CN115011477A - 一种细胞微膜片制备器件及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞微膜片制备器件，包括培养细胞的基材，基材上修饰有温敏性聚合物，温敏性聚合物上图案化修饰有抗细胞粘附剂作为隔离带，以此将修饰有温敏性聚合物的基材表面分隔为若干块相互独立的区域。由于抗细胞粘附剂的作用，细胞无法在修饰有抗细胞粘附剂的区域生长，通过抗细胞粘附剂的隔离作用，从而将培养的细胞分隔为一块一块相互独立的微膜片，培养结束后，利用温敏性聚合物的温变特性，可自动收获一块块细胞微膜片，无需洗涤和物理切割。本发明避免了在收获细胞时胰酶或胰酶替代物的使用，最大限度上保护了细胞连接与细胞外基质的完整性，有利于提升干细胞活性和存活率，增加其在靶向部位的滞留性，最终提升干细胞治疗效果。

Description

一种细胞微膜片制备器件及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，更具体地，涉及一种细胞微膜片制备器件及其制备方法和应用。
背景技术
细胞由于其自我更新和多系分化潜力，在组织修复与再生方面的应用得到了广泛的研究。根据美国国立卫生研究院管理的临床研究登记系统(Clinicaltrials.gov) 数据显示，截至2021年4月14日，全球登记的干细胞临床研究项目共计5822 项，其中有2451项已经完成临床试验研究。在过去的三年里(2018-2020年)，国家药品评审中心(CDE)平均每年受理6个干细胞药物，其中绝大多数为干细胞注射液。干细胞注射液在收获细胞时，需要用到胰酶或胰酶替代物消化细胞，而细胞消化过程亦会破坏细胞连接与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，细胞外基质中含有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、和弹性蛋白等对细胞的形态、粘附、迁移及分化起着巨大的调控作用的关键蛋白，这不仅使得细胞质量不断下降，也会导致细胞在注射移植后大量凋亡，此外，单细胞悬液注射后细胞流失严重，只有极少数细胞可以滞留在目标宿主组织处。
细胞膜片技术(cell sheet technology，CST)是一种无需支架的细胞移植方法，可无创性地获取细胞，避免了酶消化对细胞生物学功能的损伤，不仅保留了完整的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，同时还保留了重要离子通道和生长因子受体等，可以促进细胞间及细胞与胞外基质间的相互作用。关于细胞膜片的制备，Okano(Matsuura,K.；Haraguchi,Y.；Shimizu,T.；Okano,T.,Cell sheet transplantation for heart tissuerepair.Journal of Controlled Release,2013,169(3): 336-340.)公开了在组织培养皿的表面修饰一层温敏性聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)PNIPAM，在温度为20℃时，PNIPAM修饰过的组织培养皿表面呈亲水性，不适合细胞粘附；在温度为37℃时，表面呈疏水性，适合细胞的粘附与增殖。因此，当接种细胞并培养至汇合后，不需要经过细胞消化步骤，仅通过改变培养温度便可以得到完整的细胞膜片，然而其制备的细胞膜片尺寸较大，以治疗扩大性心肌为例，其使用的细胞膜片尺寸高达4cm，使用时需要4张膜片叠加使用，移植过程更是需要通过胸廓切开术，过于复杂的移植过程极大的限制了其临床应用场景。Hsing-WenSung(Chen,C.H.；Chang,Y.；Wang,C.C.；Huang,C.H.；Huang, C.C.；Yeh,Y.C.；Hwang,S.M.；Sung,H.W.,Construction and characterization of fragmented mesenchymal-stem-cell sheets for intramuscular injection.Biomaterials 2007,28,4643-4651.)对细胞膜片技术做了进一步的改进，提出了一种利用甲基纤维素水凝胶制备破碎的间充质干细胞膜片(fragmented mesenchymal-stem-cell sheets)技术，首先在细胞培养皿上铺上一层甲基纤维素溶液(其具有温敏性，在37℃时为固态，在20℃或者更低温度时则转变为溶液状态)，然后在37℃培养箱中放置一小时，使其凝固为凝胶，之后在凝胶上涂覆一层一型胶原涂层，使其适合细胞的粘附与增殖。接种间充质干细胞，待细胞长满变成细胞膜片后用特制的铁丝网对凝胶体系进行切割，之后用冷的PBS溶液(使甲基纤维素由凝胶态转变为溶液态)对其进行洗涤，除去甲基纤维素等其他物质，便能够获得破碎的间充质干细胞膜片，使用这一方法制备的破碎的细胞膜片由于其体积和面积小，能够通过注射器进行注射移植。然而其制备的破碎的干细胞膜片，虽说可以进行注射移植，但是由于其需要使用动物源性的一型胶原对甲基纤维素水凝胶进行涂层，存在着病毒隐患以及排斥反应发生几率高等问题；此外，其亦需要用特制的铁丝网对完整的细胞膜片进行切割，这一过程亦会对细胞造成物理损伤，从而影响其活性。因此，亟需提供一种不需要用动物源性的胶原进行涂层，也不需要用铁丝网进行物理切割，保证微膜片的安全性与生物活性，同时制备尺寸较小的细胞膜片的技术，使其完全可以通过显微注射技术进行移植。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种细胞微膜片制备器件。
本发明的第二个目的在于提供所述细胞微膜片制备器件的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供所述细胞微膜片制备器件的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种细胞微膜片制备器件，包括培养细胞的基材，基材上修饰有温敏性聚合物，温敏性聚合物上图案化修饰有抗细胞粘附剂作为隔离带，以此将修饰有温敏性聚合物的基材表面分隔为若干块相互独立的区域。
本发明通过在修饰有温敏性聚合物的基材上再图案化修饰抗细胞粘附剂作为隔离带，通过图案化修饰的方式将修饰有温敏性聚合物的基材表面用抗细胞粘附剂分隔为若干块相互独立的区域。利用所述器件培养干细胞，由于抗细胞粘附剂的作用，细胞无法在修饰有抗细胞粘附剂的区域生长，而只能在未修饰抗细胞粘附剂的区域生长，相当于通过抗细胞粘附剂的“隔离”作用，相当于细胞只能在被分隔后的相互独立的区域内生长，从而使基材表面培养的细胞被分隔为一块一块相互独立的微膜片形状，培养结束后，再利用温敏性聚合物的温变特性，低温下即可收获一块块独立的细胞微膜片，无需洗涤和物理切割；同时利用图案化修饰可预先对修饰区域的形状、尺寸大小进行设计的优点，可用于几十至数百微米尺寸的细胞微膜片大规模生产。
优选地，所述未修饰抗细胞粘附剂的区域边长尺寸或直径尺寸为10μm-999 μm；可通过图案化修饰调控分隔区的大小，通过将细胞限定的一定的区域内培养，后续即可获得预期尺寸的细胞微膜片。
优选地，所述温敏性聚合物包括但不限于聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯、聚(2-羧基异丙基丙烯酰胺)、聚环氧乙烷或聚(N，N-二乙基丙烯酰胺)中的至少一种，理论上在适合细胞培养温度下时表面呈疏水性，适合细胞的粘附与增殖，在低温下表面呈亲水性，不适合细胞粘附的温敏性聚合物均应在本发明保护范围内。
优选地，所述抗细胞粘附剂包括但不限于肝素钠、聚乙二醇、聚丙烯酸、羧甲基纤维素钠或海藻酸钠中的至少一种，理论上可用于图案化修饰且具有抗细胞黏附作用的制剂均应在本发明保护范围内。
优选地，所述基材选择玻璃片、玻璃板、各类型组织培养用聚苯乙烯培养皿(TCPS)、细胞培养瓶、细胞培养滚瓶、聚酰胺、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁酯、聚甲醛树脂、聚碳酸树脂、聚苯醚、聚四氟乙烯、聚氨基甲酸乙酯、聚氧化乙烯、聚丙烯、聚乳酸、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物中的至少一种。
本发明还提供上述任一所述细胞微膜片制备器件的制备方法，包括如下步骤：
S1.在培养细胞的基材表面修饰一层温敏性聚合物；
S2.在步骤S1修饰有温敏性聚合物的基材上再图案化修饰抗细胞粘附剂作为隔离带，通过图案化修饰将修饰有温敏性聚合物的基材表面分隔为若干块相互独立的区域，即得细胞微膜片制备器件。
优选地，在修饰温敏性聚合物前，可先用清洗液对基材进行清洗，所述清洗液选自去离子水、乙醇、一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、异丙醇、食人鱼洗液、石油醚、三氯乙烯、四氯乙烯中的至少一种；
优选地，步骤S1中修饰温敏性聚合物的方法包括电子束辐照、等离子体气相聚合、紫外线照射、溶剂浇铸、旋转涂布或启动化学气相沉积。
优选地，步骤S2中图案化修饰采用微接触印刷技术；例如通过PDMS印章转移图案。
优选地，当抗细胞粘附剂无法直接修饰在温敏性聚合物上时，可通过先修饰一层中间连接体，再利用中间连接体修饰抗细胞粘附剂；例如，当图案化修饰肝素钠时，先在温敏性聚合物层表面图案化修饰一层聚多巴胺，再将修饰完聚多巴胺的基材进一步与肝素钠反应，获得修饰有肝素钠的细胞微膜片制备器件。由于肝素钠呈负电性，因此细胞不会在其表面上粘附与增殖，培养至细胞汇合后，细胞在基材表面生长为一块一块被肝素钠修饰过的区域间隔开的微膜片形状。
本发明还提供上述任一所述细胞微膜片制备器件在制备细胞微膜片中的应用。
具体地，将细胞微膜片制备器件灭菌后，接种种子细胞，待细胞扩增结束后，降低温度，片状的细胞微膜片便会从细胞微膜片制备器件上脱落，从而收获细胞微膜片。所述细胞微膜片的制备方式避免了在收获细胞时胰酶或胰酶替代物的使用，最大限度上保护了细胞连接与细胞外基质的完整性，有利于提升干细胞活性和存活率，增加其在靶向部位的滞留性，最终提升干细胞治疗效果。
优选地，所述种子细胞包括但不限于脂肪干细胞、气道基底层细胞或者脐带间充质干细胞中的任一一种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的细胞微膜片制备器件，通过在修饰有温敏性聚合物的基材表面图案化修饰抗细胞粘附剂作为隔离带，从而将基材表面独立分隔为若干块相互独立的区域，从而使基材表面培养的细胞可被分隔为一块一块相互独立的微膜片形状，培养结束后，再利用温敏性聚合物的温变特性，低温下即可收获一块块独立的细胞微膜片，既不需要用动物源性的胶原进行涂层，也不需要用铁丝网进行物理切割，保证了微膜片的安全性与生物活性；同时利用图案化修饰可预先对修饰区域的形状、尺寸大小进行设计的优点，调整细胞生长区的大小，可用于几十至数百微米尺寸的细胞微膜片大规模生产，使其完全可以通过显微注射技术进行移植，极大的拓宽了其临床应用场景。利用本发明细胞微膜片制备器件制备微膜片，避免了在收获细胞时胰酶或胰酶替代物的使用，最大限度上保护了细胞连接与细胞外基质的完整性，有利于提升干细胞活性和存活率，增加其在靶向部位的滞留性，最终提升干细胞治疗效果。
附图说明
图1为PDMS印章结构示意图。长5mm、宽5mm、高1cm，孔的边长为0.25mm，孔间距为0.25mm，孔深1mm。
图2为XPS图谱分析。(a)Gla，(b)Gla-PNIPAM，(c)Gla-PNIPAM-PD-Hep。
图3为人脐带间充质干细胞(hUCMSC)微膜片。(a)微膜片脱附前，(b) 脱附后的live/dead染色。
图4为人脐带间充质干细胞微膜片与单细胞悬液比较。(a)单细胞悬液， (b)微膜片；可见，相比于单细胞悬液，微膜片中存在中丰富的细胞外基质。
图5为人脐带间充质干细胞微膜片与单细胞悬液接种效果比较。(a)单细胞悬液(DCs)接种后0-4h的照片，(b)微膜片接种后0-4h的照片，(c)单细胞悬液在此过程中的F-actin染色照片，(d)微膜片在此过程中的F-actin染色照片；可见，相比于单细胞悬液，微膜片显示出了更好的粘附和增殖能力。
图6为体内伤口愈合活性的评价。(a)术后0d、3d、10d和16d用纯Pfs、 DC和MTs治疗的全层皮肤缺损照片；(b)术后3d、10d和16d各种治疗后的伤口愈合率；(c)术后16天每组标本的代表性H&E染色图像，比例尺500μm； (d)术后16天各组标本的代表性Masson三色染色图像，比例尺，500μm。* 显着差异，P<0.05；**极显着差异，P<0.01；***高度显着差异，P<0.001。
图7为气道基底层细胞微膜片。
图8为脂肪间充质干细胞微膜片。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1细胞微膜片规模化制备器件Gla-PNIPAM-PD-Hep的制备
1、修饰温敏性聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)PNIPAM：
(1)将玻璃片用食人鱼洗液进行清洗，去除表面的有机物杂质；
将双氧水与浓硫酸按照体积比3:7配置200mL食人鱼洗液，将盖玻片浸没在其中后置于100℃中处理一个小时，取出盖玻片，用去离子水进行多次洗涤后，在氮气环境中吹干，记为Gla。
(2)用旋转涂布的方法修饰温敏性聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)PNIPAM；
用乙醇配置3wt.％的PNIPAM和10wt.％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液，然后取5mL的PNIPAM溶液和1.5mL的APTES溶液混合均匀得到预混液；
将清洗过的盖玻片置于匀胶机上，在其中心位置滴加50微升预混液，以 2000rpm/min的速度旋转30s，之后置于160℃的真空干燥箱(真空度低于100mTorr) 中干燥3天，得到Gla-PNIPAM。
2、利用微接触印刷技术在修饰完PNIPAM的盖玻片表面图案化修饰一层聚多巴胺；
用pH值为8.5的Tris-HCl溶液配制2mg/mL的多巴胺溶液，将如图1所示的 PDMS印章(长5mm、宽5mm、高1cm，孔的边长为0.25mm，孔间距为0.25mm，孔深1mm)浸没在多巴胺溶液中30min，置于N2气流下吹干后置于修饰完PNIPAM 的盖玻片表面，并压上重物后在37℃下反应4h。取下PDMS印章，将盖玻片用去离子水洗涤3遍，得到Gla-PNIPAM-PD。
3、进一步修饰肝素钠
用PBS溶液配制5mg/mL的肝素钠溶液。将上述图案化修饰完聚多巴胺的盖玻片浸没于肝素钠溶液中在4℃下反应24h，取出盖玻片，用去离子水洗涤3遍，得到Gla-PNIPAM-PD-Hep。
X射线光电子能谱(XPS；图2)证实了在玻璃基板表面形成PNIPAM/APTES 膜。相比于Gla的XPS谱图(图2a)，Gla-PNIPAM的谱图(图2b)中在结合能(BE) 约为399eV(归因于亚氨基(-NH-)基团)的N1s信号证实了Gla-PNIPAM的形成； Gla-PNIPAM-PD-Hep的谱图(图2c)中，S 2p信号在约168eV BE的出现表明在 Gla-PNIPAM表面成功引入了带负电荷的肝素分子，即成功制备了微膜片规模化制备器件Gla-PNIPAM-PD-Hep。
实施例2细胞微膜片规模化制备器件Gla-PNIPAM-PD-Hep的制备
与实施例1基本相同，唯一不同之处在于Gla-PNIPAM的制备采用如下步骤：将Gla进行氧等离子体处理，使其表面拥有大量的-OH，继而与硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)反应，修饰上-NH2，进一步与2-溴异丁酰溴(BIBB) 反应，后引发ATRP反应在Gla表面修饰上PNIPAM。
实施例3细胞微膜片规模化制备器件Gla-PNIPAM-PD-Hep的制备
与实施例1基本相同，唯一不同之处在于Gla-PNIPAM的制备采用如下步骤：将Gla进行氧等离子体处理，使其表面拥有大量的-OH，继而与硅烷偶联剂3-缩水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷反应，使其带上环氧环，继而用带-NH2的PNIPAM对环氧环进行开环反应，制备Gla-PNIPAM。
实施例4细胞微膜片规模化制备器件Gla-PNIPAM-PD-PEG的制备
1、修饰温敏性聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)PNIPAM：
(1)将玻璃片用丙酮和无水乙醇进行清洗，去除表面的有机物杂质；
将盖玻片浸没在丙酮和无水乙醇中分别超声洗涤半个小时，取出盖玻片，用去离子水进行多次洗涤后，在氮气环境中吹干，记为Gla。
(2)用旋转涂布的方法修饰温敏性聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)PNIPAM；
用乙醇配置3wt.％的PNIPAM和10wt.％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液，然后取5mL的PNIPAM溶液和1.5mL的APTES溶液混合均匀得到预混液；
将清洗过的盖玻片置于匀胶机上，在其中心位置滴加50微升预混液，以 2000rpm/min的速度旋转30s，之后置于160℃的真空干燥箱(真空度低于100mTorr) 中干燥3天，得到Gla-PNIPAM。
2、利用微接触印刷技术在修饰完PNIPAM的盖玻片表面图案化修饰一层聚多巴胺；
用pH值为8.5的Tris-HCl溶液配制2mg/mL的多巴胺溶液，将如图1所示的 PDMS印章浸没在多巴胺溶液中30min，置于N2气流下吹干后置于修饰完PNIPAM 的盖玻片表面，并压上重物后在37℃下反应4h。取下PDMS印章，将盖玻片用去离子水洗涤3遍，得到Gla-PNIPAM-PD。
3、进一步修饰聚乙二醇PEG
用pH值为8.5的Tris-HCl配制5mg/mL的聚乙二醇溶液。将上述图案化修饰完聚多巴胺的盖玻片浸没于聚乙二醇溶液中在45℃下反应48h，取出盖玻片，用去离子水洗涤3遍，得到Gla-PNIPAM-PD-PEG。
实施例5
将实施例1中的温敏性聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)PNIPAM改为聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯PDMAEMA，其余条件保持不变，制备得到细胞微膜片规模化制备器件Gla-PDMAEMA-PD-Hep。
实施例6
将实施例4中5mg/mL的聚乙二醇溶液改为10mg/mL的聚丙烯酸(PAA)溶液，其余保持不变，制备得到细胞微膜片规模化制备器件Gla-PNIPAM-PD-PAA。应用例1人脐带间充质干细胞(hUCMSC)微膜片的制备
将实施例1修饰好的玻璃片经辐照灭菌后置于直径为3.5cm的培养皿中，以 1.5×104/cm2的密度接种人脐带间充质干细胞hUCMSC，由于肝素钠呈负电性，因此干细胞不会在其表面上粘附与增殖，培养至细胞汇合后，则观察到干细胞在盖玻片上生长为一块一块被肝素钠修饰过的区域间隔开的微膜片形状(如图3a 所示)，微膜片尺寸大小约为250μm*250μm；将其放置于4℃冰箱中20min，微膜片则会自动从盖玻片上脱落下来，由于微膜片较小，因此脱落的更快。由于微膜片收获过程中未用到铁丝网或细胞刮刀等锐器，因此live/dead染色显示出微膜片具有非常高的细胞存活率(如图3b所示)。
取制备的人脐带间充质干细胞微膜片进行进一步表征，由于整个过程并未用到蛋白水解酶对细胞进行消化，因此微膜片存留了大量的细胞外基质，如图4所示，相比于单细胞悬液(图4a)，微膜片(图4b)中含有大量的细胞外基质成分，诸如Fibronectin、Laminin和Collagen I。图5a与图5b分别为单细胞悬液(DCs)(图 5a)和微膜片(MTs)(图5b)接种后0-4h的照片，图5c和图5d分别为单细胞悬液 (图5c)和微膜片(图5d)在此过程中的F-actin染色照片，可以看出，相比于单细胞悬液，微膜片显示出了更好的粘附和增殖能力。
进一步评估制备的人脐带间充质干细胞微膜片在体内增强软组织修复的可行性，并采用大大鼠全层皮肤缺损作为软组织缺损的模型系统。与传统的直径为 10mm的全层皮肤缺损相比，本研究采用了更宽的直径为25mm的全层皮肤缺损模型。并采用猪纤维蛋白粘合剂(Pfs)作为粘合剂，将MTs(MTs-Pfs)对伤口愈合的影响与纯Pfs和DCs(DCs-Pfs)进行比较。如图6a所示，与其他组相比，MTs-Pfs 治疗组在手术后第3天观察到伤口尺寸减小。在第10天，用MTs-Pfs治疗的伤口与其他组的伤口相比，愈合率有显着差异。16天后，MTs-Pfs处理的伤口完全闭合，表皮光滑，其他处理的伤口没有完全愈合。在不同时间点(第3、10和16天)量化伤口闭合的百分比，证实MTs-Pfs治疗的伤口愈合速度明显快于其他治疗(图 6b)。此外，还进行了苏木精和伊红(H&E)染色以观察伤口愈合过程中的组织再生。如图6c所示，16天后，仅在MTs-Pfs组中，我们观察到完全再上皮化和更多再生的毛囊。Masson三色染色切片的组织学分析表明，与其他治疗组相比，用 MTs-Pfs治疗的伤口显示胶原沉积增加，胶原纤维显示出规则的波浪形(图6d)。这些结果证实，与DCs-Pfs组相比，MTs-Pfs组在体内表现出最好的软组织修复效果。
应用例2气道基底层细胞(BCs)微膜片的制备
将应用例1中的人脐带间充质干细胞换成气道基底层细胞，制备出了气道基底层细胞微膜片，live/dead染色亦显示出气道基底层细胞微膜片具有非常高的细胞存活率(如图7所示)。
应用例3脂肪间充质干细胞(ADSCs)微膜片的制备
将应用例1中的人脐带间充质干细胞换成脂肪间充质干细胞，制备出了脂肪间充质干细胞微膜片，live/dead染色亦显示出脂肪间充质干细胞微膜片具有非常高的细胞存活率(如图8所示)。
以上结果表明，本发明的微膜片规模化制备技术具有普适性，适用于各种干细胞微膜片的制备，诸如人脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、气道基底层细胞，等等，避免了在收获细胞时胰酶或胰酶替代物的使用，既不需要用动物源性的胶原进行涂层，也不需要用铁丝网进行物理切割，保证了微膜片的安全性与生物活性，最大限度上保护了细胞连接与细胞外基质的完整性，有利于提升干细胞活性和存活率，增加其在靶向部位的滞留性，最终提升干细胞治疗效果。同时由于其尺寸控制在几十至几百微米之间，完全可以通过显微注射技术进行移植，极大的拓宽了其临床应用场景。

Claims (10)

1.一种细胞微膜片制备器件，其特征在于，包括培养细胞的基材，基材上修饰有温敏性聚合物，温敏性聚合物上图案化修饰有抗细胞粘附剂作为隔离带，以此将修饰有温敏性聚合物的基材表面分隔为若干块相互独立的区域。
2.根据权利要求1所述细胞微膜片制备器件，其特征在于，所述未修饰抗细胞粘附剂的区域边长尺寸或直径尺寸为10μm-999μm。
3.根据权利要求1所述细胞微膜片制备器件，其特征在于，所述温敏性聚合物为聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯、聚(2-羧基异丙基丙烯酰胺)、聚环氧乙烷或聚(N，N-二乙基丙烯酰胺)中的至少一种。
4.根据权利要求1所述细胞微膜片制备器件，其特征在于，所述抗细胞粘附剂为肝素钠、聚乙二醇、聚丙烯酸、羧甲基纤维素钠或海藻酸钠中的至少一种。
5.根据权利要求1所述细胞微膜片制备器件，其特征在于，所述基材选择玻璃片、玻璃板、聚苯乙烯培养皿、细胞培养瓶、细胞培养滚瓶、聚酰胺、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁酯、聚甲醛树脂、聚碳酸树脂、聚苯醚、聚四氟乙烯、聚氨基甲酸乙酯、聚氧化乙烯、聚丙烯、聚乳酸、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物中的至少一种。
6.权利要求1-5任一所述细胞微膜片制备器件的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.在培养细胞的基材表面修饰一层温敏性聚合物；
S2.在步骤S1修饰有温敏性聚合物的基材上再图案化修饰抗细胞粘附剂作为隔离带，通过图案化修饰将修饰有温敏性聚合物的基材表面分隔为若干块相互独立的区域，即得细胞微膜片制备器件。
7.根据权利要求6所述细胞微膜片制备器件的制备方法，其特征在于，步骤S1中修饰温敏性聚合物的方法包括电子束辐照、等离子体气相聚合、紫外线照射、溶剂浇铸、旋转涂布或启动化学气相沉积。
8.根据权利要求6所述细胞微膜片制备器件的制备方法，其特征在于，步骤S2中图案化修饰采用微接触印刷技术。
9.权利要求1-5任一所述细胞微膜片制备器件在制备细胞微膜片中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，将细胞微膜片制备器件灭菌后，接种种子细胞，待细胞扩增结束后，降低温度，片状的细胞微膜片便会从细胞微膜片制备器件上脱落，从而收获细胞微膜片。
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