄性wistar大鼠处死，腹部用75％的乙醇酒精消毒后，用手术剪将腹部剖开至暴露出心脏。将大鼠转移至体视显微镜下找到胆总管，用止血钳夹住胆总管与十二指肠的交界处。在体式显微镜下游离胆总管，用眼科剪剪一“V”型小口以备插管。
3)将连有PE导管的注射器小心插入胆总管，将Collagenase P匀速注入胆总管，并将插管处结扎。
4)松开止血钳，将完整的胰腺剥离至培养皿中，去除杂质后倒入50mL离心管中，在恒温振荡器内消化11min。
5)于超净台内加入10mL含10％胎牛血清的1640培养基终止消化，再加入10mLHanks缓冲液(HBSS)，用力摇晃使管内混悬液呈泥沙状。350μm的滤网过滤至新的无菌50mL离心管内，3min,1200r离心。
6)弃上清，加入10mL Hitopaque-1077分离液，用移液枪将沉淀吹打均匀。再用10mL注射器吸取10mL RPMI 1640培养基，沿离心管壁匀速注入使之出现明显的分层。23min，3200r离心。
7)用移液枪吸取上清液于培养皿中，在体视显微镜下用10μL移液枪将胰岛挑至另一个含10％胎牛血清1640培养基的培养皿中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
三、实验步骤
1)实验前准备：①实验分为4组，Ep管编号(每组7个)；②配制KRBH溶液，置培养箱中孵育30min，用NaOH调制pH至7.4；③配制待测样品：11.1mmol/L葡萄糖溶液(11.1G)、11.1G+100nM Exendin(9-39)、11.1G+10μM ZL001、11.1G+10μM ZL001+100nM Exendin(9-39)。
2)正式实验：①向每个Ep管中加入500μL 2.8mmol/L葡萄糖溶液(2.8G)，在体式显微镜下挑取5个胰岛(大小均一，边缘光滑)至Ep管中，放至培养箱内孵育30min；②用移液枪将上清液吸出弃掉(注意不要吸走胰岛)，然后每组依次各加入500μL 11.1G、11.1G+100nMExendin(9-39)、11.1G+10μM ZL001、11.1G+100nM Exendin(9-39)+10μMZL001，置培养箱中孵育30min；③用移液枪将上清液吸出至提前标记好的Ep管中，混匀，封口，并进行胰岛素(INS)放射免疫检测。
四、实验结果
实验结果如图2所示，在11.1G浓度下，Exendin(9-39)部分阻断了ZL001促胰岛素分泌作用，表明ZL001促胰岛素分泌作用与激动GLP-1R有关。
3、ZL001对C57BL/6小鼠血糖的影响)6周龄雄性C57BL/6小鼠，体重18～22g,购自于山西省人民医院实验动物中心，适应性饲养一周，每日正常饮食饮水；
2)实验前将小鼠以耳钉固定，进行分组和序号标记。随机分为以下3组：Control组：灌胃生理盐水；15mg/kg ZL001组：灌胃15mg/kg ZL001溶液；30mg/kg ZL001组：灌胃30mg/kg ZL001溶液。每组n＝6。
3)实验前一天将小鼠禁食12h，可自由饮水，并去除动物笼内木屑垫料；
4)实验当天，配制20％葡萄糖溶液：称量1g无水葡萄糖，溶于5ml无菌三蒸水，混匀，0.22μm滤器过滤除菌，现用现配；
5)配制ZL001溶液(5mg/ml)：称取ZL001，加入生理盐水，加入盐酸并用涡旋超声至均一溶液，然后用NaOH调整PH至6.8-7，现配现用。
6)称量小鼠空腹体重；
7)按照实验设计，分别灌胃生理盐水或ZL001，操作动作轻柔，避免反复刺激小鼠。每组小鼠分别给予葡萄糖溶液(2g/Kg)进行灌胃，操作动作轻柔，避免反复刺激小鼠。灌胃后，分别在0分钟(基线水平)、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟采集尾静脉血进行血葡萄糖水平检测。以血糖仪分别检测不同时间点的血葡萄糖水平，并进行统计处理。
实验结果如图3所示，与control组比较，ZL001给药组在给予口服葡萄糖后，对糖负荷的耐受出现不同程度的提高，其中30mg/kg ZL001比15mg/kg ZL001降糖效果更明显。
4GLP-1R基因敲除小鼠的口服葡萄糖耐量试验
1)GLP-1R-/-小鼠，购自于赛业生物科技公司，适应性饲养一周，每日正常饮食饮水；
2)实验前将小鼠以耳钉固定，进行分组和序号标记。GLP-1R-/-+saline组：给予GLP-1R-/-小鼠灌胃生理盐水；GLP-1R-/-+ZL001组：给予GLP-1R-/-小鼠灌胃30mg/kg ZL001溶液；GLP-1R-/-+Liraglutide组：给予GLP-1R-/-小鼠皮下注射0.2mg/kg Liraglutide溶液。每组n＝4。
3)实验前一天将小鼠禁食12h，可自由饮水，并去除动物笼内木屑垫料；
4)实验当天，配制20％葡萄糖溶液：称量1g无水葡萄糖，溶于5ml无菌三蒸水，混匀，0.22μm滤器过滤除菌，现用现配；
5)配制ZL001溶液(5mg/ml)：称取ZL001，加入生理盐水，加入盐酸并用涡旋超声至均一溶液，然后用NaOH调整PH至6.8-7；配制Liraglutide溶液(0.04mg/ml)：称取Liraglutide，加入三蒸水，超声至完全溶解。ZL001和Liraglutide溶液都是现配现用
6)称量小鼠空腹体重；
7)按照实验设计，分别灌胃生理盐水、ZL001或皮下注射Liraglutide，操作动作轻柔，避免反复刺激小鼠。每组小鼠分别给予葡萄糖溶液(2g/Kg)进行灌胃，操作动作轻柔，避免反复刺激小鼠。灌胃完成后，分别在0分钟(基线水平)、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟采集尾静脉血进行血葡萄糖水平检测。以血糖仪分别检测不同时间点的血葡萄糖水平，并进行统计处理。
实验结果如图4所示，当小鼠GLP-1R被敲除后，ZL001、Liraglutide对小鼠血糖的影响与生理盐水组无显著差异，说明化合物ZL001和已知的GLP-1R激动剂Liraglutide作用基本相同，表明化合物ZL001为GLP-1R激动剂。
实施例2
1)实验动物
雄性C57小鼠，体重25～30g,购自于山西省人民医院实验动物中心；瘦素基因敲除ob/ob小鼠，17周龄，由常州卡文斯实验动物有限公司提供。饲养温度20～22℃，并配有标准啮齿动物食物及饮用水。所有操作流程均符合山西医科大学实验动物的管理和使用指南。
2)主要药品、试剂、仪器
化合物ZL001：上海陶术生物科技有限公司
利拉鲁肽：上海陶术生物科技有限公司
GAN饲料：江苏省协同医药生物工程有限责任公司
甘油三酯(TG)含量检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司
总胆固醇(TC)含量检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司
脱水机：DIAPATH
包埋机：武汉俊杰电子有限公司
病理切片机：上海徕卡仪器有限公司
冻台：武汉俊杰电子有限公司
染色机：DIAPATH
正置光学显微镜：日本尼康
冰冻切片机：赛默
医用冷藏冷冻箱：海尔集团公司
Bio-Plex悬液芯片系统：BIO-RAD公司
分析天平：德国赛多利斯集团
3)动物分组与模型建立
42只雄性ob/ob小鼠及8只雄性C57小鼠使用维持饲料适应性喂养一周。尾静脉取血检测血清生化指标，根据体重、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平将ob/ob小鼠随机分为溶剂对照组(Vehicle组，n＝9)，阳性药物利拉鲁肽对照组(Lir 0.2mg/kg QD组，n＝9，Lir表示利拉鲁肽)，低剂量药物干预组(ZL001 15mg/kg QD组,n＝12)以及高剂量药物干预组(ZL001 30mg/kg QD组,n＝12)；C57小鼠作为正常对照组(Normal Control组,n＝8)。使用维持饲料饲喂NC组小鼠，每日灌胃0.25mL/kg生理盐水；Vehicle组饲喂GAN饲料10周，建立GAN-NASH模型，每日灌胃0.25mL/kg生理盐水；Lir 0.2mg/kg QD(一天一次)组饲喂GAN饲料，每日给予利拉鲁肽0.2mg/kg皮下注射一次；高、低剂量ZL001组饲喂GAN饲料，其中ZL001 15mg/kg QD组每日给予ZL001 15mg/kg灌胃一次，ZL001 30mg/kg QD组每日给予ZL001 30mg/kg灌胃一次。后续根据实验进程，Lir0.2mg/kg QD组剂量提升为Lir 0.2mg/kgBID(一天两次)组；ZL001 15mg/kg QD组剂量提升至ZL001 25mg/kg BID；ZL001 30mg/kgQD组剂量提升至ZL001 50mg/kg QD。
4)数据处理及统计
涉及的数据用SigmaPlot 14.0软件处理，并以Mean±SEM表示。使用Student's t-test、one-way ANOVA进行统计分析，当p<0.05时被认为具有统计学意义。#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与NC组相比。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与Vehicle组相比。
5)化合物ZL001对NASH小鼠的影响
5.1)化合物ZL001化合物对NASH小鼠身体一般情况的影响
实验步骤：每日测定动物体重。药物干预十周后，终止实验，禁食禁水12小时。称重，根据动物体重，使用6％水合氯酸(0.05mL/10g)进行麻醉。组织脏器完整分离后称重。
实验结果：如图5，图6所示，化合物ZL001对NASH小鼠身体一般情况的影响。图5中，ZL001、Lir组的动物肝脏相比于Vehicle组，肝脏外缘更加顺滑，表观有光泽，外型更小，并且ZL001 BID组的肝脏颜色更加鲜红，说明肝内的脂质沉积更少。图6中，由于ZL001、Lir的干预，减少肝内脂肪蓄积，进一步延缓了肝脏增大的趋势，并且ZL001 BID还可明显减少肾周脂肪的质量。
表明：1)化合物ZL001、利拉鲁肽均可显著降低动物肝脏质量。2)ZL001 BID还可显著降低动物肾周脂肪质量。
5.2)化合物ZL001对NASH小鼠肝脏功能的影响
实验步骤：动物麻醉后为预防溶血情况发生，先剪掉动物两侧胡须，摘眼球采血，收集至采血管中，静置20分钟，3000转离心5分钟，取上清，使用生化仪检测血清生化指标。
实验结果：如图7，图8所示，化合物ZL001对NASH小鼠肝脏功能的影响。图7中，动物的血清肝功四项可直接表明个体肝细胞功能。在干预第四周时，ZL001、Lir组的NASH小鼠的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)便已明显低于Vehicle组，并且在第十周，这种改善肝功指标趋势得以延续。图8中，三项生化指标α-羟丁酸转氨酶(α-HBDH)、免疫球蛋白M(Ig M)、白蛋白(ALB)在ZL001 BID干预后含量下降明显，也综合反映出了肝脏功能的改善。
表明：1)在利拉鲁肽、化合物ZL001的干预下，动物肝功指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)均有明显改善。2)生化指标α-羟丁酸转氨酶(α-HBDH)、免疫球蛋白M(Ig M)、白蛋白(ALB)的水平异常均与慢性肝病有关，化合物ZL001改善肝功，使得上述指标明显恢复正常。3)且化合物ZL001 BID给药结果均优于QD给药，QD给药优于阳性药物对照组。
5.3)化合物ZL001对NASH小鼠血脂含量的影响
实验步骤：动物麻醉后为预防溶血情况发生，先剪掉动物两侧胡须，摘眼球采血，收集至采血管中，静置20分钟，3000转离心5分钟，取上清，使用生化仪检测血清生化指标。
实验结果：如图9所示，化合物ZL001对NASH小鼠血脂含量的影响。除TG水平变化不明显外，血清中血清中总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸(FFA)水平均在Lir、化合物ZL001干预下明显改善，且化合物ZL001BID给药结果均优于QD给药，QD给药优于Lir组。这些指标的改善，提示肝内的脂肪蓄积、脂质合成过量情况得以缓解，肝脏对胆固醇的摄取也有减弱，各种因素的共同作用防止了肝内脂肪变性的加重。
5.4)化合物ZL001对NASH小鼠肝脏内脂质蓄积及炎症的影响
实验步骤：1)动物麻醉取血处死后，将部分肝脏组织速冻，后续采用试剂盒检测肝脏内的TG、TC含量。2)将剩余肝脏组织置于固定液固定24小时后进行石蜡包埋、切片、染色。动物肝脏切片HE染色：取出固定后的组织以梯度酒精脱水。脱水后的组织在65℃下浸蜡。将肝组织取出，加入液态石蜡，包埋肝组织，-20℃中进行冷却。凝固后，裁剪、打磨至合适尺寸。蜡块切片、展平、烘干。切片用二甲苯及梯度酒精进行脱蜡，用水冲洗切片。苏木素染色3-5min，用水缓慢冲洗切片。分化后用水冲洗返蓝。切片于伊红染液中染色5min，用水冲洗。切片放入梯度酒精脱水。滴加中性树胶封片。镜检，采集图像并分析。HE染色小叶内炎症评分标准(20倍镜计数坏死灶)∶0，无；1(<2个)；2(2～4个)；3(>4个)。
实验结果：如图10-12所示，化合物ZL001对NASH小鼠肝脏内脂质的影响。
图10中，NASH动物肝脏内的甘油三酯、胆固醇含量在ZL001 BID的干预之下，相比于Vehicle组有明显减少，体现在图11中的肝脏HE染色上的结果是肝细胞内的脂滴在数量与大小上都有明显减小。图12中，ZL001 QD、Lir组的肝小叶内的炎症灶明显少于Vehicle组，炎症评分中ZL001 QD、Lir组也低于Vehicle组。ZL001 QD组中1级评分占比大，Lir组中2级评分占比大，Vehicle组3级评分占比大。
以上结果表明：1)ZL001 BID给药可减少肝脏内包括TG、TC的脂质含量。2)肝脏HE染色切片结果表明ZL001 BID组动物肝脏内脂质蓄积较Vehicle组明显减少。3)肝脏小叶内炎症评分表明，Lir组及ZL001 QD组炎症均有明显改善，且ZL001 QD组的改善效果优于Lir组。
5.5化合物ZL001对NASH小鼠肝脏纤维化的影响
实验步骤：脱水、包埋、切片、脱蜡步骤同5.4HE染色。天狼猩红染液染色8min，再用无水乙醇进行脱水。切片放入二甲苯透明5min。滴加甘油明胶封片。镜检，采集图像并分析。肝脏纤维化的分期标准采用Brunt分期系统。0期：无纤维化；1期：肝腺泡3区肝细胞周围/窦周隙纤维化，局灶或广泛；2期：1期+汇管区纤维化，局灶或广泛：3期：桥接纤维化,局灶或广泛；4期：肝硬化(+/-残余细胞周纤维化)。
实验结果：如图13-14所示，化合物ZL001对NASH小鼠肝脏纤维化的影响。
图13中，ZL001 BID、Lir组肝内纤维化少于Vehicle组，ZL001 QD组的肝脏纤维化有明显改善，视野内极少观察到胶原沉积。天狼星猩红染色中各组空泡的数量与大小也与HE染色中脂滴的数量与大小相对应。图14中，纤维化评分结果表明三组干预组的纤维化评级都低于Vehicle组，且ZL001 QD组中评分1级占比大，Vehicle组评分3级占比大。充分体现出ZL001降纤保肝的作用。
天狼猩红染色及纤维化评分均表明：Lir、ZL001 BID组、ZL001 QD给药均可减少肝脏内胶原沉积，延缓肝脏纤维化进程。其中ZL001 QD组改善效果最为显著。
以上实验充分说明了本发明化合物ZL001对NASH小鼠可改善肝功，保护肝脏，减少肝脏内脂肪变性、炎症反应、胶原沉积，延缓肝脏纤维化进程，对非酒精性脂肪肝病具有显著的治疗/缓解作用，且ZL001 BID组的降脂、保肝，ZL001 QD组的纤维化改善效果均优于Lir组。并且这种对非酒精性脂肪肝病具有显著的治疗/缓解作用，推测是ZL001化合物具有GLP-1R激动剂的活性相关。
实施例3胶囊剂的制备
本发明式I所示化合物，特别是化合物ZL001以及其药学上可接受的盐、氘代化合物、溶剂合物、立体异构体，按照下述表1所示的配方制成胶囊剂：
表1胶囊剂成分
比例
式I化合物 30wt％
乳糖 40wt％
微晶纤维素 10wt％
HPMC型包衣剂 7wt％
山梨糖醇 5wt％
硬脂酸镁 1.5wt％
滑石粉 1wt％
其他辅料 满足100％
实施例4片剂的制备
本发明式I所示化合物，特别是化合物ZL001以及其药学上可接受的盐、氘代化合物、溶剂合物、立体异构体，按照下述表2所示的配方制成片剂：
表2片剂成分
/>

Claims (10)

1.化合物ZL001及其药学上可接受的盐在制备治疗/缓解非酒精性脂肪肝病的药物中的用途，
ZL001；
所述非酒精性脂肪肝病为非酒精性脂肪性肝炎。
2.一种药物组合物在制备治疗/缓解非酒精性脂肪性肝炎的药物中的用途，所述组合物中包含权利要求1所述的化合物ZL001或其药学上可接受的盐，以及药剂学上可接受的辅料。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药剂学上可接受的辅料选自赋形剂、稳定剂、载体、矫味剂，溶剂、增溶剂、乳化剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、渗透压调节剂、防腐剂、助悬剂、pH调节剂、缓冲剂、增稠剂、保湿剂、稀释剂中一种或两种以上的组合。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物组合物制备成如下形式的药物制剂：片剂、胶囊剂、糖浆剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、霜剂、膏剂、凝胶剂或乳剂。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，药物制剂为单位剂量制剂，单位剂量制剂中化合物ZL001含量为0.001-1000 mg。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，药物制剂为单位剂量制剂，单位剂量制剂中化合物ZL001含量为1-100mg。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，药物制剂为单位剂量制剂，单位剂量制剂中化合物ZL001含量为5-50mg。
8.根据权利要求1-7任一项所述的用途，其特征在于，药物剂量按照化合物ZL001计，对人的剂量为0.5-10mg/kg/d。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，药物剂量按照化合物ZL001计，对人的剂量为1-5mg/kg/d。
10.根据权利要求1-7任一项所述的用途，其特征在于，药物通过静脉输注、口服、局部、腹膜内、鞘内给药方式进行给药。
CN202210878875.6A 2022-07-25 2022-07-25 一种用于非酒精性脂肪肝病的化合物、组合物及其用途 Active CN115089578B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210878875.6A CN115089578B (zh) 2022-07-25 2022-07-25 一种用于非酒精性脂肪肝病的化合物、组合物及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210878875.6A CN115089578B (zh) 2022-07-25 2022-07-25 一种用于非酒精性脂肪肝病的化合物、组合物及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115089578A CN115089578A (zh) 2022-09-23
CN115089578B true CN115089578B (zh) 2023-08-25

Family

ID=83299593

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210878875.6A Active CN115089578B (zh) 2022-07-25 2022-07-25 一种用于非酒精性脂肪肝病的化合物、组合物及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115089578B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010049678A2 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Summit Corporation Plc Treatment of energy utilization diseases
CN103976956A (zh) * 2014-05-16 2014-08-13 暨南大学 一种靶向抗肝癌纳米粒子及其制备方法和应用
CN106420712A (zh) * 2015-08-10 2017-02-22 上海市中医老年医学研究所 茴香霉素在制备预防/治疗卵巢癌药物中的应用
CN114790160A (zh) * 2021-01-26 2022-07-26 山西医科大学 一种茴香霉素衍生物以及茴香霉素和其衍生物作为glp-1r激动剂的用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010049678A2 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Summit Corporation Plc Treatment of energy utilization diseases
CN103976956A (zh) * 2014-05-16 2014-08-13 暨南大学 一种靶向抗肝癌纳米粒子及其制备方法和应用
CN106420712A (zh) * 2015-08-10 2017-02-22 上海市中医老年医学研究所 茴香霉素在制备预防/治疗卵巢癌药物中的应用
CN114790160A (zh) * 2021-01-26 2022-07-26 山西医科大学 一种茴香霉素衍生物以及茴香霉素和其衍生物作为glp-1r激动剂的用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Decoding the Role of Astrocytes in the Entorhinal Cortex in Alzheimer’s Disease Using High-Dimensional Single-Nucleus RNA Sequencing Data and Next-Generation Knowledge Discovery Methodologies: Focus on Drugs and Natural Product Remedies for Dementia;Peter Natesan Pushparaj等;Frontiers in Pharmacology;第12卷;第1-19页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115089578A (zh) 2022-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW201300375A (zh) 雜環自分泌運動因子（ａｕｔｏｔａｘｉｎ）抑制劑及其用途
CN114790160B (zh) 一种茴香霉素衍生物以及茴香霉素和其衍生物作为glp-1r激动剂的用途
CN103201262A (zh) 自分泌运动因子抑制剂及其用途
WO2017162211A1 (zh) 药物组合物及其用途
WO2021223780A2 (zh) 苯并异硒唑衍生物用于抗冠状病毒及控制冠状病毒相关的间质性肺疾病（ild）的用途
JP2008528641A (ja) アルテミシニン誘導体、その調製方法、応用及び該誘導体を含む薬物組成物
JP6875516B2 (ja) 抗肥満および抗糖尿病効能を有するペプチド、並びにその用途
CN115089578B (zh) 一种用于非酒精性脂肪肝病的化合物、组合物及其用途
KR101950008B1 (ko) 당뇨병 및 비만 치료용 면역관용 세포 백신 및 인슐린 분비 세포의 제조 방법
WO2020001304A1 (zh) Fxr受体激动剂
JPH08512038A (ja) 胃腸障害の治療に関するフェネタノールアミン誘導体の用途
CN115671105B (zh) Ly2922470在制备预防或治疗肾脏疾病药物中的应用
CN110538175A (zh) 穿心莲内酯在制备用于促进胆固醇逆转运的促进剂中的应用
US20040186166A1 (en) Cannabinoid analogs as peroxisome proliferator activated nuclear receptor gamma activators
JPH10330256A (ja) グリチルレチン酸化合物含有ｈｓｐ４７合成抑制剤
CN112898131B (zh) 大麻二酚的提取工艺及大麻二酚或大麻提取物在制备预防或者治疗bph的药物中的应用
JPH107569A (ja) ベルベリン誘導体含有ｈｓｐ４７合成抑制剤
JP2009507922A (ja) ピペラジン化合物のサリチル酸塩およびゲンチシン酸塩
CN115286550A (zh) 一种用于治疗肥胖的化合物、组合物及其用途
CN115212204B (zh) 一种化合物在制备治疗阿尔茨海默症药物中的用途
CN114984002B (zh) 一种式(i)化合物制备镇痛药物中的用途
JP2000505791A (ja) 肥満症タンパク質類似体化合物およびその製剤
CN111700898B (zh) 巴戟甲素的应用
CN110559289B (zh) 亚硫酸氢钠穿心莲内酯在制备抗动脉粥样硬化的药物中的应用
CN114681438B (zh) 二甲双胍及其它含胍化合物在逆转Gal-10结晶趋势并缓解相关疾病中应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant