CN115029434B - 一种notch2nlc基因cgg重复数检测体系及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请属于分子诊断技术领域，具体涉及一种对神经元核内包涵体病相关NOTCH2NLC基因CGG单元重复数量检测的体系及其试剂盒，该体系能够根据检测得到的全长产物大小和CGG重复单元扩增产物片段大小的结果对CGG重复单元数量作出准确的判断，从而更加特异、灵敏、稳定、快速的鉴定神经元核内包涵体病(NIID)，并区别于其他相关神经性疾病。

Description

一种NOTCH2NLC基因CGG重复数检测体系及试剂盒

技术领域

本申请属于分子诊断技术领域，具体涉及一种对神经元核内包涵体病相关NOTCH2NLC基因CGG单元重复数量检测的体系和试剂盒。

背景技术

神经元核内包涵体病(Neuronal Intranuclear Inclusion Disease,NIID)是一种罕见的神经退行性疾病，发病率不详。临床上该疾病以中枢和外周神经系统及内脏器官内嗜酸性透明包涵体为特征的慢性进展性神经退行性疾病。该病临床表征异质性大，主要表现为认知障碍、肢体无力、感觉异常、自主神经功能障碍、共济失调、帕金森症状、癫痫、发作性意识障碍、卒中样发作、脑炎样发作等，临床表现四不像，形式多样，极易导致漏诊误诊等。之前主要通过皮肤活检或尸检等有创方法发现嗜酸性核内包涵体而确诊，发病机制尚不明了。

2019年在国际上日本学者及国内学者利用LRS技术首次揭示了神经元核内包涵体病致病机制与NOTCH2NLC基因5'非翻译区域(UTR)GGC重复扩展突变相关，并提出了NIID相关疾病的概念，为常染色体显性遗传，进一步方便了该病的诊断。目前可以明确NOTCH2NLC基因中GGC的异常扩增为NIID的致病基因，临床的诊断标准，灰区为40～60，阳性为大于60。可以通过检测NOTCH2NLC基因GGC三核苷酸重复突变用于诊断NIID患者的遗传学依据，及相应家系的筛查与指导优生优育等。

以往该疾病的诊断主要依赖典型的影像学表现(DWI皮质髓质交界处的高信号)和皮肤活检(嗜酸性玻璃样核内包涵体)。但这些检查出现异常往往在处于疾病晚期，不利于疾病的早期诊疗，并且极易将该病误诊为老年性痴呆、帕金森病和周围神经病等疾病。随着致病基因的发现及相关研究发现，可以将NOTCH2NLC基因测试用作皮肤活检的替代方法，以诊断NIID。

虽然，研究通过LRS技术发现了NIID致病机制与NOTCH2NLC相关，但是作为临床上诊断的推广技术将会受到技术发展的限制，而不易开展或者费用高、技术难度大。另外，Southern印迹作为能够检测相关基因重复数量的传统方法，主要局限在于，无法准确判断具体重复单元的重复数、操作不当易产生假阴性结果、操作繁琐不适于临床大规模检测。

对于此类检测动态突变疾病的方法，重复引物PCR(repeat primed PCR，RP PCR)或三引物PCR(Triplet Repeat Primed PCR，TP PCR)是较为有效和得到认可的方法。并且RP PCR或TP PCR的产物可以通过琼脂糖电泳、聚丙烯凝胶电泳、毛细管电泳等方法检测。由于毛细管电泳检测灵敏度高、分辨率高，能够实现定量检测重复数，所以更适合此类检测，应用更广泛。不过目前实践中针对NOTCH2NLC基因5'非翻译区域(UTR)GGC重复单元检测的RP PCR或TP PCR方法，比如专利CN201910521984.0和CN202110850961.1，仍然存有检测特异性差和灵敏度偏低的问题，实践中仍需开发更适于临床应用的诊断试剂盒。

有鉴于此，提出本申请。

发明内容

为解决上述技术问题，本申请提供一种用于检测NOTCH2NLC基因5'非翻译区域(UTR)CGG重复单元数量的检测体系及试剂盒。该检测体系结合了CGG重复区全长PCR扩增，和重复引物PCR扩增两种方法。基于两种方法的检测结果，实现对CGG重复单元数量的检测，可有效、准确地确定CGG重复单元数量。因此，本申请在保证检测效果的基础上，同时保证检测上的特异性，能够更准确、灵敏、特异的检测NOTCH2NLC基因，更便于辅助临床上准确诊断NIID。

具体技术方案如下：

本申请首先提供一种用于扩增检测NOTCH2NLC基因5'非翻译区域CGG重复区域的CGG重复数的引物组合，所述的引物组合包含如下引物：

1)上/下游引物：与NOTCH2NLC基因CGG单元重复区域上下游特异性结合；

2)重复引物：与NOTCH2NLC基因5’端3-5个“CGG”重复基因以及4-7bp的重复区域边界序列互补，同时引物5’端连接通用引物序列；

3)通用引物:非人源化序列，交叉测试不干扰反应体系的扩增。

进一步的，

1)所述上/下游引物，序列如SEQ ID NO.5-13任一所示；

2)所述重复引物，序列如SEQ ID NO.15-26任一所示；

3)所述通用引物，序列如SEQ ID NO.27-28任一所示；

更进一步的，

1)所述上/下游引物为下游引物，序列如SEQ ID NO.11-13任一所示；

2)所述重复引物，序列如SEQ ID NO.18、21、25、26任一所示；

优选的，

所述1)上/下游引物为下游引物，序列如SEQ ID NO.12所示；

所述2)重复引物：序列如SEQ ID NO.18或21任一所示；更优选的，如SEQ ID NO.21所示；

所述3)通用引物：序列如SEQ ID NO.27所示；

或，

所述1)上/下游引物为下游引物，序列如SEQ ID NO.12所示；

所述2)重复引物：序列如SEQ ID NO.25或26任一所示；更优选的，如SEQ ID NO.26所示；

所述3)通用引物：序列如SEQ ID NO.28所示。

此外，进一步的，所述引物组合中，还包含位于NOTCH2NLC基因5'非翻译区域(UTR)CGG重复区域5’端的上游引物和3’端的下游引物的全长引物组合，所述全长引物组合能够特异性的与NOTCH2NLC基因CGG单元重复区域上下游进行结合，避免了与NOTCH2NLC基因高同源性的基因片段结合而产生非特异，从而导致的对结果的判读干扰和/或误判。

优选的，所述全长引物序列包括：

全长上游引物，序列如SEQ ID NO.4所示，

全长下游引物，序列如SEQ ID NO.11-13所示；

更优选的：

全长上游引物，序列如SEQ ID NO.4所示，

全长下游引物，序列如SEQ ID NO.12所示。

进一步的，所述下游引物进一步包括荧光基团修饰和/或硫代磷酸化修饰。

进一步的，所述重复引物组合物中重复引物：下游引物：通用引物的比例优选1：10：10。

本申请还提供一种扩增检测NOTCH2NLC基因5'非翻译区域CGG重复区域的CGG重复数的检测体系或试剂盒，包含上述任一所述的引物组合。

进一步的，还包含酶混合液、PCR扩增缓冲液、内标(比如QD1200内标)、无核酸酶纯水和质控品DNA。

本申请还提供一种上述引物组合在制备扩增检测NOTCH2NLC基因5'非翻译区域CGG重复区域的CGG重复数的检测体系或检测试剂盒中的应用。

进一步的，上述检测体系或检测试剂盒在扩增检测中的步骤包括：PCR扩增体系配制，PCR扩增，毛细管电泳检测，以及数据分析。

进一步的，上述PCR扩增条件如下，整个流程只需2小时左右：

进一步的，上述毛细管电泳检测时，由于产物为高GC扩增产物，在电泳检测前，需进行95度变性3-5分钟，并立刻冰浴，瞬时离心后进行检测。

更进一步的，由于本试剂盒检测NOTCH2NLC基因CGG单元重复区域所包含的序列中存在较多变异，故此，本申请开发新的计算方法，具体的，所述检测体系或检测试剂盒中对于对全长和重复计算采用公式如下：

全长体系：

重复体系：

其中，FL_size是标注的全长峰的大小，RP_size是标注的重复峰的大小，RP_1st是重复体系第一根峰的片段大小。

本申请还提供一种扩增检测NOTCH2NLC基因5'非翻译区域(UTR)CGG重复区域的CGG重复数的检测方法，包含利用上述任一所述引物组合，或上述任一所述试剂盒进行扩增检测的步骤；

进一步的，所述扩增条件如下，整个流程只需2小时左右：

进一步的，通过如下公式计算全长和重复：

全长体系：

重复体系：

其中，FL_size是标注的全长峰的大小，RP_size是标注的重复峰的大小，RP_1st是重复体系第一根峰的片段大小。

本申请的有益技术效果：

1)本申请所提供的全长扩增体系，其全长引物通过引物靶向区域选择和错配优化，能够特异性的与NOTCH2NLC基因CGG单元重复区域上下游进行结合，避免了与NOTCH2NLC基因高同源性的基因片段结合而产生非特异，从而导致的对结果的判读干扰和/或误判。

2)本申请所提供的重复引物PCR体系，其重复引物与CGG单元重复区域边界序列互补(即除重复区域之外，还包含边界序列)，在CGG重复单元区域5’端设计、重复单元选择“CGG”而非“GGC”或“GCG”等，通过这种设计方法，其与边界的结合比与内部的重复序列结合的匹配碱基更多、结合能力更强、扩增效率更高；同时，重复体系所使用的荧光引物与全长体系一样，进行了特异性的优化设计，从而保证了扩增的特异性，使得检测结果更加的准确。

3)本申请所提供的试剂盒，受上样量影响小，可用于少量样本检测，也适用于大规模高通量人群筛查。本申请检测方案还具有检测灵敏度高(全长和重复混合体系最低检出限为2.5ng)、稳定性好(不受峰高影响)、结果更准确(得益于引物和算法设计)、便于自动化以及有专业的软件分析，更易于对结果进行判读；同时，本申请在针对全长体系和重复体系双重体系情况下，检测时间仅需要2小时左右，因此还具有耗时少、检测快速的优势。

4)不同于以往现有技术，比如专利CN201910521984.0中，虽然该专利也是类似体系，但无论在全长引物特异性、重复引物设计思路、通用序列选取、还是算法上，本申请都显著优于这些现有技术。

5)本申请虽可单独根据CGG产物数量(比如TP-PCR)，或者全长产物大小也可以实现对CGG重复单元数量的检测。但作为临床检测而言都有缺陷，故此采用二者结合的方式，而基于此，本申请所述试剂盒在结果计算方面进行了优化，避免了基因变异造成的结果差异，能够更加准确的对样本进行判型。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1、NOTCH2NLC基因在CGG重复单元区域序列比对；

图2、全长体系引物组合筛选结果；

图3、重复引物序列初步设计；

图4、重复体系中荧光引物的筛选结果；

图5、重复体系中引物组合的筛选结果；

图6、最低检出限检测结果；

图7、最低检出限测试统计结果；

图8、稳定性测试的统计结果；

图9、临床样本检测结果。

具体实施方式

下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本申请而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。

除非在下文中另有定义，本申请具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本申请。

如本申请中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

本申请中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本申请描述的实施方案能以不同于本申请描述或举例说明的其它顺序实施。

下面结合具体实施例来阐述本申请。

实施例1、NOTCH2NLC基因CGG单元扩增体系全长特异性引物筛选优化

本申请是对NOTCH2NLC基因CGG单元重复数检测的一种体系组合，该体系由两部分引物组合而成：全长扩增引物组合，重复扩增引物组合。本实施例主要阐述全长体系扩增引物组合的设计筛选。

根据文献(Fiddes等2018，J Deng等2019)及NCBI数据库序列比对发现，NOTCH2NLC基因在CGG重复单元区域与多个基因存在较高的同源性(如图1)，为此，本申请在图1中位置①、②两个区域分别设计上下游检测引物，在该所述区域进行相应的引物设计。

同时，为了保证效率的同时提高特异性，本申请在这些引物的不同位置增加多处错配碱基设计，比如，在其引物序列3’端-2至-15位改动1至3个碱基或者/和在引物3’端-15位之后的序列进行改动，包括末端增加其他序列、删除部分末端序列、改变部分碱基序列。

具体的初步设计的部分引物序列如下表：

对于上述引物，可选取上游引物或下游引物进行荧光修饰，与另一条组合，进行全长体系的扩增。

根据测试结果显示，当上游引物和下游引物均未进行特异性优化时，第一组结果如图2中a所示，存在非特异性杂峰，影响对结果的判读(NLC-F1、NLC-F2、NLC-F3和NLC-R1、NLC-R2、NLC-R3的组合，结果相似)。

当上游引物或下游引物只有一个方向引物进行了特异性的优化时，第二组结果如图2中b所示，结果仍存在非特异性杂峰，相对于第一组引物组合，杂峰相对较低，但仍影响结果的判读(NLC-F1、NLC-F2、NLC-F21和NLC-R1_FAM0、NLC-R2_FAM1、NLC-R1_FAM2、NLC-R1_FAM12、NLC-R1_FAM1、NLC-R1_FAM11组合或NLC-F22和NLC-R1_FAM、NLC-R2_FAM、NLC-R3_FAM组合，结果相似)。

当上游引物和下游引物均进行特异性优化时，包括位置优化和错配碱基优化，和第一组、第二组相比，结果存在明显差异，虽然部分相对于第二组仍存在较微弱的非特异性杂峰(比如NLC-F22和NLC-R1_FAM0、NLC-R2_FAM1、NLC-R1_FAM2组合)，但组合NLC-F22和NLC-R1_FAM12、NLC-R1_FAM1或NLC-R1_FAM11的效率最佳、特异性最优，如图2中c所示。

图2中d是图1中位置①、②所示区域之外设计的引物的扩增结果(所用引物序列为：AGCGCCAGGGCCTGAGCCTTTGAAGCAG和GCCAGAGCGCCAGCAGCGCCCACAGCAG)，用于对照。该对照结果可见，若不考虑引物设计区域，则出峰情况复杂，无法明确目的峰。

实施例2、NOTCH2NLC基因CGG单元扩增体系重复引物的筛选

本申请是对NOTCH2NLC基因CGG单元重复数检测的一种体系组合，该体系由两部分引物组合而成：全长扩增引物组合，重复扩增引物组合。本实施例主要阐述重复体系扩增引物组合的设计筛选。

首先，重复引物设计时包含了CGG的边界序列，通过这种设计，其与边界的结合比与仅包含内部的GCC重复序列结合的匹配碱基更多、结合能力更强、扩增效率更高。

另外，通过分析发现，CGG重复单元区域在3’端是存在基因变异，因此，在设计重复引物时，本申请选择在CGG重复单元区域5’设计，最终确定图1中位置③区域。

具体的重复引物序列初步设计见下表或图3：

实施例1结果表明，荧光引物为NLC-R1_FAM12、NLC-R1_FAM1或NLC-R1_FAM11时效果最佳，因此，在重复体系中同样选择这3条引物与重复引物组合后进行测试(此处只展示NLC-RP-F1、NLC-RP-F11与NLC-R1_FAM12、NLC-R1_FAM1、NLC-R1_FAM11的组合测试结果，如图4)，选择对于重复体系最佳的荧光引物，综合结果显示NLC-R1_FAM1效果最佳(效率高、杂峰弱)。

针对以上设计的重复引物和通用引物与筛选的荧光引物NLC-R1_FAM1进行不同组合测试，各组合(经过测试按1：10：10比例)情况，见下表：

根据筛选、测试结果显示，如图5中组合1和2可以看出，重复引物与CGG重复序列边界互补时利于检测结果的判读，故此选择在重复引物中加入与CGG重复序列边界互补的序列；组合2和3相比，区别在于重复引物与CGG重复序列边界互补碱基数量，结果表明无明显差异，5个重复单元时，互补碱基数增加未起到改善扩增的效果；组合4、5、6相比组合1、2、3，减少1个重复单元，效果上有改善，表现为峰高较为均衡，终止峰明显，且组合6效果最佳；组合7、8、9为匹配单元重复数4个的基础上继续减少1个的引物组合，且各重复引物与CGG重复序列边界互补碱基数也存在差异，结果表明组合8效果最佳(效率、峰型均衡性、终止峰效果最佳)。根据上述结果的测试，表明组合6和组合8效果最佳。

为突出本体系重复引物中重复单元选择“CGG”的优势，又在重复单元数为3的基础上，选择“GCG”、“GGC”重复单元进行测试，结果见图5中组合10、11，虽然效果上表现为终止峰、均衡性优于部分组合，但效率明显低于其他组合，故本体系选择“CGG”重复单元进行引物设计。

另外，在组合6和组合8重复引物的基础上，改变通用引物序列，进行组合测试，结果见图5中组合12、13，通过与其他组合对比，效果相应的与组合6、8较为一致，可见，本申请设计的两条5’端通用序列均有效。

所展示结果只是部分，该基因CGG重复数引物的筛选并不是简单的上述组合，还进行了更多组合以及不同类型样本的测试验证。另外，8和13相对于6和12表现的峰更加的平缓，终止峰相对于第一根峰会更加突出，所以引物组合中，组合8、13为最佳组合。

实施例3：NOTCH2NLC基因CGG单元扩增试剂盒性能测试

将上述最有引物组合包装成试剂盒，本实施例所使用的试剂盒，包含实施例1和2所述的全长引物组合(比如NLC-F22+NLC-R1_FAM1)和重复引物组合(比如组合13)外，还包含PCR扩增缓冲液、酶混合液、无核酸酶纯水、QD1200内标以及质控品DNA。

为体现本试剂盒的性能，本实施例针对所述试剂盒进行了最低检出限和稳定性的测试。

一、最低检出限

本试剂盒在进行最低检出限测试时，选取5例样本，按照2.5ng、5ng、10ng和20ng四个浓度梯度进行样本的准备，并对各样本进行扩增检测。

其中1例样本检测结果如图6，测试结果统计如图7，本试剂盒全长/重复体系在上样模板量为2.5ng、5ng、10ng和20ng时，各样本4个浓度梯度下全长和重复体系的扩增检测结果均一致，但随着样本量的降低，各标注峰的峰高有所下降，显示试剂盒检测的效率有所降低，但均未影响结果的判读，表明本试剂盒对全长/重复扩增体系均能够检测模板量低至2.5ng的样本。

二、稳定性

为更好的展现本试剂盒的性能，本实施例还对试剂盒的检测稳定性进行了测试，选取9例样本(包括正常型和阳性)，使用本试剂盒进行扩增检测，每例样本重复扩增检测3次，对各样本3次重复结果进行统计分析，结果统计见图8。

根据统计结果可知，低重复数(<66个重复数)的样本全长和重复体系得到的重复数差异不超过±1，高重复数(≥66个重复数)的样本全长和重复体系得到的重复数差异不超过±2。

该结果表明，本试剂盒全长体系和重复体系在检测样本时具有显著的稳定性，重复体系的检测结果不受峰高影响，且全长和重复体系差异小，均能够较好的、稳定的检测样本。

实施例4：临床样本的检测

本实施例使用所述发明体系制备成的试剂盒，对临床样本直接进行扩增检测，具体以临床样本为例进行扩增检测来体现本试剂盒的使用方法和检测过程。

一、检测体系

本试剂盒除上述实施了是所述的检测引物混合液(全长引物组合(NLC-F22+NLC-R1_FAM1)和重复引物组合(组合13))外，还包括以下组分：酶混合液，PCR扩增缓冲液，内标QD1200(苏州阅微基因技术有限公司)，无核酸酶纯水和质控品DNA。

二、检测方法：

具体检测步骤如下：

1)配制PCR扩增反应体系：

每个扩增反应体系包括，引物混合物0.6μL，扩增缓冲液11.5μL，酶混合液0.3μL，待检两例临床样本(浓度均20ng/uL)DNA1μL，以无菌水补足15μL(如下表)。

2)PCR扩增：

将各反应管放入PCR扩增仪反应槽内，设置反应体系为15μL。

按以下反应程序进行PCR扩增：

3)扩增产物进行毛细血管电泳检测：

配制混有分子量内标和甲酰胺的上样混合液(0.5μL分子量内标+8.5μL甲酰胺)；分装9μL的上样混合液，加入1μL扩增产物(全长产物稀释10-40倍，重复产物稀释5-20倍)，混匀后95℃变性3分钟，冰浴3分钟。按照遗传分析仪用户使用手册步骤进行检测。检测建议设置进样时间为10秒、进样电压为3kV、运行时间为1800秒。

4)数据分析：

向GeneMapper软件中导入相关文件，包括Panel、Bin、对应的Analysis Method、QD1200内标。输入样品源数据(.fsa文件)，在相关参数选择栏中选定之前导入的文件，分析数据。

5)结果的判读：

有文献报道，NOTCH2NLC基因CGG重复单元上下游区域存在SNV，会影响扩增产物的大小，现有技术中通常采用固定计算方式，其对结果会存在一定误判。本申请结合重复体系第一根峰进行计算，较好解决了因SNV造成的产物片段大小差异计算得到的错误结果，具体的：

i)对于全长体系扩增结果，将出现的单簇峰中的最高峰记为全长扩增体系确定的全长产物峰，可分别标记为：CGG_FL1和CGG_FL2；

ii)对于重复体系扩增结果，将出现的明显凸出的簇峰中的最高峰记为重复体系对应的重复产物峰，可分别标记为：CGG_RP1和CGG_RP2；

iii)根据标记的情况，分别对全长和重复两个体系确定的片段进行重复数的计算。

本申请设计的计算公式如下：

全长体系：

重复体系：

FL_size是标注的全长峰的大小，RP_size是标注的重复峰的大小，RP_1st是重复体系第一根峰的片段大小。

本实施例检测的临床样本结果见图9，结果显示，通过上述结果的判读，可准确确定临床样本的结果分别为：22/120/141，107/135和18/49，与临床结果一致。

前述对本申请的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本申请限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本申请的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本申请的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本申请的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (6)

1.一种用于扩增检测NOTCH2NLC基因5'非翻译区域CGG重复区域的CGG重复数的引物组合，其特征在于，所述的引物组合包含如下引物：

1)上/下游引物：与NOTCH2NLC基因CGG单元重复区域上下游序列特异性结合；

2)重复引物：与NOTCH2NLC基因5’端3-5个“CGG”重复基因以及4-7bp的重复区域边界序列互补，同时引物5’端连接通用引物序列；

3)通用引物：非人源化序列，交叉测试不干扰反应体系的扩增；

所述1)上/下游引物为下游引物，序列如SEQ ID NO.12所示；

所述2)重复引物：序列如SEQ ID NO.18或21任一所示；

所述3)通用引物：序列如SEQ ID NO.27所示；

或，

所述1)上/下游引物为下游引物，序列如SEQ ID NO.12所示；

所述2)重复引物：序列如SEQ ID NO.25或26任一所示；

所述3)通用引物：序列如SEQ ID NO.28所示；

所述引物组合中，还包含位于NOTCH2NLC基因5'非翻译区域CGG重复区域5’端的上游引物和3’端的下游引物的全长引物组合，所述全长引物序列包括：

全长上游引物，序列如SEQ ID NO.4所示；

全长下游引物，序列如SEQ ID NO.12所示。

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述下游引物进一步包括荧光基团修饰和/或硫代磷酸化修饰。

3.一种扩增检测NOTCH2NLC基因5'非翻译区域CGG重复区域的CGG重复数的检测体系或试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-2任一所述的引物组合。

4.权利要求3所述的检测体系或试剂盒，其特征在于，还包含酶混合液、PCR扩增缓冲液、内标、无核酸酶纯水和质控品DNA。

5.权利要求1-2任一所述引物组合在制备扩增检测NOTCH2NLC基因5'非翻译区域CGG重复区域的CGG重复数的检测体系或检测试剂盒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测体系或检测试剂盒中结果计算采用公式如下：

全长体系：

重复体系：

其中，FL_size是标注的全长峰的大小，RP_size是标注的重复峰的大小，RP_1st是重复体系第一根峰的片段大小。

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