CN115044687A - 一种西瓜果斑病菌巢式pcr检测方法 - Google Patents

一种西瓜果斑病菌巢式pcr检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115044687A
CN115044687A CN202210690415.0A CN202210690415A CN115044687A CN 115044687 A CN115044687 A CN 115044687A CN 202210690415 A CN202210690415 A CN 202210690415A CN 115044687 A CN115044687 A CN 115044687A
Authority
CN
China
Prior art keywords
watermelon
fixedly connected
sample
juice
detection method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210690415.0A
Other languages
English (en)
Inventor
赵家桔
应东山
高玲
张如莲
李莉萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences
Original Assignee
Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences filed Critical Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences
Priority to CN202210690415.0A priority Critical patent/CN115044687A/zh
Publication of CN115044687A publication Critical patent/CN115044687A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了第一步，取西瓜汁：通过在西瓜田中随机挑选一些西瓜，通过取汁装置将西瓜去皮与去籽，得到5‑10ml的西瓜汁；第二步，西瓜汁预处理：通过高速离心去掉西瓜汁上清，留沉淀样品，以无菌操作将沉淀样品转入培养基中，室温培养一段时间；第三步，提取培养后样品中的DNA；第四步，利用PCR检测技术对上述DNA进行处理，以鉴定上述样品中的西瓜果斑病菌。本发明通过取汁装置快速获得样品后即可进行检测，而且可快速、可靠地提取到用于PCR快速检测西瓜果斑病菌技术所需的DNA，可用于西瓜果斑病菌的快速及时诊断，对该病害的预防和及时防治具有十分重要的意义。

Description

一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法
技术领域
本发明涉及西瓜细菌性果斑病检测技术领域，尤其涉及一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法。
背景技术
西瓜细菌性果斑病又称细菌斑点病、西瓜水浸病、果实腐斑病等，是西瓜、籽瓜风险最高的一种种子传播病害。苗期和成株均可发病。瓜苗染病沿中脉出现不规则褐色病变，有的扩展到叶缘，从叶背面看呈水渍状，有时被一个黄色组织带包围。种子带菌的瓜苗在发病后1-3周即死亡。西瓜果实染病，初期在果实上部表面现数个几毫米大小灰绿色至暗绿色水渍状斑点，后迅速扩展成大型不规则的水浸状斑，3～5天内便布满除接触地面部分的整个果面。早期形成的病斑老化后表皮龟裂，常溢出黏稠、透明的琥珀色菌脓，果实很快腐烂。该病多始于成瓜向阳面，与地面接触处未见发病，瓜蔓不萎蔫，西瓜细菌性果斑病的病原菌为燕麦嗜酸菌西瓜亚种。该菌属原核生物界、薄壁菌门、暗细菌纲、假单孢菌科、嗜酸菌属。
传统的病原菌检测技术是在分离和进行进一步的培养从而获得相应病原物的基础上，通过形态学观察和科赫氏法则来判断病原物的种类。但是，分离，培养全部过程往往都非常消耗时间以及需要大量的劳动力资源。如何快速准确的鉴定西瓜是否含有西瓜细菌性果斑病是西瓜健康种苗生产的关键技术之一，也是甘西瓜健康种苗能否推广的保障。因此，生产上迫切需要一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法。
发明内容
本发明提供了一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，包括以下步骤：
第一步，取西瓜汁：通过在西瓜田中随机挑选一些西瓜，通过取汁装置将西瓜去皮与去籽，得到5-10ml的西瓜汁；
第二步，西瓜汁预处理：通过高速离心去掉西瓜汁上清，留沉淀样品，以无菌操作将沉淀样品转入培养基中，室温培养一段时间；
第三步，提取培养后样品中的DNA；
第四步，利用PCR检测技术对上述DNA进行处理，以鉴定上述样品中的西瓜果斑病菌。
作为本技术方案的进一步改进方案：第一步中，挑选西瓜时，选择西瓜刚成熟期进行检测。
作为本技术方案的进一步改进方案：第二步中，培养基为2×YT培养基。
作为本技术方案的进一步改进方案：第二步中，室温培养时间为6-8小时。
作为本技术方案的进一步改进方案：第三步中，提取培养后样品中的DNA具体为：
S1,将2ml的沉淀样品中加入300ul裂解液，30mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，10mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时；
S2,然后加入100ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；
S3,取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；
S4,加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3M，pH8.0，-20度保存1小时后，13000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。
作为本技术方案的进一步改进方案：第三步中，提取培养后样品中的DNA具体为：
S1,将2ml的沉淀样品中加入400ul裂解液，40mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，20mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时；
S2,然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；
S3,取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；
S4,加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3M，pH8.0，-20度保存1小时后，13000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。
作为本技术方案的进一步改进方案：第三步中，提取培养后样品中的DNA具体为：
S1,将2ml的沉淀样品中加入500ul裂解液，50mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，30mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时；
S2,然后加入300ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；
S3,取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；
S4,加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3M，pH8.0，-20度保存1小时后，13000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。
作为本技术方案的进一步改进方案：所述取汁装置包括底板，所述底板的一端固定连接有固定板，所述固定板的侧壁上通过转动装置连接有转动板，所述转动板的一侧固定连接有第一伸缩气缸，所述转动板的另一个固定连接有在第二伸缩气缸，所述第一伸缩气缸的一端固定连接有第一压板，所述第一压板的侧壁上固定连接有多个凸块，所述第二伸缩气缸的一端固定连接有第二压板，所述第二压板的侧壁上固定连接有多个切刀，所述固定板的侧壁上固定连接有第二连接杆，所述第二连接杆的一端固定连接有放置箱，所述放置箱的底侧壁上开设有多个通孔，所述固定板的侧壁上固定连接有第一连接杆，所述第一连接杆的一端固定连接有过滤箱，所述过滤箱的底侧设有过滤网，所述底板的上侧设有收集箱。
作为本技术方案的进一步改进方案：所述转动装置包括机箱，所述机箱固定连接在固定板的侧壁上，所述机箱的侧壁上固定连接有伺服电机，所述伺服电机的输出端固定连接有转动杆，所述转动杆贯穿固定板的侧壁，所述转动杆的一端固定连接在转动板的侧壁上。
作为本技术方案的进一步改进方案：每个所述凸块呈半球形设置。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过取汁装置快速获得样品后即可进行检测，而且可快速、可靠地提取到用于PCR快速检测西瓜果斑病菌技术所需的DNA，可用于西瓜果斑病菌的快速及时诊断，对该病害的预防和及时防治具有十分重要的意义。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明提出的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法的结构示意图；
图2为本发明中取汁装置的正面剖视结构示意图；
图3为本发明中取汁装置内第一压板的立体结构示意图。
附图中，各标号所代表的部件列表如下：
1、凸块；2、第一压板；3、第一伸缩气缸；4、转动板；5、第二伸缩气缸；6、第二压板；7、切刀；8、放置箱；9、通孔；10、过滤箱；11、过滤网；12、收集箱；13、底板；14、第一连接杆；15、第二连接杆；16、固定板；17、伺服电机；18、机箱；19、转动杆。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。在下列段落中参照附图以举例方式更具体地描述本发明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。
需要说明的是，当组件被称为“固定于”另一个组件，它可以直接在另一个组件上或者也可以存在居中的组件。当一个组件被认为是“连接”另一个组件，它可以是直接连接到另一个组件或者可能同时存在居中组件。当一个组件被认为是“设置于”另一个组件，它可以是直接设置在另一个组件上或者可能同时存在居中组件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
请参阅图1～3，本发明实施例中，一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，包括以下步骤：
第一步，取西瓜汁：通过在西瓜田中随机挑选一些在刚成熟期的西瓜，通过取汁装置将西瓜去皮与去籽，得到5-10ml的西瓜汁；
第二步，西瓜汁预处理：通过高速离心去掉西瓜汁上清，留沉淀样品，以无菌操作将沉淀样品转入2×YT培养基中，室温培养时间为6-8小时；
第三步，提取培养后样品中的DNA；
第四步，利用PCR检测技术对上述DNA进行处理，以鉴定上述样品中的西瓜果斑病菌。
具体的，取汁装置包括底板13，底板13的一端固定连接有固定板16，固定板16的侧壁上通过转动装置连接有转动板4，转动板4的一侧固定连接有第一伸缩气缸3，转动板4的另一个固定连接有在第二伸缩气缸5，第一伸缩气缸3的一端固定连接有第一压板2，第一压板2的侧壁上固定连接有多个凸块1，每个凸块1呈半球形设置，第二伸缩气缸5的一端固定连接有第二压板6，第二压板6的侧壁上固定连接有多个切刀7，固定板16的侧壁上固定连接有第二连接杆15，第二连接杆15的一端固定连接有放置箱8，放置箱8的底侧壁上开设有多个通孔9，固定板16的侧壁上固定连接有第一连接杆14，第一连接杆14的一端固定连接有过滤箱10，过滤箱10的底侧设有过滤网11，底板13的上侧设有收集箱12，转动装置包括机箱18，机箱18固定连接在固定板16的侧壁上，机箱18的侧壁上固定连接有伺服电机17，伺服电机17的输出端固定连接有转动杆19，转动杆19贯穿固定板16的侧壁，转动杆19的一端固定连接在转动板4的侧壁上，进行使用取汁装置时，首先将西瓜放入放置箱8中，然后启动第二伸缩气缸5，使得第二伸缩气缸5通过第二压板6带动多个切刀7进入到放置箱8中，对西瓜进行切割，使得西瓜破碎，之后再收缩第二伸缩气缸5，并启动伺服电机17，使得伺服电机17通过转动杆19带动转动板4旋转一百八十度，让第一伸缩气缸3朝向，此时再启动第一伸缩气缸3，第一伸缩气缸3伸长后可带动第一压板2进入到放置箱8中，对破碎的西瓜进行挤压，此时含有瓜子的西瓜汁将通过通孔9进入到过滤箱10中，此时过滤网11可将瓜子进行阻隔，最后使得西瓜汁进入到收集箱12中。
实施例1
第一步，取西瓜汁：通过在西瓜田中随机挑选一些在刚成熟期的西瓜，通过取汁装置将西瓜去皮与去籽，得到5-10ml的西瓜汁；
第二步，西瓜汁预处理：通过高速离心去掉西瓜汁上清，留沉淀样品，以无菌操作将沉淀样品转入2×YT培养基中，室温培养时间为6-8小时；
第三步，提取培养后样品中的DNA，具体为：
S1,将2ml的沉淀样品中加入300ul裂解液，30mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，10mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时；
S2,然后加入100ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；
S3,取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；
S4,加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3M，pH8.0，-20度保存1小时后，13000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用；
第四步，利用PCR检测技术对上述DNA进行处理，以鉴定上述样品中的西瓜果斑病菌。
实施例2
第一步，取西瓜汁：通过在西瓜田中随机挑选一些在刚成熟期的西瓜，通过取汁装置将西瓜去皮与去籽，得到5-10ml的西瓜汁；
第二步，西瓜汁预处理：通过高速离心去掉西瓜汁上清，留沉淀样品，以无菌操作将沉淀样品转入2×YT培养基中，室温培养时间为6-8小时；
第三步，提取培养后样品中的DNA，具体为：
S1,将2ml的沉淀样品中加入400ul裂解液，40mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，20mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时；
S2,然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；
S3,取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；
S4,加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3M，pH8.0，-20度保存1小时后，13000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用；
第四步，利用PCR检测技术对上述DNA进行处理，以鉴定上述样品中的西瓜果斑病菌。
实施例3
第一步，取西瓜汁：通过在西瓜田中随机挑选一些在刚成熟期的西瓜，通过取汁装置将西瓜去皮与去籽，得到5-10ml的西瓜汁；
第二步，西瓜汁预处理：通过高速离心去掉西瓜汁上清，留沉淀样品，以无菌操作将沉淀样品转入2×YT培养基中，室温培养时间为6-8小时；
第三步，提取培养后样品中的DNA，具体为：
S1,将2ml的沉淀样品中加入500ul裂解液，50mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，30mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时；
S2,然后加入300ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；
S3,取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；
S4,加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3M，pH8.0，-20度保存1小时后，13000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用；
第四步，利用PCR检测技术对上述DNA进行处理，以鉴定上述样品中的西瓜果斑病菌。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书附图所示和以上所述而顺畅地实施本发明；但是,凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，取西瓜汁：通过在西瓜田中随机挑选一些西瓜，通过取汁装置将西瓜去皮与去籽，得到5-10ml的西瓜汁；
第二步，西瓜汁预处理：通过高速离心去掉西瓜汁上清，留沉淀样品，以无菌操作将沉淀样品转入培养基中，室温培养一段时间；
第三步，提取培养后样品中的DNA；
第四步，利用PCR检测技术对上述DNA进行处理，以鉴定上述样品中的西瓜果斑病菌。
2.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，第一步中，挑选西瓜时，选择西瓜刚成熟期进行检测。
3.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，第二步中，培养基为2×YT培养基。
4.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，第二步中，室温培养时间为6-8小时。
5.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，第三步中，提取培养后样品中的DNA具体为：
S1,将2ml的沉淀样品中加入300ul裂解液，30mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，10mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时；
S2,然后加入100ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；
S3,取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；
S4,加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3M，pH8.0，-20度保存1小时后，13000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。
6.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，第三步中，提取培养后样品中的DNA具体为：
S1,将2ml的沉淀样品中加入400ul裂解液，40mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，20mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时；
S2,然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；
S3,取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；
S4,加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3M，pH8.0，-20度保存1小时后，13000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。
7.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，第三步中，提取培养后样品中的DNA具体为：
S1,将2ml的沉淀样品中加入500ul裂解液，50mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，30mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时；
S2,然后加入300ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；
S3,取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；
S4,加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3M，pH8.0，-20度保存1小时后，13000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。
8.根据权利要求1所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，所述取汁装置包括底板(13)，所述底板(13)的一端固定连接有固定板(16)，所述固定板(16)的侧壁上通过转动装置连接有转动板(4)，所述转动板(4)的一侧固定连接有第一伸缩气缸(3)，所述转动板(4)的另一个固定连接有在第二伸缩气缸(5)，所述第一伸缩气缸(3)的一端固定连接有第一压板(2)，所述第一压板(2)的侧壁上固定连接有多个凸块(1)，所述第二伸缩气缸(5)的一端固定连接有第二压板(6)，所述第二压板(6)的侧壁上固定连接有多个切刀(7)，所述固定板(16)的侧壁上固定连接有第二连接杆(15)，所述第二连接杆(15)的一端固定连接有放置箱(8)，所述放置箱(8)的底侧壁上开设有多个通孔(9)，所述固定板(16)的侧壁上固定连接有第一连接杆(14)，所述第一连接杆(14)的一端固定连接有过滤箱(10)，所述过滤箱(10)的底侧设有过滤网(11)，所述底板(13)的上侧设有收集箱(12)。
9.根据权利要求8所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，所述转动装置包括机箱(18)，所述机箱(18)固定连接在固定板(16)的侧壁上，所述机箱(18)的侧壁上固定连接有伺服电机(17)，所述伺服电机(17)的输出端固定连接有转动杆(19)，所述转动杆(19)贯穿固定板(16)的侧壁，所述转动杆(19)的一端固定连接在转动板(4)的侧壁上。
10.根据权利要求8所述的一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其特征在于，每个所述凸块(1)呈半球形设置。
CN202210690415.0A 2022-06-17 2022-06-17 一种西瓜果斑病菌巢式pcr检测方法 Pending CN115044687A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210690415.0A CN115044687A (zh) 2022-06-17 2022-06-17 一种西瓜果斑病菌巢式pcr检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210690415.0A CN115044687A (zh) 2022-06-17 2022-06-17 一种西瓜果斑病菌巢式pcr检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115044687A true CN115044687A (zh) 2022-09-13

Family

ID=83160906

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210690415.0A Pending CN115044687A (zh) 2022-06-17 2022-06-17 一种西瓜果斑病菌巢式pcr检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115044687A (zh)

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6146834A (en) * 1999-09-10 2000-11-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture PCR primers for detection of plant pathogenic species and subspecies of acidovorax
CN102703436A (zh) * 2012-06-15 2012-10-03 赣南师范学院 一种柑橘溃疡病菌的dna水浴沉淀提取方法
RU2611040C1 (ru) * 2016-02-18 2017-02-20 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Набор праймеров для выявления возбудителя Acidovorax citrulli и способ выявления возбудителя Acidovorax citrulli
CN106480227A (zh) * 2016-12-29 2017-03-08 福建省农业科学院植物保护研究所 一种西瓜果斑病菌巢式pcr检测方法
CN106617127A (zh) * 2017-02-12 2017-05-10 吴超 一种生产用西瓜高效榨汁装置
CN106987654A (zh) * 2017-06-12 2017-07-28 福建省农业科学院植物保护研究所 一种检测西瓜果斑病菌lamp引物及其快速检测方法
CN110343697A (zh) * 2019-08-05 2019-10-18 湖州三零科技股份有限公司 一种植物病害菌总dna提取方法
CN111665108A (zh) * 2020-06-16 2020-09-15 黄康卫 一种蔬果类食品安全检测样品预处理分离设备
CN213632913U (zh) * 2020-11-05 2021-07-06 重庆能院食品检测有限公司 一种多种类食品检测用过滤装置
CN113841909A (zh) * 2021-10-27 2021-12-28 山东美之健医药科技有限公司 一种具有营养功能西瓜汁饮料及加工设备

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6146834A (en) * 1999-09-10 2000-11-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture PCR primers for detection of plant pathogenic species and subspecies of acidovorax
CN102703436A (zh) * 2012-06-15 2012-10-03 赣南师范学院 一种柑橘溃疡病菌的dna水浴沉淀提取方法
RU2611040C1 (ru) * 2016-02-18 2017-02-20 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Набор праймеров для выявления возбудителя Acidovorax citrulli и способ выявления возбудителя Acidovorax citrulli
CN106480227A (zh) * 2016-12-29 2017-03-08 福建省农业科学院植物保护研究所 一种西瓜果斑病菌巢式pcr检测方法
CN106617127A (zh) * 2017-02-12 2017-05-10 吴超 一种生产用西瓜高效榨汁装置
CN106987654A (zh) * 2017-06-12 2017-07-28 福建省农业科学院植物保护研究所 一种检测西瓜果斑病菌lamp引物及其快速检测方法
CN110343697A (zh) * 2019-08-05 2019-10-18 湖州三零科技股份有限公司 一种植物病害菌总dna提取方法
CN111665108A (zh) * 2020-06-16 2020-09-15 黄康卫 一种蔬果类食品安全检测样品预处理分离设备
CN213632913U (zh) * 2020-11-05 2021-07-06 重庆能院食品检测有限公司 一种多种类食品检测用过滤装置
CN113841909A (zh) * 2021-10-27 2021-12-28 山东美之健医药科技有限公司 一种具有营养功能西瓜汁饮料及加工设备

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
蔡馥宇等: "瓜类细菌性果斑病研究新进展", 中国瓜菜, vol. 30, no. 11, pages 1 - 5 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Parkinson et al. A method for isolating fungi from soil microhabitats
CN101250490A (zh) 活酵母细胞衍生物的生产方法
CN103695359A (zh) 一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌菌株及其应用
TW201510223A (zh) 一種組織勻漿法分離活細胞構建細胞庫的方法
CN115044687A (zh) 一种西瓜果斑病菌巢式pcr检测方法
Dung et al. Morphological and genetic characteristics of oyster mushrooms and conditions effecting on its spawn growing.
CN107299098A (zh) 一种高效快速提取农作物基因组dna的方法
CN105483278A (zh) 一种基于重组酶聚合酶扩增技术原理的组织胞浆菌感染分子诊断试剂盒及其应用
CN114728872B (zh) 从浮游生物生成3,5-二羟基-4-甲氧基苄醇的生成方法
CN103509711A (zh) 复合型生物组织及细胞芯片
Zhang et al. First report of Fusarium pernambucanum causing fruit rot of muskmelon in China
CN108567845A (zh) 一种防治结肠炎的生物发酵产品及其制备方法
CN105695454A (zh) 一种鉴定芝麻细胞核雄性不育系的分子标记及其鉴定方法
KR20110040367A (ko) 바이오매스를 연속적으로 분별처리하는 방법 및 장치
CN106755559B (zh) 一种海参致病菌黄海希瓦氏菌的检测方法
Carmarán et al. The family Diatrypaceae (Ascomycota) in Argentina: new species and new records
CN206721228U (zh) 一种菜豆晕疫病菌检测试剂盒
US20180282823A1 (en) Molecular identification method for single dinoflagellate cyst
CN110819734A (zh) 苹果树腐烂菌lamp扩增引物及苹果树腐烂病检测试剂盒
CN108118049A (zh) 一个从动物组织中快速提取rna的方法
CN108813307A (zh) 黑小麦谷物餐粉的制作工艺
CN101955884B (zh) 一种从组织中分离原代细胞的装置
Bryksin Peculiarities of biochemical productivity and the most important economical and biological characteristics of the honeysuckle varieties received in NI Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources
CN106635963A (zh) 适合代谢组学水牛胚胎培养及检测胚胎发育潜能的方法
CN111500678A (zh) 一种高通量柑橘黄龙病叶脉dna的提取方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination