CN115044508B - 一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在三豆汤发酵饮料中的应用 - Google Patents

一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在三豆汤发酵饮料中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在三豆汤发酵饮料中的应用，属于乳酸菌饮料技术领域。本发明从传统发酵食品北京豆汁儿中筛选出一株乳酸乳球菌乳酸亚种YM313(Lactococcus lactis subsp.Lactis YM313)，该株乳酸菌位于卫生部发布的《可用于食品的菌种名单》中，而且在三豆汤饮料中能够很好的生长。同时以该菌株制作成发酵剂发酵生产的三豆汤发酵饮料，可有效去除三豆汤原有的豆腥味，并能够增加乳酸发酵的独特风味，使产品感官评分更佳，而且还能够延长保质期，发酵后产品中生物活性物质明显增多，抗氧化性显著提高，是一种风味优良，营养价值丰富的功能性饮料。

Description

一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在三豆汤发酵饮料中的应用
技术领域
本发明属于乳酸菌饮料技术领域，尤其涉及一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在三豆汤发酵饮料中的应用。
背景技术
随着社会的进步，科学技术的不断发展，近期国内外市场上基于健康，功能性研发的饮料越来越受到欢迎。元代《世医得效方》中的“三豆汤”(又名扁鹊三豆饮)由绿豆、赤小豆、黑豆制成，可以清热解毒，滋补脾肾，是一种安全有效且成本低廉的食疗古方。三豆汤在中国尤其是夏季被广泛大量作为日常饮品饮用，但其存在风味不佳，有明显豆腥味且不易保存，尤其在夏季极易发生变质等不足，目前只能通过家庭式生产，并不具备工业化大规模生产的条件。
乳酸菌的代谢产物有机酸、细菌素及其他抑菌物质对腐败菌和致病菌拥有较强的抑制作用，从而能够防止食品腐败变质、延长食品的保质期。乳酸菌发酵还可以促进活性物质析出，增强营养价值，提高食品整体质量和风味。因此通过乳酸菌发酵改善三豆汤饮料的风味及保质期并提高其功能性具有可行性，对于将三豆汤饮料由家庭式生产转变为工业化大规模生产具有相当重要的意义。
乳酸菌广泛应用于乳制品发酵，但对乳酸菌在非乳食品基质中的应用研究相对较少，发酵食品工业中用到的菌种主要来自于传统发酵的乳制品。相较于牛乳，豆类发酵基质并不是目前广泛应用的乳酸菌种的理想发酵基质。目前针对豆类植物基质食品没有可利用菌种，市面上常见乳酸菌对营养要求严格，在三豆汤这类饮料中生长缓慢，活菌数低，严重制约了以豆类为主要基质的乳酸菌纯菌发酵饮料的开发和工业化大规模生产。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在三豆汤发酵饮料中的应用。本发明从传统发酵食品北京豆汁儿中筛选出一株乳酸乳球菌乳酸亚种YM313(Lactococcus lactis subsp.Lactis YM313)，该株乳酸菌位于卫生部发布的《可用于食品的菌种名单》中，而且在三豆汤饮料中能够很好的生长。同时以该菌株制作成发酵剂发酵生产的三豆汤发酵饮料，可有效去除三豆汤原有的豆腥味，并能够增加乳酸发酵的独特风味，使产品感官评分更佳，而且还能够延长保质期，发酵后产品中生物活性物质明显增多，抗氧化性显著提高，是一种风味优良，营养价值丰富的功能性饮料。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明提供了一株乳酸菌，所述乳酸菌为乳酸乳球菌乳酸亚种YM313(Lactococcus lactis subsp.Lactis YM313)，保藏号为GDMCC NO.61831。
所述乳酸菌为乳酸乳球菌乳酸亚种YM313从老北京豆汁中分离获得，已于2021年7月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61831。
所述乳酸菌菌株的个体形态特征为：大小为0.5μm～0.7μm，球状，菌体分裂后呈链状排列，革兰氏阳性，无芽孢。菌落形态特征：菌落大小在0.5mm～1mm，梭形或球形，乳白色，不透明，菌落边缘整齐，表面光滑。
所述乳酸菌菌株的生理生化特征为：兼性厌氧，过氧化氢酶阴性，不能运动，硫化氢、硝酸盐还原、明胶实验阴性，代谢葡萄糖产酸不产气，能代谢乳糖、麦芽糖、D-木糖，不能利用蔗糖，10℃、40℃生长，4℃、45℃不生长，4％NaCl生长。
所述乳酸菌菌株的16SrDNA序列全长共1438bp，经Genbank比对相似性达到99.93％，结合生理生化实验结果，将该菌鉴定为Lactococcus lactis subsp.Lactis，并命名为Lactococcus lactis subsp.Lactis YM313。
本发明还提供了一种含所述乳酸菌的发酵剂。
本发明还提供了一种所述发酵剂的制备方法，包括如下步骤：首先将所述乳酸菌接种于2～5mL种子培养基中进行第一次发酵培养，然后将其接入50～70mL种子培养基中进行二次扩大培养获得种子培养液，最后每5～7mL种子培养液即为所述的1份发酵剂。
优选的，所述种子培养基的配方为：混合豆水90～110mL、葡萄糖1～3g、酵母浸粉0.4～0.6g、甘油磷酸钠1.3～1.7g、磷酸氢二钾0.1～0.3g、无水乙酸钠0.15～0.17g。
优选的，所述种子培养基的配方为：混合豆水100mL、葡萄糖2g、酵母浸粉0.5g、甘油磷酸钠1.5g、磷酸氢二钾0.2g、无水乙酸钠0.16g。
优选的，所述混合豆水由绿豆、赤小豆和黑豆置于蒸馏水中100℃加热15min制得；所述绿豆、赤小豆和黑豆的比例为1：1：1，混合豆类和蒸馏水的比例为1：10。
优选的，所述两次发酵培养的条件均为：30℃下发酵14h。
本发明还提供了一种三豆汤发酵饮料，其主要原料的重量份数组成为：绿豆3.0～3.5份，赤小豆3.0～3.5份，黑豆3.0～3.5份，茉莉绿茶0.1～0.5份，冰糖5～7份，葡萄糖0.3～0.7份，发酵剂0.5～1.5份，纯净水100份；所述茉莉绿茶中茉莉花和绿茶茶叶的比例为1：8～12。
优选的，其主要原料的重量份数组成为：绿豆3.3份，赤小豆3.3份，黑豆3.3份，茉莉绿茶0.3份，冰糖6份，葡萄糖0.5份，发酵剂1份，纯净水100份；所述茉莉绿茶中茉莉花和绿茶茶叶的比例为1：10。
本发明还提供了一种所述三豆汤发酵饮料的制备方法，具体步骤如下：(1)各组分称取所需重量份数；(2)将绿豆、赤小豆、黑豆、冰糖加入纯净水中，100℃加热；(3)加入茉莉绿茶浸泡；(4)加入葡萄糖，冷却至30℃；(5)加入发酵剂，灌装后于30℃下发酵；(6)发酵结束后，即得所述三豆汤发酵饮料。
保藏证明说明：
保藏机构：广东省微生物菌种保藏中心；
保藏编号：GDMCC NO.61831；
保藏日期：2021年7月23日；
保藏地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼；
分类学命名：乳酸菌为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.Lactis)。
本发明提供的Lactococcus lactis subsp.Lactis YM313可以在三豆汤发酵饮料中生长良好，且可提高三豆汤饮料风味及益生性，并能延长其保质期。与发酵前的三豆汤进行对比，以Lactococcus lactis subsp.LactisYM313为发酵剂发酵的三豆汤发酵饮料具有如下优点：
(1)发酵前的三豆汤内不含有益生菌，本发明以Lactococcus lactissubsp.LactisYM313为发酵剂发酵的三豆汤发酵饮料在发酵15h时乳酸菌活菌数达到8.27±0.14logCFU/ml，显著提高了三豆汤的益生性能。
(2)本发明以Lactococcus lactis subsp.Lactis YM313为发酵剂发酵的三豆汤发酵饮料与发酵前的三豆汤相比，在发酵15h时色泽鲜亮呈酒红色，酸甜适口，无明显豆腥味，且拥有优良发酵风味，感官评分显著提高。
(3)本发明以Lactococcus lactis subsp.Lactis YM313为发酵剂发酵的三豆汤发酵饮料与发酵前的三豆汤相比，含有大量乳酸菌，并产生大量乳酸，使pH值显著下降，滴定酸度显著提高，这对腐败菌和致病菌有较强的抑制作用，从而延长了三豆汤的保质期。
(4)本发明以Lactococcus lactis subsp.Lactis YM313为发酵剂发酵的三豆汤发酵饮料与发酵前的三豆汤相比，总黄酮和总酚含量显著提高，抗氧化性显著提高，对人体健康起到的积极影响更大，功能性更强。
(5)本发明使用Lactococcus lactis subsp.LactisYM313发酵后的三豆汤饮料中壬醛这种豆腥味物质相对含量下降，同时还新生成了乙酸、萜品烯、alpha-松油醇、氨茴酸甲酯、大马酮5种风味物质，使发酵后的三豆汤饮料具有独特优良的发酵风味。
(6)从发酵前后的三豆汤饮料中共检测并鉴定出差异代谢物112种，选择VIP值前30的差异代谢物进行分析，其中含量显著提高的生物活性物质和风味物质共6种。这些物质含量的显著提高说明使用Lactococcus lactis subsp.LactisYM313发酵显著提高了三豆汤饮料的风味和功能性。
附图说明
图1为本发明实施例1中的系统发育树；
图2为本发明实施例2中发酵过程中三豆汤发酵饮料活菌数和感官评分的变化图，结果以平均值(n＝3)±标准差表示；
图3为本发明实施例4中样本的PCA得分图；
图4为本发明实施例4中样本的相关性热图；
图5为本发明实施例4中的代谢物分类图；
图6为本发明实施例4中的阳离子模式下OPLS-DA模型得分图(上)和OPLS-DA置换检验图(下)；
图7为本发明实施例4中的阳离子模式下OPLS-DA模型得分图(上)和OPLS-DA置换检验图(下)；
图8为本发明实施例4中的火山图；
图9为本发明实施例4中的聚类热图和VIP条形图；
图10～15为本发明实施例4中的功能性物质和风味物质表达量变化箱型图；
图16为本发明实施例4中的显著差异代谢物KEGG代谢通路富集分析气泡图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。
下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。
实施例1三豆汤发酵菌种的分离、筛选与鉴定
1.培养基配方
1.1分离培养基：M17培养基，pH7.2，121℃灭菌15min。具体成分为：大豆胨5g、蛋白胨2.5g、酪蛋白胨2.5g、酵母浸粉2.5g、牛肉浸粉5g、乳糖5g、抗坏血酸钠0.5g、β-甘油磷酸钠19g、硫酸镁0.25g、蒸馏水1000mL。
1.2种子培养基配方:混合豆水100mL、葡萄糖2g、酵母浸粉0.5g、甘油磷酸钠1.5g、磷酸氢二钾0.2g、无水乙酸钠0.16g。调pH至7.2，121℃灭菌15min。
混合豆水由绿豆、赤小豆和黑豆置于蒸馏水中100℃加热15min制得，其中绿豆、赤小豆和黑豆的比例为1：1：1，混合豆类和蒸馏水的比例为1：10。
1.3平板培养基：1000mLM17培养基中加入15g琼脂粉。
1.4种子斜面培养基：1000mL种子培养基中加入15g琼脂粉。
2样品
分别从北京三家豆汁店购买的生豆汁，4℃下运输保存。在保质期限内进行菌株分离。
3.发酵菌种的分离
3.1样品稀释
将样品豆汁用灭菌后的生理盐水进行梯度稀释，用移液枪和灭菌的5mL移液枪头，取25mL样品加入盛有225mL无菌蒸馏水的三角瓶中，充分震荡10min后，即为稀释梯度10-1样品稀释液。继续重复操作至样品稀释液梯度为10-8。
3.2平板分离培养
选择稀释梯度为10-6-10-8的稀释液，分别取1ml稀释液利用倾注法培养于平板培养基中。将平板于30℃培养箱中恒温培养48h。
3.3平板纯化培养
根据形态学用无菌接种环从平板上选取适宜细菌菌落，转移至分离培养基中30℃培养24h。再将其于空白平板培养基上划线培养，重复3次以上，直至镜检下菌落形态一致。得到的单菌落接种于种子斜面培养基上，30℃培养48h。
4乳酸检测
采用高效液相色谱法，取适量种子培养液以5000r/min条件下离心5min，取上清液通过0.22μm细菌滤器后上样，检测时间为10min。
色谱柱：Cosmosil C18-PAQ(250mm×4.6mm，5μL)，色谱检测条件：流动相(pH 2.0磷酸：乙腈＝98：2)，检测波长210nm，进样量为10μL，流速为0.8mL/min。
5菌株筛选
5.1初筛
取镜检下符合乳酸乳球菌形态特征的菌株，进行过氧化氢酶实验和革兰氏染色实验。再采用高效液相色谱法对过氧化氢酶阴性及革兰氏染色阳性的菌株进行乳酸测定。对产乳酸的菌株采用种子斜面培养基进行保存并编号。
5.2复筛
将初筛出的符合乳酸乳球菌形态特征的革兰氏阳性，过氧化氢酶试验呈阴性，产乳酸的菌株，接种到三豆汤中，以三豆汤中乳酸菌活菌数和感官评分为指标复筛出一株适宜在三豆汤发酵基质中生长，且发酵风味最好的菌株YM313。
6菌株鉴定
6.1菌株YM313的形态特征观察
将菌株YM313在平板培养基中30℃下培养48h，然后进行革兰氏染色，其个体形态特征如表1所示。
表1菌株的形态特征
将菌株YM313在平板培养基上30℃下培养48h，观察菌落大小、形态和颜色，结果如表2所示。
表2菌落的形态特征
由表1～表2可知：提取菌株的形态特征和生成菌落的形态特征均与乳酸乳球菌相符。
6.2菌株YM313的16S rDNA序列分析结果
筛选得到菌株YM313的16SrDNA序列为：
TGCTATACATGCAAGTTGAGCGCTGAAGGTTGGTACTTGTACCGACTGGATGAGCAGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAATCTGCCTTTGAGCGGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCGCATAAAAACTTTAAACACAAGTTTTAAGTTTGAAAGATGCAATTGCATCACTCAAAGATGATCCCGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGGTAGAGAAGAACGTTGGTGAGAGTGGAAAGCTCATCAAGTGACGGTAACTACCCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGTGGTTTATTAAGTCTGGTGTAAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTATGCATTGGAAACTGGTAGACTTGAGTGCAGGAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGCCTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGATGTAGGGAGCTATAAGTTCTCTGTATCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCGTGCTATTCCTAGAGATAGGAAGTTCCTTCGGGACACGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAACGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACAGTGATGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTGGGAGTACCCGAAGTAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTTCCTAAGTAAGACCGA
将筛选得到菌株YM313的16SrDNA序列提交到Genbank(GenBank号为OM189539)与库中的已知序列进行BLAST比对后可知，菌株的16SrDNA序列与库中的Lactococcuslactisstrain相似度在99％以上，利用neighbor-joining算法构建系统发育树(MEGA-X)，结果如图1所示。
由图1可知：YM313的亲缘性与EU872263.1 Lactococcus lactis subsp.Lactis和MT473570.1 Lactococcus lactis subsp.lactis最接近。
由表1～表2以及图1综合可知：通过传统鉴定方法验结合分子生物学方法可以得出所筛选菌株为乳酸乳球菌。
6.3菌株YM313的生理生化特征
为进一步区分YM313所属乳酸乳球菌亚种，参照《伯杰细菌鉴定手册》进行生理生化实验鉴定，结果如表3所示。
表3菌株YM313的生理生化实验结果
根据表3，同时结合上述16SrDNA测序结果，进一步确定菌株YM313为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)。
所述乳酸乳球菌乳酸亚种YM313(Lactococcus lactis subsp.Lactis)已于2021年7月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61831。
实施例2菌株YM313在三豆汤发酵饮料中的应用
1实验材料
试验用的菌株为实施例1分离的Lactococcus lactis subsp.LactisYM313，种子培养基配方同上述实施例1，食品原料选择新鲜绿豆、新鲜赤小豆、新鲜黑豆、葡萄糖、茉莉绿茶、冰糖、纯净水。
2种子发酵液制备
用接种环挑取三环斜面保藏的Lactococcus lactis subsp.Lactis YM313于3mL种子培养基中，30℃下发酵14h后，将这3mL发酵液扩大培养，继续接入60mL种子培养基中30℃下发酵14h，获得的乳酸乳球菌乳酸亚种YM313种子培养液，每6mL为1份发酵剂。
3发酵生产三豆汤发酵饮料的方法
主要原料的重量份数组成为：绿豆3.3份，赤小豆3.3份，黑豆3.3份，茉莉绿茶0.3份，冰糖6份，葡萄糖0.5份，发酵剂1份，纯净水100份。
具体步骤为：将绿豆3.3份，赤小豆3.3份，黑豆3.3份，冰糖6份加入纯净水100份中，100℃加热20min，然后加入茉莉绿茶0.3份，浸泡3min，再加入葡萄糖0.5份，然后冷却至30℃，加入1份发酵剂，灌装后于30℃下发酵15h，发酵结束后，即得三豆汤发酵饮料。
4感官评价
本实验感官评定在食品实验室内完成，邀请10人组成评定小组，明确本实验的目的和意义以及感官评定的指标和注意事项。本实验采用随机双盲法进行检验(即对样品进行编号，检验样品也随机化)，旨在减少如个人嗜好与偏爱、经验等因素对检验结果的影响。评定分数采用3个分制，分别对不同的情况进行打分。每名成员单独进行评分，不互相交流，评定下一个样品之前要用清水漱口。取10名成员的平均分作为最后的结果。感官评价评分内容：外观，口感，风味。具体感官评分标准如表4所示，发酵前三豆汤和发酵后三豆汤饮料具体感官评价对比情况如表5所示。
表4感官评价表
表5感官评价对比
发酵前三豆汤 三豆汤发酵饮料
外观 质地较浑浊，颜色呈棕褐色 质地均匀，颜色呈鲜亮酒红色，且不易变色
口感 口感较好，但略甜，且无特点 口感较好，且酸甜适口
风味 有明显豆腥味 无明显豆腥味且发酵风味良好
感官评分 66.5分 91.5分
5保质期评定
分别参照国标GB 4789.36—2010《食品微生物学检验》，GB 4789.3—2016《大肠菌群计数》、GB 4789.4—2016《沙门氏菌检验》及GB 4789.10—2016《金黄色葡萄球菌检验》分别对发酵饮料中的乳酸菌、大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌进行检测。感官指标同上述感官评价方法。发酵过程中三豆汤发酵饮料活菌数和感官评分的变化如图2所示。
由图2可知：发酵前三豆汤内不含有益生菌，以Lactococcus lactissubsp.Lactis YM313为发酵剂发酵的三豆汤发酵饮料在发酵15h时乳酸菌活菌数达到8.27±0.14logCFU/ml，显著提高了三豆汤的益生性能。以Lactococcus lactis subsp.LactisYM313为发酵剂发酵的三豆汤发酵饮料与发酵前的三豆汤相比，在发酵15h时色泽鲜亮呈酒红色，酸甜适口，无明显豆腥味，且拥有优良发酵风味，感官评分显著提高。
6活性物质含量变化检测和抗氧化性评定
发酵前三豆汤与发酵后的三豆汤发酵饮料中活性物质、抗氧化性比较如表6所示。其中总黄酮的检测方法为：参照SN/T 4592-2016，以芦丁为标准品，在420nm波长处进行测定。在标准曲线上求得样液的浓度。总酚的检测方法为：采用福林酚比色法，以没食子酸为标准品，在760nm波长处进行测定。在标准曲线上求得样液的浓度。抗氧化性的评定方法为：采用DPPH·自由基法、Fenton法和邻苯三酚自氧化法，分别对三豆汤发酵饮料的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和氧自由基清除率进行测定。
表6发酵前三豆汤与发酵后的三豆汤发酵饮料中活性物质、抗氧化性比较
由表6可知：以Lactococcus lactis subsp.Lactis YM313为发酵剂发酵的三豆汤发酵饮料与发酵前的三豆汤相比，含有大量乳酸菌，并产生大量乳酸，使pH值显著下降，滴定酸度显著提高，这对腐败菌和致病菌有较强的抑制作用，从而延长了三豆汤的保质期。以Lactococcus lactis subsp.LactisYM313为发酵剂发酵的三豆汤发酵饮料与发酵前三豆汤相比，总黄酮和总酚含量显著提高，抗氧化性显著提高。所以，以Lactococcus lactissubsp.Lactis YM313为发酵剂发酵的三豆汤发酵饮料对人体健康起到的积极影响更大，功能性更强。
实施例3菌株YM313发酵对饮料风味及挥发性物质的影响
1材料
发酵前三豆汤饮料(MSD)、发酵后三豆汤饮料(FMSD)，具体制备方法见实施例2。
2实验方法
气相色谱质谱联用(GC-MS)
2.1样品提取流程
移取样品2mL至10mL顶空瓶中，80度水浴萃取30分钟，用将顶空微萃取进样针扎入顶空瓶中，继续加热30分钟后上机。
2.2仪器采集条件
具体仪器采集条件如表7所示。
表7仪器采集条件
2.3升温程序
初始温度值50℃保持时间2min，梯度1升温速率5℃/min，温度值180℃保持时间5min，梯度2升温速率10℃/min，温度值250℃保持时间5min。
2.3定性分析
根据全扫图中的母离子信息，利用Thermo NIST MS Search2.3本地数据库，进行物质鉴定。对样品中各组分进行定性分析。
3为了进一步研究发酵改良三豆汤风味的原理，分别对MSD和FMSD进行GC-MS检测，在MSD中共检测出45种挥发性物质，在FMSD中共检测出43中挥发性物质，差异风味物质如表8所示。
表8差异风味物质
结合检测结果，同时通过查找文献和CAS化合物注释信息，在所有挥发性物质中共提取出8种与风味相关的化合物。其中苯甲酸甲酯(Methyl benzoate)，壬醛(Nonanal)，乙酸苯甲酯(Benzyl acetate)三种豆腥味物质在FMSD中含量均出现下降。发酵后新生成了5种风味物乙酸、萜品烯、alpha-松油醇、氨茴酸甲酯、大马酮。其中萜品烯在FMSD检测出的所有风味物质中相对含量最高。
实施例4非靶向代谢组测定发酵前后饮料中小分子物质含量变化
采用LC-MS非靶向代谢组学，对混合乳酸菌发酵前后的三豆汤饮料中的小分子物质进行定性和定量，并进行差异性物质分析。
1材料与仪器
1.1材料
共2组待测样本，发酵后三豆汤饮料(FMSD)和发酵前三豆汤饮料(MSD)每组准备6个生物学重复样本，具体样本详情如表9所示。本次实验进行质量控制，同时制备了QC样本，QC样本为所有样品等量混合的样本。
表9样品信息
1.2试剂
甲醇(HPLC，Fisher Chemical)、乙腈(HPLC，Fisher Chemical)、甲酸(HPLC，CNW)、异丙醇(HPLC，Merck)。
1.3主要仪器设备如表10所示。
表10主要仪器设备信息
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2实验方法
2.1样本处理
待测样品于3000转下离心10min，取上清液备用。精确移取200μL上清液至1.5mL离心管中；加入800μL提取液(甲醇：乙腈＝1:1(v:v))，含0.02mg/mL的内标(L-2-氯苯丙氨酸)；涡旋混匀30s后，低温超声提取30min(5℃，40KHz)；将样品静置于-20℃，30min；离心15min(13000g，4℃)，移取上清液，氮气吹干；加入120μL复溶液(乙腈：水＝1:1)复溶；涡旋混匀30s，低温超声萃取5min(5℃，40KHz)；离心10min(13000g，4℃)，移取上清液至带内插管的进样小瓶中上机分析；另外，每个样本分别移取20μL上清液混合后作为质控样本。
2.2色谱分离
本次LC-MS分析的仪器平台为赛默飞公司的超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱UHPLC-QExactiveHF-X系统。色谱条件：色谱柱为ACQUITYUPLCHSST3(100mm×2.1mmi.d.,1.8μm；Waters,Milford,USA)；流动相A为95％水+5％乙腈(含0.1％甲酸)，流动相B为47.5％乙腈+47.5％异丙醇+5％水(含0.1％甲酸)，进样量为2μL，柱温为40℃。
2.3质谱采集
质谱条件：样品经电喷雾电离，分别采用正、负离子扫描模式采集质谱信号。具体参数如表11所示。
表11质谱参数
2.4数据分析
原始数据导入代谢组学处理软件Progenesis QI(Waters Corporation，Milford，USA)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐等，最终得到含保留时间、质荷比和峰强度等信息的数据矩阵。其后采用该软件进行特征峰搜库鉴定，将MS和MS/MS质谱信息与代谢数据库进行匹配，MS质量误差设置为小于10ppm，同时根据二级质谱匹配得分鉴定代谢物。主要数据库为http://www.hmdb.ca/、https://metlin.scripps.edu/等主流公共数据库以及自建的数据库。采用scipy(Python)Version1.0.0软件对数据进行PCA、相关性、KEGG通路富集、聚类分析、Heatmap热图等分析操作。通过ropls(R)Version1.6.2进行VIP分析和差异代谢物分析。
3结果与分析
3.1实验数据预处理及质量评价结果
采用Progenesis QI软件对代谢组学原始数据进行对齐和量化，并对数据进行噪音过滤(删除缺失值超过50％的样本)、对数转换(log10)和数据归一化(总和)等处理。
连续扫描得到总离子流图(TIC)，用以平衡稳定LC-MS系统，结果发现，本次实验TIC重叠图，重叠程度高，峰分离良好，可以由此判断出本次实验仪器稳定，数据可靠。
3.2样本差异性分析结果
参考Mónica Patricia Cala等人分析方法，对本实验中样品MSD(YMq1-6)和样品FMSD(YMh1-6)，采用PCA进行差异性分析，并绘制12个样品间的相关性热图，结果如图3～图4所示。
由图3可知，MSD和FMSD样品以及质控样品(QC)样本组的平行样本聚在一起，说明平行数据具有良好的分析稳定性和实验重现性。同时，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)解释率为分别43.20％和21.90％，两者累计贡献率达到65.10％，说明三组样本之间分离趋势较明显，组间差异性良好。由图4中12个样品之间的样本相关性热图结果可知，同组平行样品间相关性更强，这与PCA分析结果趋势相同。
3.3饮料发酵前后的代谢物分析结果
3.3.1饮料发酵前后代谢物鉴定结果
经过数据预处理后，对保留下来的代谢物与HMDB数据库进行比对，结果如图5所示。
由图5可知，在FMSD和MSD中共识别和注释出646种代谢物，可分为12个不同的类别，包括Ⅰ苯丙烷和聚酮化合物；Ⅱ脂质和类脂质分子；Ⅲ有机酸及其衍生物；Ⅳ有机氧化合物；Ⅴ有机杂环化合物；Ⅵ苯类；Ⅶ核苷、核苷酸和类似物；Ⅷ有机氮化合物；Ⅸ生物碱及其衍生物；Ⅹ碳氢化合物；Ⅺ木脂素、新木脂素及相关化合物；Ⅻ有机硫化合物。
3.3.2饮料发酵前后差异代谢物提取结果
为了探究乳酸菌发酵带来的三豆汤化学成分的变化，通过OPLS-DA(P<0.05)分析646种代谢物在样品中的VIP值，并结合每种代谢物的差异表达倍数(FC)，筛选出乳酸菌发酵前后三豆汤中含量出现显著变化的物质(VIP>1，FC<1或FC>1)，对分析得出的数据再此进行OPLS-DA分析和模型稳定性进行检验，结果如图6～图8所示。
由图6～图7可知，截距Q2在阳离子和阴离子模式下分别为-0.2285和-0.2269均小于0，表明OPLS-DA模型不存在拟合现象，说明本次差异代谢物提取是可行的。
由图8可知，在阴离子和阳离子模式下样品中共提取出148个差异代谢物，其中83个代谢物上调，65个代谢物下调。
3.3.3饮料发酵前后差异代谢物鉴定结果
通过HMDB数据库对148个差异代谢物进行鉴定，共能识别出112种。选择VIP值前30的差异代谢物，通过聚类热图和VIP条形图，分析这些代谢物在乳酸菌发酵前后表达量的变化程度，结果如图9～图15所示。
由图9～图15可知，这30种代谢物分别包括：9种有机酸及其衍生物，6种脂质和类脂分子，3种有机氧化合物，3种苯丙烷和聚酮，2种苯环型化合物，1种核苷、核苷酸和类似物，1种有机杂环化合物，5种其他类别代谢物。VIP值前三十的差异代谢物中，功能性物质和风味物质共发现6种，它们的表达量的具体变化程度由大到小排序为，Ethyl maltol，Zierin，5'-Cytidylic acid，Phenyllactic acid，Goshonoside F5，O2C(3,4,5-trihydroxy-6-[4-(5-hydrox y-7-methoxy-8-methyl-4-oxo-4H-chromen-3-yl)-2-methoxyphenoxy]oxane-2-carboxylic acid)。
3.4代谢通路分析
通过KEGG数据库对148个差异代谢物进行通路富集分析。共鉴定出58种差异代谢物，分布在14种代谢途径中。随后，进行了KEGG通路富集分析，以确定三豆汤在在发酵前后代谢通路上的差异，结果如图16所示。
由图16可知，重要代谢途径(Impact Value>0.1)包括D-精氨酸和D-鸟氨酸生物合成途径，氨基苯甲酸降解途径，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢代谢途径等。其中最重要的代谢通路为D-精氨酸和D-鸟氨酸生物合成途径，参与该代谢通路的代谢物包括L-Arginine和D-Ornithine，这是图9中L-Arginine含量显著下降、D-Ornithine含量显著提升的代谢途径。第二重要通路为氨基苯甲酸降解，参与该通路的物质为Aminohydroquinone，对水杨酸(P-S alicylic acid)，4羟基苯甲醛(4-Hydroxybenzaldehyde)。值得注意的是发酵将P-Salicylic a cid降解为4-Hydroxybenzaldehyde。其中4-Hydroxybenzaldehyde是有机芳香化合物，有研究表明是天麻脑保护作用的重要成分之一，其具有抗脑血栓形成和抗炎，抗氧化功效。(4-Hy droxybenzaldehyde作为P-Salicylic acid的次级代谢物，有研究表明，次级代谢物抗氧化性会有所提高，这可能是发酵后抗氧化性提高的原因之一)。第三重要代谢通路为丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，参与该通路的代谢物为L-Glutamine，Oxoglutaric acid，L-Asparagine。可能是乳酸菌代谢活动利用了豆类中广泛存在的氨基酸L-Glutamine生成了Oxoglutaric acid，这种物质是TCA循环中的一个关键分子，在决定这种重要的代谢的总体速率方面起着基础性的作用，还有研究表明其平衡碳氮代谢的关键代谢物。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 锦州医科大学
<120> 一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其在三豆汤发酵饮料中的应用
<130> 2022.05.27
<141> 2022-06-22
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1438
<212> DNA
<213> 乳酸菌为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp. Lactis )
<400> 1
tgctatacat gcaagttgag cgctgaaggt tggtacttgt accgactgga tgagcagcga 60
acgggtgagt aacgcgtggg gaatctgcct ttgagcgggg gacaacattt ggaaacgaat 120
gctaataccg cataaaaact ttaaacacaa gttttaagtt tgaaagatgc aattgcatca 180
ctcaaagatg atcccgcgtt gtattagcta gttggtgagg taaaggctca ccaaggcgat 240
gatacatagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact 300
cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcg gcaatggacg aaagtctgac cgagcaacgc 360
cgcgtgagtg aagaaggttt tcggatcgta aaactctgtt ggtagagaag aacgttggtg 420
agagtggaaa gctcatcaag tgacggtaac tacccagaaa gggacggcta actacgtgcc 480
agcagccgcg gtaatacgta ggtcccgagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag 540
cgcaggtggt ttattaagtc tggtgtaaaa ggcagtggct caaccattgt atgcattgga 600
aactggtaga cttgagtgca ggagaggaga gtggaattcc atgtgtagcg gtgaaatgcg 660
tagatatatg gaggaacacc ggtggcgaaa gcggctctct ggcctgtaac tgacactgag 720
gctcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780
gagtgctaga tgtagggagc tataagttct ctgtatcgca gctaacgcaa taagcactcc 840
gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900
ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatact 960
cgtgctattc ctagagatag gaagttcctt cgggacacgg gatacaggtg gtgcatggtt 1020
gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccctattg 1080
ttagttgcca tcattaagtt gggcactcta acgagactgc cggtgataaa ccggaggaag 1140
gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg 1200
gatggtacaa cgagtcgcga gacagtgatg tttagctaat ctcttaaaac cattctcagt 1260
tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag 1320
cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgggagtt 1380
gggagtaccc gaagtaggtt gcctaaccgc aaggagggcg cttcctaagt aagaccga 1438

Claims (6)

1.一株乳酸菌，其特征在于，所述乳酸菌为乳酸乳球菌乳酸亚种YM313(Lactococcus lactis subsp. Lactis YM313)，保藏号为GDMCC NO.61831。
2.含权利要求1所述的乳酸菌的发酵剂，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：首先将所述乳酸菌接种于2~5 mL种子培养基中进行第一次发酵培养，然后将其接入50~70 mL种子培养基中进行二次扩大培养获得种子培养液，最后每5~7 mL种子培养液即为1份所述的发酵剂；
所述种子培养基的配方为：混合豆水100 mL、葡萄糖2 g、酵母浸粉0.5 g、甘油磷酸钠1.5 g、磷酸氢二钾0.2 g、无水乙酸钠0.16 g；
所述混合豆水由绿豆、赤小豆和黑豆置于蒸馏水中100℃加热15min制得；所述绿豆、赤小豆和黑豆的比例为1：1：1，混合豆类和蒸馏水的比例为1：10。
3.如权利要求2所述发酵剂，其特征在于，所述两次发酵培养的条件均为：30℃下发酵14h。
4.一种三豆汤发酵饮料，其特征在于，其主要原料的重量份数组成为：绿豆3.0~3.5份，赤小豆3.0~3.5份，黑豆3.0~3.5份，茉莉绿茶0.1~0.5份，冰糖5~7份，葡萄糖0.3~0.7份，权利要求2所述的发酵剂0.5~1.5份，纯净水100份；所述茉莉绿茶中茉莉花和绿茶茶叶的比例为1：8~12。
5.如权利要求4所述的三豆汤发酵饮料，其特征在于，其主要原料的重量份数组成为：绿豆3.3份，赤小豆3.3份，黑豆3.3份，茉莉绿茶0.3份，冰糖6份，葡萄糖0.5份，权利要求2所述的发酵剂1份，纯净水100份；所述茉莉绿茶中茉莉花和绿茶茶叶的比例为1：10。
6.权利要求5所述的三豆汤发酵饮料的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）各组分称取所需重量份数；
（2）将绿豆、赤小豆、黑豆、冰糖加入纯净水中，100℃加热；
（3）加入茉莉绿茶浸泡；
（4）加入葡萄糖，冷却至30℃；
（5）加入权利要求2所述的发酵剂，灌装后于30℃下发酵；
（6）发酵结束后，即得所述三豆汤发酵饮料。
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