CN113943794B - 一种tcf4基因ctg重复数的检测体系及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于定性检测Fuchs角膜内皮营养不良高风险相关TCF4基因CTG单元重复数的检测体系及其试剂盒。该检测体系包含经优化的位于TCF4基因CTG单元重复区域上、下游和重复片段边界的3条引物，由于位于重复片段边界的引物与所对应模板结合能力更强，可更明确地判定最大CTG产物。该试剂盒能够根据检测得到的全长产物大小和CTG产物片段大小的结果对CTG重复单元数量作出准确的判断，从而准确、快速的鉴定出Fuchs角膜内皮营养不良高风险。

Description

一种TCF4基因CTG重复数的检测体系及检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学领域中的临床分子检测技术，具体涉及一种对Fuchs角膜内皮营养不良相关TCF4基因CTG单元重复数量检测的体系和试剂盒。
背景技术
Fuchs角膜内皮营养不良(Fuchs endothelial corneal dystrophy，FECD)，是一种最常见的常染色体显性基因遗传性角膜营养不良。许多滴状角膜患者，角膜其他方面表现正常且不影响视力。少数患者发生角膜基质和上皮水肿，可引起视力显著减退。Fuchs于1910年首先描述这一临床现象，随后认识到它与原发性角膜内皮营养不良有关，角膜上皮和基质的改变为继发的。
Fuchs角膜内皮营养不良是角膜移植最主要的原因。在美国和欧洲，该疾病在四十岁以上人群中的患病率估计为4-5％，而FECD在日本、沙特阿拉伯和新加坡华人中被认为不常见。通过镜下观察发现，白种人(11.2％)的滴状角膜患病率高于东亚人(5.5％)，女性(5.5％-11％)高于男性(1.5％-7％)。在几个不同的种族人口中，女性受影响的频率是男性的三倍，同时也患有更严重的疾病。角膜移植是目前治疗晚期FECD的唯一方法，2018年美国原发性角膜移植病例中FECD占39％。
Fuchs角膜内皮营养不良(FECD)是老年人遗传性视力丧失的常见原因。自从第一个描述与位于转录因子4(TCF4)基因内的常见多态性之间的关联以来，遗传和分子研究就已将内含CTG三核苷酸重复序列(CTG18.1)扩展作为大多数FECD患者的因果变异体。且CTG18.1重复序列长度和FECD之间的关联现在已经在多种族群体中得到了证实。
Soliman等人研究表明，FECD的严重程度与TCF4中CTG重复单元的数量相关，CTG重复扩增的患者表现出更严重的FECD形式。CTG重复数目小于或等于37为正常，在37-52之间表明与Fuchs角膜内皮营养不良相关，超过52为Fuchs角膜内皮营养不良高风险。但这种表型的机制尚不清楚。迄今为止，已经提出了几种驱动和/或加剧疾病发作的非互斥机制。这些机制包括(i)TCF4失调；(ii)TCF4的毒性功能获得含重复序列的RNA；(iii)重复相关的非AUG依赖(RAN)翻译带来的有毒功能获得；(iv)CTG18.1的体细胞不稳定性。
不同种族群体的妇女幼童发病率和流行率差异很大，随年龄其发生率显著增加。因此，对于不同年龄阶段人群(包括婴儿、儿童、青少年、年轻人或中老年)均可进行该检测，从而确定是否为Fuchs角膜内皮营养不良高风险。鉴定出的Fuchs角膜内皮营养不良高风险者可提早与医生选择眼睛治疗方案，减少错误操作。
目前，Southern印迹是检测基因CTG/CCG等重复单元数量的传统方法。但该方法主要局限在于，无法准确判断具体CTG重复数、操作不当易产生假阴性结果、操作繁琐不适于临床大规模检测。
重复引物PCR(repeat-primed PCR，RP PCR)是较为有效和得到认可的方法。该方法在体系中引入与重复序列互补的重复引物，并与下游反向引物共同进行PCR扩增。由于重复引物可与重复片段上的各个位置结合，所以会产生不同大小的一系列产物。在重复数较少时，根据产物大小和数量即可推算出重复数量；但在重复较多时，大片段产物无法有效扩增，对应效果不显著。
有鉴于此，提出本发明。
发明内容
本发明提供一种用于检测Fuchs角膜内皮营养不良致病基因TCF4三号内含子的CTG重复扩增数量的试剂盒，从而确定是否为Fuchs角膜内皮营养不良高风险。
本发明的目的是提供一种用于检测Fuchs角膜内皮营养不良致病基因TCF4三号内含子的CTG重复扩增数量的检测体系。
为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种用于扩增TCF4基因内含子3中的CTG三核苷酸重复区的引物组合，所述的引物组合包含如下引物：
1)上/下游引物：如SEQ ID NO.1-2任一所示；
2)重复引物：如SEQ ID NO.4-6、8-10任一所示；
3)通用引物：如SEQ ID NO.3或7任一所示；
优选的，所述2)重复引物是如SEQ ID NO.4-5、8-9任一所示；
更优选的：
所述1)上/下游引物：如SEQ ID NO.2所示；
所述2)重复引物：如SEQ ID NO.9所示；
所述3)通用引物：如SEQ ID NO.7所示。
进一步的，所述重复引物通过与重复序列边界GAG互补，与模板结合更优，通过该种设计方法，其与边界的结合比与内部的重复序列结合的匹配碱基更多、结合能力更强、扩增效率更高。还能够排除扩增滑脱等导致的干扰，提高有效扩增更大的重复数产物的能力，由此更易于确定最大重复数对应的重复产物，避免模糊不清、无法判断扩增终止峰。
进一步的，所述下游引物、重复引物和通用引物的浓度比为1-15：1：1-15；优选的，浓度比为5：1：5。
进一步的，所述下游引物进一步包括荧光基团修饰、磷酸化修饰、硫代磷酸化修饰、锁核酸修饰或肽核酸修饰。
本发明还提供一种检测TCF4基因CTG单元重复数的检测体系或试剂盒，包含上述的引物组合。
进一步的，所述检测体系或试剂盒进一步包括：全长上游引物和全长下游引物，所述全长上游引物如SEQ ID NO.1所示，所述全长下游引物如SEQ ID NO.2所示；
虽然本发明上述引物体系已经能够很好的检测出CTG重复扩增数量，但作为更进一步的，体系中还可以包括上述全长上游引物和全长下游引物，其用于全长扩增，进一步提高检测结果准确性。
优选的，所述全长上游引物和全长长下游引物浓度比为1:1。
进一步的，上述检测体系或试剂盒还包含终浓度1.0％的DMSO和终浓度1.5M的甜菜碱。
进一步的，上述检测体系或试剂盒，还包含Taq酶、扩增缓冲液、内标ROX500、无核酸酶纯水和质控品DNA。
本发明还提供上述引物组合在制备检测TCF4基因CTG单元重复数的检测试剂盒中的应用，或在检测TCF4基因CTG单元重复数的应用。
本发明还提供一种TCF4基因CTG单元重复数的检测方法，包含利用上述引物组合，或上述试剂盒进行扩增检测的步骤。
本发明的有益技术效果：
1)本发明所提供的重复引物PCR，其重复引物与CTG边界序列互补，通过该种设计方法，其与边界的结合比与内部的重复序列结合的匹配碱基更多、结合能力更强、扩增效率更高。
2)本发明通过边界序列互补的重复引物设计，能够有效排除扩增滑脱等导致的干扰，提高有效扩增更大的重复数产物的能力，由此更易于确定最大重复数对应的重复产物，避免模糊不清、无法判断扩增终止峰。相对于现有类似方法，比如现有专利CN110964722A，因为其并不具有边界互补序列，因此其检测结果只能通过全长体系进行判断，而重复体系只能用作对照。本发明的检测体系则简单且更准确可靠。
3)单独根据CTG产物数量(比如RP PCR)，或者全长产物大小和数量也可以实现对CTG重复单元数量的检测，但作为临床检测而言都有缺陷。而本发明方法可综合两项结果对CTG重复单元数量进行判定，除避免了上述缺陷，还增加了检测可靠性，并且能够排除因杂峰而影响对嵌合样本的结果判断。本发明包含RP-PCR，并在重复引物3’端等位置加上与特定模板序列匹配的碱基，并优化PCR体系和扩增条件，能够极大的改善常规的RP-PCR的问题，对Fuchs角膜内皮营养不良TCF4基因CTG重复单元数量进行检测。
4)本发明所提供试剂盒可有效、准确地确定TCF4基因CTG重复单元数量，从而判定样本的重复数量属于正常、有风险还是高风险范围。
5)TCF4基因CTG单元重复数检测中，该基因重复单元区域为高GC区域，对于体系的要求较高，需要特殊的扩增体系进行扩增。本发明通过体系优化设计克服这些问题。本发明所提供试剂盒可用于少量样本检测，也适用于大规模高通量人群筛选。此外，本发明检测方案还具有检测灵敏度高、检测分辨率高、通量高、简单易于操作、便于自动化以及有专业的软件对结果进行判读等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：扩增体系引物设计原理示意图(A：全长引物设计原理图，B：重复引物设计原理1图，C：重复引物设计原理2图)；
图2：重复扩增体系引物组合筛选结果(A：第一组引物；B：第二组引物；C：第三组引物；D：第四组引物；E：第五组引物；F：第六组引物；G：第七组引物；H：第八组引物；I：第九组引物；J：第十组引物)；
图3：重复体系引物组合比例优化测试结果(A引物比例为1：1：1；B引物比例为5：1：5；C引物比例为10：1：10；D引物比例为15：1：15)；
图4：PCR扩增缓冲液添加剂测试结果(A：组合1；B：组合2；C：组合3；D：组合4)；
图5：重复数为25/38的临床样本的扩增检测结果(上：全长扩增体系结果；下：重复扩增体系结果)。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
下面结合具体实施例来阐述本发明。
实施例1：TCF4基因CTG单元扩增体系检测引物的设计
本发明是对TCF4基因CTG单元重复数检测的一种体系组合，该基因重复单元区域为高GC区域，对于体系的要求较高，需要特殊的扩增体系进行扩增。
对于TCF4基因CTG单元重复区域进行检测引物的设计，本实施例设计该检测由两部分引物组合而成：全长扩增引物组合，重复扩增引物组合，设计的具体原理参见图1(A：全长引物设计原理图，B、C：重复引物设计原理图)。
实施例2：TCF4基因CTG单元重复数检测体系引物组合的筛选
根据实施例1全长引物设计原理图A，进行全长扩增引物的设计，全长扩增引物序列如下：
上游引物TCF4-F1：ATGCCAGATGAGTTTGGTGTAAGATGC(SEQ ID NO.1)；
下游引物TCF4-R1：GCCATTTCTCCAAAAGAAGGTCTAGAAG(SEQ ID NO.2)；
所述两条引物，可各取其中一条进行荧光修饰，与另一条组合，进行全长体系的扩增。
根据实施例1重复引物设计原理图B，进行重复扩增引物的设计，重复扩增体系所使用引物是由多条引物组合而成的混合物，所包含的引物各自序列如下：
TCF4-T1 GTTTCGGCGTTACGAGTGGATTC(SEQ ID NO.3)
TCF4-RP1 GTTTCGGCGTTACGAGTGGATTCATGCTGCTGCTGCTGCTG(SEQ ID NO.4)
TCF4-RP2 GTTTCGGCGTTACGAGTGGATTCATGCTGCTGCTGCTG(SEQ ID NO.5)
TCF4-RP3 GTTTCGGCGTTACGAGTGGATTCATGCTGCTGCTG(SEQ ID NO.6)
TCF4-T2 GTTTCGGCGTTACGAGTGGATTGAG(SEQ ID NO.7)
TCF4-FP1 GTTTCGGCGTTACGAGTGGATTGAGGAGCAGCAGCAGCAGCAG(SEQ ID NO.8)
TCF4-FP2 GTTTCGGCGTTACGAGTGGATTGAGGAGCAGCAGCAGCAG(SEQ ID NO.9)
TCF4-FP3 GTTTCGGCGTTACGAGTGGATTGAGGAGCAGCAGCAG(SEQ ID NO.10)
如上所述，可取其中的两条引物与相应的全长所述的荧光标记引物进行搭配，组成重复扩增引物混合物(共可组合成4组，第一组：TCF4-F1+TCF4-RP1+TCF4-T1；第二组：TCF4-F1+TCF4-RP2+TCF4-T1；第三组：TCF4-F1+TCF4-RP3+TCF4-T1；第四组：TCF4-R1+TCF4-FP1+TCF4-T2；第五组：TCF4-R1+TCF4-FP2+TCF4-T2；第六组：TCF4-R1+TCF4-FP3+TCF4-T2，进行重复体系的扩增。
根据实施例1重复引物设计原理图C，进行重复扩增引物的设计，重复扩增体系所使用引物是由多条引物组合而成的混合物，所包含的引物各自序列如下：
Figure BDA0003338112160000061
Figure BDA0003338112160000071
如上所述，同样可取其中的一条引物与相应的全长所述的荧光引物进行搭配，组成重复扩增引物混合物(共可组成4组，依次编号，第七组：TCF4-R1+TCF4-RP-F1；第八组：TCF4-R1+TCF4-RP-F2；第九组：TCF4-F1+TCF4-RP-R1；第十组：TCF4-F1+TCF4-RP-R2)。
本实验拟获得的最理想结果为：1)小片段峰无优势扩增，趋势较为平缓；2)大片段峰扩增出峰平缓，终止峰优势扩增，且加尾峰效果明显。根据重复引物组合的测试结果显示，如图2所示，几组结果差异显著：具体的，第一组和第四组结果均表现出小片段优势扩增；第二组和第四组结果均表现出小片段、大片段均平缓扩增，且终止峰优势扩增，加尾效果显著，但经过对比第五组(终止峰/第一个峰峰高比值＝0.8124)优于第二组(终止峰/第一个峰峰高比值＝0.3208)，而第三组、第六组、第七组、第八组、第九组以及第十组则都无法很好的检测样本的重复数，且出峰劈叉严重，与理想结果相差极大。综上，第二组和第五组明显优于其他组合，而第五组又优于第二组，效果上超出试验初期的预期。
上述结果可以看出，本发明的整个扩增效果是与重复引物重复碱基数、T1序列、以及全长引物序列都密切相关，比如，重复碱基数的差别，即可导致体系的检测效果。
本发明获得第五组：TCF4-R1+TCF4-FP2+TCF4-T2引物组合(对应序列SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.7)为最佳引物组合，故在此以该引物组合作为TCF4基因CTG重复单元重复扩增体系的检测引物。不过第一组、第二组和第四组引物组合仍可用于重复扩增体系的检测，未完全视为不可用，仅表现在效果上不及第五组。
实施例3：TCF4基因CTG重复数检测体系的优化
本实施例对检测TCF4基因CTG重复数检测体系进行了优化，优化包括重复引物组合中各引物比例的优化(全长引物组合引物比例为1：1，无需优化)以及扩增缓冲液的优化。
如上所述，该体系包含引物组合为实施例2最终优化筛选得到的引物组，其中全长体系引物按等比例浓度进行混合，而重复体系引物组合按照以下比例进行测试(荧光引物TCF4-R1：重复引物TCF4-FP2：通用引物TCF4-T2)：1：1：1，5：1：5，10：1：10，15：1：15。
根据重复体系引物组合比例优化测试结果显示(如图3)，A、B、C、D中均能够很好的检测样本的重复峰，且终止峰1均超过了仪器的检测阈值(32000rfu)，但是通过对比发现当引物比例为5：1：5时扩增的效果最佳(CTG重复峰的趋势更佳平缓)，另外，终止峰2的峰高：第一个峰峰高的比值分别为0.43、1.20、0.82、0.71，该结果表面当引物比例为5：1：5，片段长度达到300bp以上时，终止峰的效果最佳，故此，优选的，最终确定的重复体系引物组合比例为5：1：5。
本发明所述体系中除上述引物组合外，还包含Taq酶、PCR扩增缓冲液，其中PCR扩增缓冲液中包含dATP、dTTP、dCTP、dGTP，以及Mg2+等成分。
所述PCR扩增缓冲液还包含了，各种添加剂，并针对添加剂(如DMSO、7-deaze-dGTP、甲酰胺、甜菜碱等)及浓度进行了筛选优化，根据测试结果显示(如图4)，组合1(1.0％DMSO，1.1M甜菜碱)扩增效率低，重复峰出峰效果差，终止峰效果不明显；组合3(1.0％DMSO，1.7M甜菜碱)重复体系扩增峰型效果佳，但整体效率低外，且全长有杂峰；组合4(1.0％DMSO，1.9M甜菜碱)扩增效率最低，且终止峰2效果也不佳；组合2(1.0％DMSO，1.5M甜菜碱)的效果最佳，能够正常扩增全长和重复，故扩增缓冲液中使用终浓度为1.0％DMSO和1.5M甜菜碱的组合。
实施例4：试剂盒进行临床样本的检测
本实施例采用本发明体系制备成试剂盒，对临床样本直接进行扩增检测，具体以临床样本为例进行扩增检测，以此来体现本试剂盒的使用方法和检测过程。
一、检测体系
本试剂盒除上述实施了是所述的检测引物混合液(全长体系引物：TCF4-F1+TCF4-R1；重复体系引物：TCF4-R1+TCF4-FP2+TCF4-T2)外，还包括以下组分：Taq酶，PCR扩增缓冲液，包含dNTPs、Mg2+、DMSO、甜菜碱等，以及内标ROX500(苏州阅微基因技术有限公司)，无核酸酶纯水和质控品DNA。
二、检测方法：
具体检测步骤如下：
1)配制PCR扩增反应体系：
每个扩增反应体系包括，引物混合物0.8ul，扩增缓冲液12ul，酶混合液0.4ul，待检样本DNA 1ul，以无菌水补足20ul(如下表)。
Figure BDA0003338112160000081
Figure BDA0003338112160000091
2)PCR扩增：
将各反应管放入PCR扩增仪反应槽内，设置反应体系为20μL。
按以下反应程序进行PCR扩增：
Figure BDA0003338112160000092
3)扩增产物进行毛细血管电泳检测：
配制混有分子量内标和甲酰胺的上样混合液(0.5ul分子量内标+8.5ul甲酰胺)；分装9ul的上样混合液，加入1ul扩增产物(全长产物稀释10-40倍，重复产物稀释5-20倍)，混匀后95℃变性3分钟，冰浴3分钟。按照遗传分析仪用户使用手册步骤进行检测。检测建议设置进样时间为10秒、进样电压为3kV、运行时间为1800秒。
4)数据分析：
向GeneMapper软件中导入相关文件，包括Panel、Bin、对应的Analysis Method、ROX500内标。输入样品源数据(.fsa文件)，在相关参数选择栏中选定之前导入的文件，分析数据。
5)结果的判读：(结果如图5)
i)对于全长体系扩增结果，将出现的单簇峰中的最高峰记为全长扩增体系确定的全长产物峰，可分别标记为：CTGFL1和CTGFL2；
ii)对于重复体系扩增结果，将出现的明显凸出的簇峰中的最高峰记为重复体系对应的重复产物峰，可分别标记为：CTGRP1和CTGRP2；
iii)根据标记的情况，分别对全长和重复两个体系确定的片段进行重复数的判定。
结果显示，全长扩增体系的毛细管电泳检测结果为244.98bp和284.80bp，经计算公式(全长确定的重复数
Figure BDA0003338112160000093
其中FLsize为全长体系扩增结果确定的全长产物峰对应的片段大小，RP1st为重复扩增体系扩增结果中第一个峰对应的片段大小)计算得到全长扩增体系确定的重复数为25/38；重复扩增体系的毛细管电泳检测结果为206.62bp和245.85bp，经过对重复数的计数，得到重复体系确定的重复数为25/38；综合二者的结果，得到该样本最终的TCF4基因CTG重复数为25/38。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 北京阅微基因技术股份有限公司
<120> 一种TCF4基因CTG重复数的检测体系及检测试剂盒
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgccagatg agtttggtgt aagatgc 27
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccatttctc caaaagaagg tctagaag 28
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtttcggcgt tacgagtgga ttc 23
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtttcggcgt tacgagtgga ttcatgctgc tgctgctgct g 41
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtttcggcgt tacgagtgga ttcatgctgc tgctgctg 38
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtttcggcgt tacgagtgga ttcatgctgc tgctg 35
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtttcggcgt tacgagtgga ttgag 25
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtttcggcgt tacgagtgga ttgaggagca gcagcagcag cag 43
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtttcggcgt tacgagtgga ttgaggagca gcagcagcag 40
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtttcggcgt tacgagtgga ttgaggagca gcagcag 37
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgctgctgc tgctgctg 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcatgctgct gctgctgctg 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gagcagcagc agcagcag 18
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aggagcagca gcagcagcag 20

Claims (7)

1.一种用于扩增TCF4基因内含子3中的CTG三核苷酸重复区的引物组合，其特征在于，所述的引物组合包含如下引物：
1）下游引物：如SEQ ID NO.2所示；
2）重复引物：如SEQ ID NO.9所示；
3）通用引物：如SEQ ID NO.7所示；
所述下游引物、重复引物和通用引物的浓度比为5：1：5。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述下游引物进一步包括荧光基团修饰、磷酸化修饰、硫代磷酸化修饰、锁核酸修饰或肽核酸修饰。
3.一种检测TCF4基因CTG单元重复数的检测体系或试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-2任一所述的引物组合。
4.根据权利要求3所述的检测体系或试剂盒，其特征在于，所述检测体系或试剂盒进一步包括：全长上游引物和全长下游引物，所述全长上游引物如SEQ ID NO.1所示，所述全长下游引物也如SEQ ID NO.2所示；所述全长上游引物和全长下游引物浓度比为1:1。
5.根据权利要求3-4任一所述检测体系或试剂盒，其特征在于，还包含终浓度1.0%的DMSO和终浓度1.5M的甜菜碱。
6.权利要求5所述的检测体系或试剂盒，其特征在于，还包含Taq酶、扩增缓冲液、内标ROX500、无核酸酶纯水和质控品DNA。
7.权利要求1-2任一所述引物组合在制备检测TCF4基因CTG单元重复数的检测试剂盒中的应用。
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