CN118028458A - 检测pdgfb基因多态性位点的引物组合物、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物、试剂盒及检测方法，该引物组合物包括组分A、组分B、组分C、组分D、组分E、组分F、组分G中的至少一种；组分A包括SEQ ID NO:1～3；组分B包括SEQ ID NO:4～6；组分C包括SEQ ID NO:7～9；组分D包括SEQ ID NO:10～12；组分E包括SEQ ID NO:10～11和SEQ ID NO:13；组分F包括SEQ ID NO:10～11和SEQ ID NO:14；所述组分G包括SEQ ID NO:15～17。本发明检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物可以显著提高分型检测效率、降低样本用量，并且准确性高。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物、试剂盒及检测方法。
背景技术
原发性家族性脑钙化(PFBC)是一组以双侧对称性基底节区钙化，累及小脑或其他脑区为特征的神经系统遗传性疾病，具有高度的遗传异质性和临床异质性。临床表现多样且复杂，可终身无症状，也可发病于不同年龄段，患者具备病情严重程度不一、临床症状各不相同的神经和精神特征，可出现头痛、痴呆、记忆力减退、癫痫及精神错乱和情感障碍等症状。但是患者的血清生化指标，如血磷、血钙及碱性磷酸酶(ALP)、甲状旁腺激素(PTH)等均正常，因此早期难以发现，易造成漏诊及误诊。
目前，已有4种不同基因的突变被确定为PFBC的病因，分别为：SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1。这4个基因的不同突变均表现为功能丧失，SLC20A2基因突变导致Pi的积累，从而导致磷酸钙沉积；PDGFB和PDGFRB基因的突变引起也周细胞对内皮细胞的招募受损，导致血脑屏障功能障碍，从而通过间接过程导致脑钙化；XPR1基因的突变引起无机磷的输出功能受损，细胞内无机磷水平上升，从而导致细胞内的钙和无机磷的沉积。
据以往报道，已明确致病基因的原发性家族性脑钙化(PFBC)患者，临床症状的外显率仅为61％，影像学的外显率可高达100％。即便如此，影像学表现仍然缺乏特异性，此类影像学表现(侧基底节区钙化，伴或不伴其他脑区受累)也可常见于正常的老龄化过程或者其他病因(如自身免疫性、代谢性)引发的脑内非特异性钙化。因此，准确区分生理性或病理性钙化以及排查其他可能的病因对该疾病诊断至关重要。
随着对原发性家族性脑钙化(PFBC)研究的逐渐深入，致病基因及病理机制也在不断被发掘，然而目前市面上尚未有相关基因检测方法的试剂盒。因此，提供一种PFBC关联基因多态性位点的检测方法，辅助提高原发性家族性脑钙化(PFBC)的早期发现概率是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物、试剂盒及检测方法。
本发明提供一种检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物，所述引物组合物包括组分A、组分B、组分C、组分D、组分E、组分F、组分G中的至少一种；
所述组分A包括SEQ ID NO:1所示的上游引物、SEQ ID NO:2所示的下游引物和SEQID NO:3所示的单碱基延伸引物；
所述组分B包括SEQ ID NO:4所示的上游引物、SEQ ID NO:5所示的下游引物和SEQID NO:6所示的单碱基延伸引物；
所述组分C包括SEQ ID NO:7所示的上游引物、SEQ ID NO:8所示的下游引物和SEQID NO:9所示的单碱基延伸引物；
所述组分D包括SEQ ID NO:10所示的上游引物、SEQ ID NO:11所示的下游引物和SEQ ID NO:12所示的单碱基延伸引物；
所述组分E包括SEQ ID NO:10所示的上游引物、SEQ ID NO:11所示的下游引物和SEQ ID NO:13所示的单碱基延伸引物；
所述组分F包括SEQ ID NO:10所示的上游引物、SEQ ID NO:11所示的下游引物和SEQ ID NO:14所示的单碱基延伸引物；
所述组分G包括SEQ ID NO:15所示的上游引物、SEQ ID NO:16所示的下游引物和SEQ ID NO:17所示的单碱基延伸引物。
本发明利用PCR扩增引物和单碱基延伸引物，通过能够特异性扩增包含SNP位点区域的目标基因片段的引物和DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR结束后加入碱性磷酸酶消化处理，去除反应液中的dNTP。之后，在反应液中加入SNP位点特异的延伸引物及ddNTP等相关组分并进行单碱基延伸反应，反应过程中，SNP位点特异的延伸引物能够与待测的SNP位点的5’端进行特异结合并根据碱基互补配对原则延伸出与目标SNP基因型互补的碱基，根据不同的基因型的DNA模板可得到不同的延伸产物。不同碱基的分子量不同，根据延伸产物的分子量能够确定所分析SNP位点的基因型。本发明提供的检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物可以显著提高分型检测效率、降低样本用量，并且准确性高。
本发明提供的检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物具有高灵敏度、高特异性和高精密度，能够直接分辨16dalton(道尔顿)的差异，不引入荧光等标记物所带来的偏差，信号偏差显著低于定量PCR，保证了PCR反应的准确性和重复性，一台质谱仪每次可以检测384*2个样本，检测所需的样本量少(可以检测出浓度为5ng/μL的样本)，适合技术推广和应用。利用本发明的引物组合物可以实现对PDGFB基因的7个SNP位点进行准确的基因分型的目的。
优选地，所述引物组合物包括组分A、组分B、组分C、组分D、组分E、组分F、组分G中的至少两种。
优选地，所述引物组合物包括组分A、组分B、组分C、组分D、组分E、组分F和组分G。
本方案提供的检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物能同时检测PDGFB基因的7个突变基因位点(c.3G>A、c.26T>G、c.356T>C、c.433C>T、c.439C>T、c.445C>T、c.726G>C)，在一管反应体系中能同时检测7个位点(高通量)，一个标本只需进行一次核酸提取和同时进行单管PCR扩增和单碱基延伸，在核酸质谱仪上就能得出7个位点的基因型，实现了反应检测SNP位点较多，反应操作简便的目的，通过采用本方案的最佳引物组合物，引物之间互不干扰，同时扩增多个突变位点，涵盖范围更广泛，还具有较高的准确性、灵敏度和重复性，对于检测PDGFB基因多态性位点具有重要的指导和研究价值。本发明提供的引物组合物实现整个扩增和多态性位点的检测在同一反应体系中完成，减少外界因素对结果的干扰，可以提高检测的准确度，并且可以降低因检测位点不全导致的误检风险，更好地满足PDGFB基因多态性位点检测的需要。
本发明提供一种检测PDGFB基因多态性位点的试剂盒，所述试剂盒包括所述检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应试剂、SAP反应试剂、单碱基延伸反应试剂中的至少一种。
优选地，所述PCR反应试剂包括PCR缓冲液、PCR酶中的至少一种。
优选地，所述SAP反应试剂包括SAP缓冲液和SAP酶中的至少一种。
优选地，所述单碱基延伸反应试剂包括延伸缓冲液、延伸终止液、延伸酶中的至少一种。
优选地，所述试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品中的至少一种。
优选地，所述阳性质控品包括含c.3G>A杂合突变型质粒、c.26T>G杂合突变型质粒、c.356T>C杂合突变型质粒、c.433C>T杂合突变型质粒、c.439C>T杂合突变型质粒、c.445C>T杂合突变型质粒、c.726G>C杂合突变型质粒共七种质粒的混合物。
优选地，所述阴性质控品包括生理盐水。
优选地，所述检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物的浓度为0.1μM～0.2μM。
本发明还提供一种以非诊断目的检测PDGFB基因多态性位点的方法，包括如下步骤：
S1.使用所述试剂盒中的所述上游引物和所述下游引物对待测样本进行PCR扩增反应，得到扩增产物；
S2.将步骤S1得到的扩增产物进行去磷酸化处理，得到去磷酸化产物；
S3.使用所述试剂盒中的所述单碱基延伸引物对步骤S2得到的去磷酸化产物进行单碱基延伸，得到延伸产物；
S4.将步骤S3得到的延伸产物进行脱盐纯化，得到纯化产物；
S5.对纯化产物进行质谱检测。
附图说明
图1为实施例1检测各位点的质谱图。
图2为实施例1检测PDGFB:c.3G>A的质谱图。
图3为实施例1检测PDGFB:c.26T>G的质谱图。
图4为实施例1检测PDGFB:c.356T>C的质谱图。
图5为实施例1检测PDGFB:c.433C>T的质谱图。
图6为实施例1检测PDGFB:c.439C>T的质谱图。
图7为实施例1检测PDGFB:c.445C>T的质谱图。
图8为实施例1检测PDGFB:c.726G>C的质谱图。
图9为实施例2检测各位点的质谱图。
图10为对比例1检测各位点的质谱图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
引物组合物设计
根据PDGFB基因多态性位点——c.3G>A、c.26T>G、c.356T>C、c.433C>T、c.439C>T、c.445C>T、c.726G>C设计扩增引物(上游引物和下游引物)和单碱基延伸引物，从设计的若干种引物中特定选择如下表1所示的扩增引物和单碱基延伸引物。
表1扩增引物和延伸引物序列表
PCR反应、SAP反应、单碱基延伸反应结合飞行时间质谱(MALD1-TOF-MS)的检测
1、样本准备
使用圣湘生物科技股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂对全血样本进行核酸提取。提取的DNA立即进行检测，或于-20℃±5℃冻存，保存时间不超过1年。
以下使用到的PCR反应试剂、SAP反应试剂和单碱基延伸反应试剂均来自购买于杭州聚致生物科技有限公司生产核酸纯化试剂(浙杭械备20220893号)，该核酸纯化试剂包括PCR酶、PCR缓冲液、SAP酶、SAP缓冲液、延伸酶、延伸缓冲液、延伸终止液。
2、多重PCR反应试剂准备
根据下表2制备得到多重PCR反应试剂，按4μL分装到PCR反应管中，转移至样本处理区。
表2多重PCR反应试剂
3、上样
向多重PCR反应试剂中加入1μL浓度为20ng/μL的全血DNA溶液样本，盖紧反应管，离心(设置为4000rpm离心5秒)后，将得到的PCR反应管上机。
4、PCR扩增反应
将PCR反应管放入扩增仪样本槽中，循环参数设定如下表3所示，得到PCR扩增产物。
表3
5、SAP反应试剂配制
根据下表4制备得到SAP反应试剂。
表4SAP反应试剂
6、SAP反应(碱性磷酸酶消化)
向上述步骤中的PCR扩增产物中加入2μL的上述配制的SAP反应试剂，盖紧反应管，离心(设置为4000rpm离心5秒)后上机。PCR仪开机后，将各反应管按一定顺序放入PCR仪上，按以下表5的程序进行SAP反应程序，得到SAP反应产物：
表5SAP反应程序
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 1 | 37℃ | 40min | 1 |
| 2 | 85℃ | 5min | 1 |
| 3 | 4℃ | ∞ | / |
7、单碱基延伸反应试剂的配制
根据下表6制备得到单碱基延伸反应试剂。
表6单碱基延伸反应试剂
8、单碱基延伸反应
SAP反应结束后，按照上表6配制单碱基延伸反应试剂，按照每个反应体系(2μL单碱基延伸反应试剂加入7μL SAP反应产物反应管中)，离心(设置为4000rpm离心5秒)后上机。将反应管放入PCR仪上按以下表7的程序进行延伸扩增。
表7单碱基延伸反应程序
9、质谱检测
单碱基延伸反应结束后，2000rpm离心5s，将单碱基延伸反应产物全部转移到96/384孔PCR板上，其中每一个有样本的孔里加入16μL纯化水后离心(设置为4000rpm离心5秒)，将96/384孔PCR板转移至飞行时间质谱检测系统上机实验。
10、结果判断
根据单碱基延伸引物及引物延伸后分子量大小，判读目标位点上为何种基因型，判断原则为：SNR(信噪比)≥3，峰值≥2，各目标片段重量间隔至少16道尔顿以上，且信号不至于过饱和，各靶标间信号相对持平，且没有宽峰、双峰的现象。按照下表8进行突变位点判型。若只在野生型分子量位置起峰，则为野生型；若只在纯合突变分子量位置起峰，则为纯合突变；若两个位置均起峰，则为杂合突变。
表8
| 突变位点 | 野生型 | 分子量 | 纯合突变 | 分子量 | 杂合突变 |
| c.3G>A | G | 5186.4 | A | 5170.4 | GA |
| c.26T>G | A | 5877.84 | C | 5853.84 | AC |
| c.356T>C | T | 4770.1 | C | 4690.1 | TC |
| c.433C>T | G | 5460.14 | A | 5444.14 | GA |
| c.439C>T | G | 6101.04 | A | 6085.04 | GA |
| c.445C>T | C | 7218.84 | T | 7298.84 | CT |
| c.726G>C | G | 4801.2 | C | 4841.2 | GC |
图1为实施例1检测各位点的质谱图，其中，A为：c.3G>A；B为：c.26T>G；C为：c.356T>C；D为：c.433C>T；E为：c.439C>T；F为：c.445C>T；G为c.726G>C。图2～8是图1的截取图，分解为PDGFB:c.3G>A、PDGFB:c.26T>G、PDGFB:c.356T>C、PDGFB:c.433C>T、PDGFB:c.439C>T、PDGFB:c.445C>T和PDGFB:c.726G>C对应的质谱图。由图1～8可知，本实施例1的检测原发性家族性脑钙化PDGFB基因多态性位点的引物组合物结合飞行时间质谱检测可以检测出全部突变位点(c.3G>A、c.26T>G、c.356T>C、c.433C>T、c.439C>T、c.445C>T和c.726G>C)，峰值高且特异，SNR值大于3。在24次平行实验中，全部PDGFB基因多态性位点(c.3G>A、c.26T>G、c.356T>C、c.433C>T、c.439C>T、c.445C>T和c.726G>C)均检出，准确度为100％，结果如表9所示。
表9
| SNP ID | 准确度 |
| PDGFB:c.3G>A | 100％(24/24) |
| PDGFB:c.26T>G | 100％(24/24) |
| PDGFB:c.356T>C | 100％(24/24) |
| PDGFB:c.433C>T | 100％(24/24) |
| PDGFB:c.439C>T | 100％(24/24) |
| PDGFB:c.445C>T | 100％(24/24) |
| PDGFB:c.726G>C | 100％(24/24) |
实施例2
原发性家族性脑钙化PDGFB基因多态性位点(c.3G>A、c.26T>G、c.356T>C、c.433C>T、c.439C>T、c.445C>T和c.726G>C)的飞行时间质谱检测体系灵敏度验证：
利用实施例1所提供的检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物对原发性家族性脑钙化PDGFB基因多态性位点(c.3G>A、c.26T>G、c.356T>C、c.433C>T、c.439C>T、c.445C>T和c.726G>C)进行灵敏度检测，全血DNA样本的浓度为5ng/μL，检测结果如图9所示，图9中的A为：c.3G>A；B为：c.26T>G；C为：c.356T>C；D为：c.433C>T；E为：c.439C>T；F为：c.445C>T；G为c.726G>C，检测结果如表10和图9所示，由表10可知，在原发性家族性脑钙化全血DNA样本的浓度为5ng/μL时，平行重复检测10次，实施例1所提供的检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物对PDGFB基因多态性位点(c.260T＞C、c.407G＞A、c.419T＞C、c.434T＞C、c.653T＞C)检出率均为100％。由图9可知，本发明的引物组合物结合飞行时间质谱检测可以检测出浓度为5ng/μL的全血DNA样本的PDGFB基因全部突变位点(c.3G>A、c.26T>G、c.356T>C、c.433C>T、c.439C>T、c.445C>T和c.726G>C)，峰值高且特异，SNR值大于3。这充分说明本发明引物组合物的分析灵敏度为5ng/μL，灵敏度高。
表10
实施例3
原发性家族性脑钙化PDGFB基因多态性位点(c.3G>A、c.26T>G、c.356T>C、c.433C>T、c.439C>T、c.445C>T和c.726G>C)的飞行时间质谱检测体系特异性验证：
采用核酸提取或纯化试剂进行核酸提取，然后使用分光光度计进行检测，稀释至临界浓度(5ng/μL)，分别添加内源性干扰物质、外源干扰物质以及药物干扰，调节干扰物质终浓度如表11所示，以不添加干扰物质的样本为对照(即实施例1)。检测结果如表12所示，由表12可知，在原发性家族性脑钙化全血DNA样本的浓度为5ng/μL时，分别添加内源性干扰物质、外源干扰物质以及药物干扰，平行重复检测10次，实施例1所提供的检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物对PDGFB基因多态性位点(c.260T＞C、c.407G＞A、c.419T＞C、c.434T＞C、c.653T＞C)检出率均为100％。在添加内源性干扰物质、外源干扰物质以及药物干扰物质的情况下，本实施例也均能够准确检出原发性家族性脑钙化PDGFB基因全部多态性位点(c.3G>A、c.26T>G、c.356T>C、c.433C>T、c.439C>T、c.445C>T和c.726G>C)。这充分说明本发明的引物组合物特异性高。
表11干扰物质
表12
实施例4
原发性家族性脑钙化PDGFB基因多态性位点(c.3G>A、c.26T>G、c.356T>C、c.433C>T、c.439C>T、c.445C>T和c.726G>C)的飞行时间质谱检测体系精密度验证：
采用核酸提取或纯化试剂将真实全血样本进行核酸提取，然后使用分光光度计进行检测，获得DNA样本的浓度值。根据DNA的浓度值分别稀释至30ng/μL为中浓度样本、15ng/μL为临界浓度样本，各重复检测10次，均全部准确检出，结果如下表13所示。
表13
对比例1
本对比例1参照实施例1检测检测PDGFB基因多态性位点(c.3G>A、c.26T>G、c.356T>C、c.433C>T、c.439C>T、c.445C>T和c.726G>C)，本对比例1与实施例1构成区别的是：使用其他检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物。除了上述区别以外，本对比例所采用的其他物料以及工艺操作与实施例1严格保持一致。对比例1扩增引物和单碱基延伸引物如下表14所示。
表14扩增引物和延伸引物序列表
图10为对比例1检测各位点的质谱图，其中，A为：c.3G>A；B为：c.26T>G；C为：c.356T>C；D为：c.433C>T；E为：c.439C>T；F为：c.445C>T；G为c.726G>C。对比例1中B、G的两个位点引物组合物结合飞行时间质谱检测无法准确鉴别其基因型，由此可知，本对比例1的检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物不能按照预期扩增延伸对应位点，结合飞行时间质谱检测无法准确鉴别基因型。
本发明针对PDGFB基因多态性位点，设计特异性PCR扩增引物和单碱基延伸引物，扩增得到含有多个目的片段的样本。通过延伸反应处理，延伸引物特异性结合目的片段，延伸一个碱基，计算延伸后靶标序列的固定质量。通过飞行时间质谱分析系统是否检测到靶标序列的分子质量，来达到检测目的，实现了对PDGFB基因多态性位点的高灵敏度、高特异性和高精密度的检测。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括组分A、组分B、组分C、组分D、组分E、组分F、组分G中的至少一种；
所述组分A包括SEQ ID NO:1所示的上游引物、SEQ ID NO:2所示的下游引物和SEQ IDNO:3所示的单碱基延伸引物；
所述组分B包括SEQ ID NO:4所示的上游引物、SEQ ID NO:5所示的下游引物和SEQ IDNO:6所示的单碱基延伸引物；
所述组分C包括SEQ ID NO:7所示的上游引物、SEQ ID NO:8所示的下游引物和SEQ IDNO:9所示的单碱基延伸引物；
所述组分D包括SEQ ID NO:10所示的上游引物、SEQ ID NO:11所示的下游引物和SEQID NO:12所示的单碱基延伸引物；
所述组分E包括SEQ ID NO:10所示的上游引物、SEQ ID NO:11所示的下游引物和SEQID NO:13所示的单碱基延伸引物；
所述组分F包括SEQ ID NO:10所示的上游引物、SEQ ID NO:11所示的下游引物和SEQID NO:14所示的单碱基延伸引物；
所述组分G包括SEQ ID NO:15所示的上游引物、SEQ ID NO:16所示的下游引物和SEQID NO:17所示的单碱基延伸引物。
2.根据权利要求1所述检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括组分A、组分B、组分C、组分D、组分E、组分F、组分G中的至少两种。
3.根据权利要求2所述检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括组分A、组分B、组分C、组分D、组分E、组分F和组分G。
4.一种检测PDGFB基因多态性位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一项所述检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物。
5.根据权利要求4所述检测PDGFB基因多态性位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应试剂、SAP反应试剂、单碱基延伸反应试剂中的至少一种。
6.根据权利要求5所述检测PDGFB基因多态性位点的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括PCR Buffer缓冲液和PCR酶中的至少一种。
7.根据权利要求5所述检测PDGFB基因多态性位点的试剂盒，其特征在于，所述SAP反应试剂包括SAP缓冲液和SAP酶中的至少一种。
8.根据权利要求5所述检测PDGFB基因多态性位点的试剂盒，其特征在于，所述单碱基延伸反应试剂包括延伸缓冲液、延伸终止液、延伸酶中的至少一种。
9.一种检测原发性家族性脑钙化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一项所述检测PDGFB基因多态性位点的引物组合物。
10.一种以非诊断目的检测PDGFB基因多态性位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.使用权利要求4～8任一项所述试剂盒中的所述上游引物和所述下游引物对待测样本进行PCR扩增反应，得到扩增产物；
S2.将步骤S1得到的扩增产物进行去磷酸化处理，得到去磷酸化产物；
S3.使用权利要求4～8任一项所述试剂盒中的所述单碱基延伸引物对步骤S2得到的去磷酸化产物进行单碱基延伸，得到延伸产物；
S4.将步骤S3得到的延伸产物进行脱盐纯化，得到纯化产物；
S5.对纯化产物进行质谱检测。
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