CN116555077A - 一株戊糖乳杆菌sj-2及其发酵应用 - Google Patents

一株戊糖乳杆菌sj-2及其发酵应用 Download PDF

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CN116555077A CN202310262738.4A CN202310262738A CN116555077A CN 116555077 A CN116555077 A CN 116555077A CN 202310262738 A CN202310262738 A CN 202310262738A CN 116555077 A CN116555077 A CN 116555077A
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Abstract

本发明涉及一株戊糖乳杆菌SJ‑2及其发酵应用，属于生物工程技术领域。所述戊糖乳杆菌SJ‑2是从自然发酵绿豆酸浆中分离并筛选得到的，保藏编号为CGMCC No.26061。该菌具有耐受性好、产酸能力强、生长速度快等优点，可与异常汉逊酵母复配，形成绿豆浆水复合菌，应用于绿豆浆水的发酵。本发明使用具有自主知识产权的菌种发酵绿豆浆水，显著提高绿豆酸浆的风味成分和营养价值，提升了稳定性和品质。采用人工发酵绿豆酸浆的方法具有发酵时间短、绿豆浆水酸度高、固形物含量浓度高的特点，可工业化生产和开发成可稀释使用的浓缩的方便酸浆，进一步继承和发扬洛阳地方特色食品。

Description

一株戊糖乳杆菌SJ-2及其发酵应用
技术领域
本发明属于微生物应用和食品酿造领域，涉及一株乳杆菌及其应用，具体涉及一株发酵特性好，耐受性好、产酸能力强、生长速度快、产风味物质多，适用于绿豆浆水发酵的戊糖乳杆菌SJ-2。
背景技术
洛阳传统美食之一的浆面条是一种民间小吃，酸香味美，易于消化，其独特的口味及丰富的营养价值，被洛阳人民乃至全国人民喜爱。绿豆酸浆是洛阳传统美食“浆面条”的主要食材，绿豆酸浆品质直接决定着浆面条的风味和质量。绿豆酸浆是绿豆浆水经微生物发酵后，不仅能够保持原有的营养价值的基础上使绿豆中大分子的淀粉和蛋白质降解，而且富含多种益生菌，易被人体吸收。目前绿豆酸浆生产方式陈旧、工艺落后，生产仍处于初级阶段，对自然条件和人工操作依赖较大，其产品有品质不稳定、易受杂菌污染和风味口感不佳等问题。目前洛阳绿豆酸浆的生产没有科学的工艺、技术规范和标准依据，绿豆酸浆的发酵制备尚未进入依靠人工发酵剂及复合酶制剂投入工业化生产阶段。
通过人工复配一定比例的乳酸菌和酵母菌，形成纯化培养的绿豆浆水菌，加入到绿豆浆水中进行发酵，可以得到发酵过程可控、发酵周期短、产品质量高和风味好、具有稳定性强的绿豆酸浆。经研究发现在绿豆浆水中，对风味贡献最大的是乳酸菌，所以筛选发酵特性好，适合人工复配的乳酸菌具有重要意义。
戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)隶属于乳酸菌属(Lactobacillus)。1894年，FRED E等从德国酸菜(Sauerkraut)中分离鉴定出戊糖乳杆菌，发现其在发酵肉制品、发酵谷物蔬菜和乳制品等中广泛存在。戊糖乳杆菌具有多种益生功能和特殊抗菌能力，不仅在食品发酵和保藏过程中起到了重要的作用，而且对人体健康产生促进作用。
发明内容
针对目前对洛阳传统绿豆酸浆的发酵工艺研究还是空白的现状，本发明通过从洛阳某知名浆坊的绿豆酸浆中分离、筛选、鉴定得到一株耐受性好、产酸能力强、生长速度快的乳杆菌菌株SJ-2并进行了保藏，以该菌为主，辅助添加异常汉逊酵母发酵绿豆浆水，发酵过程条件可控，绿豆酸浆品质稳定，且具有丰富的风味物质、蛋白质、总多酚、总黄酮、Vc等活性成分和较高的抗氧化活性；生产的绿豆酸浆具有发酵时间短、酸度高、固形物含量高的特点，可开发成可稀释使用的浓缩的方便酸浆。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
第一方面，本发明提供一株戊糖乳杆菌SJ-2，所述戊糖乳杆菌SJ-2为乳杆菌属，分类命名为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏编号为CGMCC NO.26061，保藏日期为2022年11月7日。
第二方面，本发明提供一种微生物菌剂，包含上述的戊糖乳杆菌SJ-2。
第三方面，本发明提供上述戊糖乳杆菌SJ-2或包含所述戊糖乳杆菌SJ-2的微生物菌剂在发酵绿豆浆水中的应用。
第四方面，本发明提供一种利用所述的戊糖乳杆菌SJ-2发酵生产绿豆酸浆的方法，包括以下步骤：
(1)、清洗绿豆并浸泡12h，沸水杀菌1～2min，添加蔗糖的重量为干绿豆重量的1～3％，备用；
(2)、将步骤(1)按照水含量80％～90％混合，打浆15～25min，温度降至室温，得绿豆浆水，备用；
(3)、向步骤(2)所得绿豆浆水中接种戊糖乳杆菌SJ-2和异常汉逊酵母，25-30℃发酵18～30h，得绿豆酸浆。
其中，步骤(2)中，所述绿豆浆水为混合液和上层澄清液的至少一种。
其中，步骤(3)中，所述戊糖乳杆菌SJ-2在接种前经活化和扩大培养，具体步骤如下：
步骤一、斜面固体培养：
将菌种接种在固体斜面培养基上，于25～32℃培养48～72h，得到斜面固体培养的活化菌种，备用；
所述的固体斜面培养基的配方为：每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10g CH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3g KH2PO4、0.1～1g MnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、1.5～2％琼脂粉、余量为水，pH调至7；
步骤二、摇瓶菌种扩大培养：
取步骤一得到的活化菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一支试管加入3～5mL；将菌悬液接种于液体种子扩大培养基中，接种量为液体种子扩大培养基体积的8～10％，培养温度28～32℃，培养时间24～48h，得到种子液，作为发酵绿豆浆水的种子；所述的液体种子扩大培养基的配方为：每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10g CH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3g KH2PO4、0.1～1g MnSO4、0.1～1g MgSO4、0.5～2mL吐温80、余量为水。
其中，步骤(3)中，所述戊糖乳杆菌SJ-2的接种量为7％-9％，所述异常汉逊酵母的接种量为0.5％-2％。
第五方面，本发明提供利用上述发酵方法制备的绿豆酸浆。
本发明相比于现有技术，具有以下有益效果：
1、本发明通过对戊糖乳杆菌SJ-2生物学特性分析显示，该菌具有安全性好、耐受性好、产酸能力强、生长速度快等优点，可以与异常汉逊酵母进行协同发酵，应用于绿豆浆水的发酵，发酵后的绿豆酸浆具有强的产品品质稳定性、高含量的活性成分和强的抗氧化能力，对人体有较大益生性。本发明主要使用具有自主知识产权的菌种发酵绿豆浆水，与传统工艺发酵的绿豆浆水相比，本发明发酵周期短、产品质量高、固形物含量浓度高且发酵过程易于控制，提高了菌种的利用率，具有一定的工业应用价值。
2、将戊糖乳杆菌SJ-2应用于发酵绿豆浆水中，在绿豆浆水中快速繁殖并保持大量活菌占据微生态优势，进而抑制有害菌生长繁殖，从而避免有害代谢产物产生，具有稳定绿豆酸浆的品质。本发明方法简单易行，效果稳定且易于大面积推广使用。
生物材料的保藏：戊糖乳杆菌SJ-2，分类命名为戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)，保藏编号为CGMCC NO.26061，保藏日期为2022年11月7日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1是SJ-2菌落照片；
图2是SJ-2菌体革兰氏染色显微照片(1600倍)；
图3是NJ法构建的SJ-2的系统发育树。
具体实施方式
一、产酸能力强、耐受性好的乳杆菌菌株筛选和鉴定，其具体步骤如下：
本发明将取自洛阳某市售绿豆酸浆10mL加入90mL无菌水中，摇匀震荡；再取1mL样品加入9mL无菌水中，以此类推。选取三个合适的浓度梯度依次涂布固体培养平板(每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10g CH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3g KH2PO4、0.1～1g MnSO4、0.1～1g MgSO4、0.5～2mL吐温80、1.5～2％琼脂粉、1％碳酸钙、余量为水，pH调至7左右)，28℃培养48～72h，选取平板上产生较大透明圈的菌株，备用。将初筛出的菌株接种到复筛固体培养基平板(每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10g CH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3gKH2PO4、0.1～1g MnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、1.5～2％琼脂粉、30mL乳酸、余量为水)，28℃培养48h后选出生长较好的菌株。将筛选出的菌株接种到复筛液体培养基(每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10g CH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3g KH2PO4、0.1～1g MnSO4、0.1～1g MgSO4、0.5～2mL吐温80、1.5～2％琼脂粉、30mL乳酸、余量为水)中，28℃静置培养15h，以氢氧化钠滴定总酸(以醋酸计)含量。经两轮复筛，最终得到一株产乳酸SJ-2(见图1)，该菌革兰氏染色呈阳性(见图2)，产酸量为2.1g/100mL，pH为6.5时，戊糖乳杆菌SJ-2的OD值为3.1；pH为5.5时，戊糖乳杆菌SJ-2的OD值为2.5；pH为4.5时，戊糖乳杆菌SJ-2的OD值为1.8；pH为3.5时，戊糖乳杆菌SJ-2的OD值为0.9；pH为2.5和1.5时，戊糖乳杆菌SJ-2的OD值为0.3；呈逐渐降低趋势，戊糖乳杆菌SJ-2生长最适pH5.5～6.5。
本发明筛选得到的产乳酸的微生物SJ-2，将菌株送至华大基因公司进行测序，测序结果(SEQ ID NO：01)提交至NCBI数据库进行比对，结果显示，菌株SJ-2的16S rDNA序列与Lactiplantibacillus pentosus的同源性高达99％。采用MEGA7.0软件构建出菌SJ-2的系统发育树(见图3)，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》(八版)生理生化鉴定，该菌为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)是乳酸菌中的一种，在分类学中归于硬壁菌门(Firmicutes)，杆菌纲(Bacilli)、乳杆菌目(Lactococcus)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、乳杆菌属(Lactobacillus)。该菌为杆状，革兰氏阳性，分离时菌落小，表面光滑，兼性厌氧菌，最适温度25～32℃，生长最适pH5.5～6.5。
二、一种发酵绿豆酸浆的发酵工艺方法，其具体步骤如下：
(1)斜面固体培养：
将戊糖乳杆菌SJ-2接种在固体斜面培养基上，于25～32℃培养48～72h，得到斜面固体培养的活化菌种，备用；
所述的斜面固体培养基的配方为：每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10g CH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3g KH2PO4、0.1～1g MnSO4、0.1～1g MgSO4、0.5～2mL吐温80、1.5～2％琼脂粉、余量为水，pH调至7左右；
(2)摇瓶菌种扩大培养：
取(1)得到的戊糖乳杆菌SJ-2，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一支试管加入3～5mL，将菌悬液接种于扩大培养基中，接种量为液体培养基体积的5～10％，培养温度28～32℃，培养时间24～48h，得到种子液，作为发酵绿豆浆水的种子；
所述的液体种子扩大培养基的配方为：每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10g CH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3g KH2PO4、0.1～1g MnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、余量为水、pH调至7左右；
(3)绿豆酸浆的发酵
用蒸馏水清洗绿豆并浸泡12h，放入100℃沸水杀菌1～2min，添加蔗糖的重量为干绿豆重量的1～3％；按照水含量80％～90％混合，打浆15～25min，温度降至室温；按比例接种戊糖乳杆菌SJ-2和异常汉逊酵母，25-30℃发酵24-48h。
三、戊糖乳杆菌SJ-2的pH和酸度测定：
将分离纯化的戊糖乳杆菌SJ-2菌悬液接种于液体种子培养基中，接种量为液体培养基体积的8～10％，培养温度28～32℃，每隔4h取出15ml培养液，采用精密pH计和酸碱滴定法测定酸度。
所述的液体种子扩大培养基的配方为：每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10g CH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3g KH2PO4、0.1～1g MnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、余量为水、pH调至7左右。
四、戊糖乳杆菌SJ-2的耐受性：
用1mol/L的HCl溶液调整液体种子扩大培养基的pH分别为0、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5，每份接入戊糖乳杆菌种子液1ml，放置于培养箱中培养72h。以空白培养基作对照600nm下测每组的溶液的OD值。
所述的液体种子扩大培养基的配方为：每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10g CH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3g KH2PO4、0.1～1g MnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、余量为水、pH调至7左右。
五、蛋白质含量测定：
取绿豆酸浆样品用蒸馏水稀释10倍的样品溶液，1mL样品溶液中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，混匀。静置2min后595nm测定吸光度值，计算绿豆酸浆的蛋白质含量。
六、DPPH自由基清除能力测定：
样品处理：取绿豆酸浆样品用蒸馏水稀释得到稀释50倍的样品溶液。取2mL稀释后的样品溶液和2mL DPPH溶液作为实验组，对照组用2mL无水乙醇代替DPPH溶液，以加入2mLDPPH溶液和2mL无水乙醇为对照组，避光反应30min，517nm测定吸光度，计算DPPH自由基清除率。
七、总黄酮含量的测定：
取1mL绿豆酸浆于10mL比色管中，加入60％的乙醇，使所有比色管中体积为5mL，加入0.3mL的5％的亚硝酸钠溶液，并且摇匀后静置放置5min，之后加入0.3mL的10％硝酸铝溶液，使用振荡器摇匀并放置6min后，加入1mol/L的氢氧化钠溶液4mL，最后用60％乙醇完成定容，放置15min，在510nm波长处测吸光度，并根据标准曲线计算总黄酮含量。
八、总多酚含量的测定：
取1.0mL绿豆酸浆于25mL容量瓶中，依次加入0.8mol/L的福林试剂0.65mL，避光反应后，加5入20％碳酸钠溶液4mL，用蒸馏水定容，60℃水浴60min，取反应后的样品2mL加入2mL蒸馏水稀释2倍后720nm处测吸光度，计算总多酚含量。
九、Vc含量的测定：
取10.0mL绿豆酸浆于100mL锥形瓶中，加1滴10％盐酸，用染料液滴至粉红色，且在15s内不消失。采用2，6-二氯靛酚的标准溶液滴定样品中维生素C的含量，根据其消耗量求得维生素C的含量。
十、挥发性风味物质测定：
采用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用的方法进行：
(1)萃取条件：先将萃取头在气相色谱的进样口于250℃老化至无杂峰，将6mL样品(加入10μL浓度为100mg/L的2-辛醇作为内标)放入15mL固相微萃取样品瓶中，加入1g氯化钠，放入磁力搅拌子，盖上盖子。放入40℃恒温水浴中，平衡10min，将SPME萃取头通过瓶盖插入到样品中的顶空部分，推出纤维头，顶空吸附40min，随后抽回纤维头，从样品瓶中拔出萃取头，再将萃取头插入GC/MS仪的气相色谱进样口，推出纤维头，于250℃解吸5min，抽回纤维头后拔出萃取头，同时启动仪器采集数据。
(2)仪器条件：色谱条件：TG-WAXMS毛细管色谱柱，柱长30μm，内径0.25mm，液膜厚度0.25μm；载气：He气，流量1mL/min，分流流量为50mL/min，吹扫流量为3mL/min，进样口温度：250℃。
升温程序：起始温度35℃，保持5min；以4℃/min升至180℃，保持2min；再以5℃/min升温至220℃，保持5min，共56.25min。
质谱条件：传输线温度为250℃，离子源温度为280℃，电离方式为EI电离源，电子能量为70eV，质量扫描范围为33-450amu。
(3)数据处理与分析：检索谱库为replib和mainlab，检测出的挥发性成分匹配度大于800的化合物。并采用峰面积归一化法计算所有组分的相对峰面积比。样品中各组分风味物质浓度计算如公式所示：Ci＝Ai/As×Cs；
式中：Ci：样品中各挥发性风味化合物浓度，μg/L；
Cs：2-辛醇浓度，μg/L；
Ai：样品中待测物质对应的色谱峰面积；
As：内标的色谱峰面积。
下面申请人将结合具体的实施例对本发明产品的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域人员清楚地理解本发明。但应该理解，下列实施例不应以任何方式被解释为对本申请权利要求书请求保护范围的限制。
下述实施例中，如未特别说明，所用试剂均为常规市售试剂，所用操作手段均为常规技术手段。
实施例1：说明如何筛选得到戊糖乳杆菌SJ-2。
(1)平板初筛：将取自洛阳某知名酸浆坊的绿豆酸浆，摇匀。取1mL绿豆酸浆加入到9mL无菌水中，混匀后，再取1mL样品加入9mL无菌水中，以此类推。选取三个合适的浓度梯度依次涂布到固体培养平板(每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10gCH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3g KH2PO4、0.1～1g MnSO4、0.1～1g MgSO4、0.5～2mL吐温80、1.5～2％琼脂粉、1％碳酸钙、余量为水，pH调至7左右)，28℃培养72h，选取平板上产生透明圈较大的菌株。将初筛出的菌株纯化到复筛固体培养基平板上(每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10g CH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3g KH2PO4、0.1～1gMnSO4、0.1～1g MgSO4、0.5～2mL吐温80、1.5～2％琼脂粉、30mL乳酸、余量为水)，28℃培养48h，选出生长较好的菌株。
(2)摇瓶复筛：将筛选出的菌株接种到复筛液体培养基(每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10g CH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3gKH2PO4、0.1～1gMnSO4、0.1～1g MgSO4、0.5～2mL吐温80、1.5～2％琼脂粉、30mL乳酸、余量为水)中，28℃静置培养48h，以氢氧化钠滴定总酸(以醋酸计)含量。
(3)经两轮复筛，最终得到一株耐酸性菌株SJ-2(见图1)，该菌革兰氏染色呈阳性(见图2)，产酸能力强的菌株SJ-2。
实施案例2：说明如何鉴定戊糖乳杆菌SJ-2。
(1)分离纯化出单菌落斜面，送至武汉华大基因公司进行测序，测序结果提交至NCBI数据库进行比对，结果显示，菌株SJ-2的16S rDNA序列(SEQ ID NO：01)与Lactiplantibacillus pentosus的同源性高达99％。采用MEGA7.0软件，选择NJ法构建出SJ-2的系统发育树(见图3)。
(2)通过菌株SJ-2的形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列，确定SJ-2为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)。
(3)将鉴定为戊糖乳杆菌的菌株SJ-2进行保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.26061，保藏日期为2022年11月7日。
(4)所述编号为CGMCC N0.26061的戊糖乳杆菌的菌株SJ-2的16S rDNA的碱基序列如SEQ ID NO：01所示。
实施例3说明如何以绿豆浆水为原料发酵绿豆酸浆。
(1)种子液的制备：将于冰箱4℃保藏的SJ-2斜面接种至装液量100mL的250mL三角瓶中(每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10g CH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3g KH2PO4、0.1～1g MnSO4、0.1～1g MgSO4、0.5～2mL吐温80、余量为水、pH调至7左右)，28℃、培养48h；将异常汉逊酵母接种至YPD培养基装液量100mL的250mL三角瓶中，37℃，180r/min培养36h。
(2)绿豆酸浆的发酵
用蒸馏水清洗绿豆并浸泡12h，放入100℃沸水杀菌1～2min，添加蔗糖的重量为干绿豆重量的1％～3％；按照水含量80％～90％混合，打浆15～25min，温度降至室温；将戊糖乳杆菌SJ-2：异常汉逊酵母按照接种量7％：2％的比例接种至绿豆浆水中，28℃发酵24h。
对发酵完成的绿豆酸浆进行总蛋白质、pH、酸度、总黄酮含量、总多酚、Vc含量、抗氧化性活性的测定，均以市售的绿豆酸浆作为对照，结果见表一。
表一：实施例3营养指标。
实施例4说明如何以绿豆浆水为原料发酵绿豆酸浆。
(1)种子液的制备：将于冰箱4℃保藏的SJ-2斜面接种至装液量100mL的250mL三角瓶中(每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10g CH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3g KH2PO4、0.1～1g MnSO4、0.1～1g MgSO4、0.5～2mL吐温80、余量为水、pH调至7左右)，28℃、培养48h；将异常汉逊酵母接种至YPD培养基装液量100mL的250mL三角瓶中，37℃，180r/min培养36h。
(2)绿豆酸浆的发酵
用蒸馏水清洗绿豆并浸泡12h，放入100℃沸水杀菌1～2min，添加蔗糖的重量为干绿豆重量的1～3％；按照水含量80％～90％混合，打浆15～25min，温度降至室温；将戊糖乳杆菌SJ-2：异常汉逊酵母按照接种量8％：1％的比例接种至绿豆浆水中，28℃发酵24h。
对发酵完成的绿豆酸浆进行总蛋白质、pH、酸度、总黄酮含量、总多酚、Vc含量、抗氧化性活性的测定，均以市售的绿豆酸浆作为对照，结果见表二。
表二：实施例4营养指标。
实施例5说明如何以绿豆浆水为原料发酵绿豆酸浆。
(1)种子液的制备：将于冰箱4℃保藏的SJ-2斜面接种至装液量100mL的250mL三角瓶中(每1000mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10g CH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3g KH2PO4、0.1～1g MnSO4、0.1～1g MgSO4、0.5～2mL吐温80、余量为水、pH调至7左右)，28℃、培养48h；将异常汉逊酵母接种至YPD培养基装液量100mL的250mL三角瓶中，37℃，180r/min培养48h。
(2)绿豆酸浆的发酵
用蒸馏水清洗绿豆并浸泡12h，放入100℃沸水杀菌1～2min，添加蔗糖的重量为干绿豆重量的1％～3％；按照水含量80％～90％混合，打浆15～25min，温度降至室温；将戊糖乳杆菌SJ-2：异常汉逊酵母按照接种量9％：0.5％的比例接种至绿豆浆水中，28℃发酵24h。
对发酵完成的绿豆酸浆进行总蛋白质、pH、酸度、总黄酮含量、总多酚、Vc含量、抗氧化性活性的测定，均以市售的绿豆酸浆作为对照，结果见表三。
表三：实施例5营养指标。
通过对实施例3、4、5进行蛋白质含量、pH、总酸、总黄酮含量、总多酚含量、Vc含量、DPPH自由基清除率、香气物质的种类和含量，共计8项指标的测定，发现其含量对比自然发酵绿豆酸浆均有较大程度的提高，说明通过纯化绿豆酸浆菌种进行发酵绿豆浆水，能较好地转化利用绿豆浆水中的天然成分，提高绿豆酸浆的品质和稳定性；人工发酵的绿豆酸浆具有发酵时间短、绿豆浆水酸度高、固形物含量浓度高的特点，可工业化生产和开发成可稀释使用的浓缩的方便酸浆，进一步继承和发扬洛阳地方特色食品。
表四：实施例5中的挥发性风味物质。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一株戊糖乳杆菌SJ-2，其特征在于：所述戊糖乳杆菌SJ-2为乳杆菌属，分类命名为戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏编号为CGMCC NO.26061，保藏日期为2022年11月7日。
2.一种微生物菌剂，包含权利要求1所述的戊糖乳杆菌SJ-2。
3.权利要求1所述的戊糖乳杆菌SJ-2或权利要求2所述的微生物菌剂在发酵绿豆浆水中的应用。
4.一种利用权利要求1所述的戊糖乳杆菌SJ-2发酵生产绿豆酸浆的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）、清洗绿豆并浸泡12 h，沸水杀菌1~2 min，添加蔗糖，蔗糖的重量为干绿豆重量的1~3%，备用；
（2）、将步骤（1）按照水含量80%~90%混合，打浆15~25 min，温度降至室温，得绿豆浆水；
（3）、向步骤（2）所得绿豆浆水中接种戊糖乳杆菌SJ-2和异常汉逊酵母，25-30 ℃发酵18~30 h，得绿豆酸浆。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述绿豆浆水为混合液和上层澄清液的至少一种。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述戊糖乳杆菌SJ-2在接种前经活化和扩大培养，具体步骤如下：
步骤一、斜面固体培养：
将菌种接种在固体斜面培养基上，于25~32 ℃培养48～72 h，得到斜面固体培养的活化菌种，备用；
所述的固体斜面培养基的配方为：每1000 mL培养基中包含8～15 g蛋白胨、10～20 g酵母粉、18～25 g葡萄糖、1.8～3 g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4 g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10 g CH3COONa、1～3 g柠檬酸三铵、1～3 g KH2PO4、0.1～1 g MnSO4、0.1～1g MgSO4、0.5～2 mL吐温80、1.5～2%琼脂粉、余量为水，pH调至7；
步骤二、摇瓶菌种扩大培养：
取步骤一得到的活化菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一支试管加入3～5 mL；将菌悬液接种于液体种子扩大培养基中，接种量为液体种子扩大培养基体积的8～10％，培养温度28～32 ℃，培养时间24～48 h，得到种子液，作为发酵绿豆浆水的种子；
所述的液体种子扩大培养基的配方为：每1000 mL培养基中包含8～15 g蛋白胨、10～20 g酵母粉、18～25 g葡萄糖、1.8～3 g脱脂奶粉、1.2～2.4 g Vc、0.6～2.4 g半胱氨酸、3～10 g牛肉膏、3～10 g CH3COONa、1～3 g柠檬酸三铵、1～3 g KH2PO4、0.1～1 g MnSO4、0.1～1 g MgSO4、0.5～2 mL吐温80、余量为水。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述戊糖乳杆菌SJ-2的接种量为7％-9％，所述异常汉逊酵母的接种量为0.5％-2％。
8.利用权利要求4~7任意一种所述的方法制备的绿豆酸浆。
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CN116855424A (zh) * 2023-08-23 2023-10-10 四川大学 一株抑制解脂耶氏酵母菌的戊糖乳植物杆菌及其应用

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