CN114956992A - 一种白英阿魏酸化合物及制备方法和抗炎用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种白英阿魏酸化合物，为一种新来源化合物；本发明同时还提供了该化合物的制备方法和医学应用，从白英药材中分离得到一种白英阿魏酸化合物，为一种新来源化合物，与其它天然植物中提取的阿魏酸相比，本发明白英‑阿魏酸可明显抑制小鼠急性腹腔炎症及相关炎症因子表达，抑制LPS诱导的RAW264.7细胞产生的促炎细胞因子表达，表明白英阿魏酸在体内外均有抗炎作用。本发明化合物的制备方法具有原料来源丰富，反应条件温和，反应过程操作简单，试剂易得的优点。

Description

一种白英阿魏酸化合物及制备方法和抗炎用途
技术领域
本发明公开一种白英阿魏酸化合物，为一种新来源化合物；本发明同时还提供了该化合物的制备方法和医学应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
炎症(inflammation)是世界上公认的三大顽症之一，是严重威胁人类健康的一种常见疾病。它不仅对组织、器官等造成严重损害，而且还可诱导多种疾病，如肿瘤或结核病等的发生。近来，利用天然药物防治炎性疾病的发生逐渐被人们所关注，其具有的多靶点高效抗炎作用可对急慢性炎症产生良好治疗效果，且避免了临床上常用的合成抗炎药物所具有的副作用及长期应用所带来的耐药性。因此，有效控制炎症及开发新型天然抗炎药物对防治炎性疾病的发生和发展有重要意义。
白英(Solanum lyratum Thunb)是分布于全国大部分地区的常见品种，是临床上常用的抗癌中药，主要用于治疗胃癌、肺癌、宫颈癌和卵巢癌等。近年来，国内外学者对白英的抗炎作用进行了初步研究，但成分不清，机制不祥。
发明内容
本发明公开一种白英阿魏酸化合物，为一种新来源化合物，该化合物表现出体内外良好的抗炎效果，能应用于进一步开发抗炎药物。
本发明还公开一种白英阿魏酸化合物的制备方法，具有原料来源丰富，反应条件温和，反应过程简单，所用试剂经济易得等优点。
本发明所述的一种白英阿魏酸化合物（FEA），是肉桂酸的衍生物之一；其化学名称为：3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，化学分子式为C10H10O4，分子量为194.184，结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
本发明公开的一种白英阿魏酸化合物的制备方法，制备方法如下：
1）称取白英药材加入10倍量水回流提取3次，每次两小时，合并提取液，过滤，弃去沉渣；
2）将上清液通过预先处理过的大孔吸附树脂D101，用去离子水洗至无色，弃去水液，然后依次用75％乙醇进行洗脱，洗至流出液无色，合并洗脱液，回收乙醇，用乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯部位；
3）然后采用硅胶柱分离、二氯甲烷－甲醇梯度洗脱［95:5，90:10，85:15，80:20，75:25，70:30，60:40和50:50］后，再对其分反复硅胶柱分离，并经MCI树脂柱、SephadexLH-20柱色谱、半制备液相纯化，即得。
本发明所述的一种白英阿魏酸化合物在制备抗炎作用药物的中用途。
根据各化合物理化性质，利用1H NMR和13C NMR解析手段对分离得到的阿魏酸化合物化合物进行结构鉴定，具体解析如下（图1）：
由1H NMR可见一个存在一个甲氧基δ (ppm) = 3.81 (s, 3H)，两个低场氢信号，δ(ppm) = 12.13 (s, 1H)和δ (ppm) = 9.55 (s, 1H)，为羧基和酚羟基质子。δ (ppm) =6–8之间有一个单峰δ (ppm) = 7.28 (s, 1H)，其余为二重峰。结合耦合常数，两个二重峰δ(ppm) = 6.36 (d, J = 15.9 Hz, 1H)和δ (ppm) = 7.49(d, J = 15.9 Hz, 1H)为一组相耦合的质子，为烯烃质子，两个双峰δ (ppm) = 7.08 (d, J = 8.2 Hz, 1H)和δ (ppm) =6.79 (d, J = 8.1 Hz, 1H)为一组相耦合的质子，为芳环质子。
13C NMR中有一个甲氧基的信号δ (ppm) = 56.13，一个羰基碳信号δ (ppm) =168.45，除此之外在δ (ppm) = 110–150之间还有8个碳信号，推测为芳环碳原子或者烯烃碳原子。结合氢谱、碳谱以及相关文献，鉴定其结构为阿魏酸。
本发明通过构建小鼠腹腔炎症模型和脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞（RAW264.7）炎症模型发现白英阿魏酸在低剂量条件下即可拥有更高的抗炎效果。
本发明的积极效果在于：
从白英药材中分离得到一种白英阿魏酸化合物，为一种新来源化合物，与其它天然植物中提取的阿魏酸相比，本发明白英-阿魏酸可明显抑制小鼠急性腹腔炎症及相关炎症因子表达，抑制LPS诱导的RAW264.7细胞产生的促炎细胞因子表达，表明白英阿魏酸在体内外均有抗炎作用。本发明化合物的制备方法具有原料来源丰富，反应条件温和，反应过程操作简单，试剂易得的优点。
附图说明
图1：白英阿魏酸的成分鉴定（a.1H NMR；b.13C NMR）；
图2：白英阿魏酸对急性腹腔炎症小鼠血液中性粒细胞数量的影响（CON：空白对照组；Model：模型对照组；DEX：地塞米松组；0.025，0.05，0.25为sltFA治疗组；#p<0.01vsCON；**p<0.01vs Model）；
图3：白英阿魏酸对急性腹腔炎症小鼠腹腔液白细胞数量的影响（CON：空白对照组；Model：模型对照组；DEX：地塞米松组；0.025，0.05，0.25为sltFA治疗组；#p<0.01vsCON； **p<0.01vs Mode）；
图4：白英阿魏酸对急性腹腔炎小鼠血清中炎症因子表达的影（CON：空白对照组；Model：模型对照组；DEX：地塞米松组；0.025，0.05，0.25为sltFA治疗组；(a)：IL-1β的表达；(b)：IL-6的表达；#p<0.01vs CON；0.01<*p<0.05 and **p<0.01vs Model）；
图5：FA对细胞炎症因子表达的影响（CON：空白对照组；Model：模型对照组；DEX：地塞米松组；0.5，1，5为sltFA治疗组；(a)：IL-1β表达水平；(b)：IL-6表达水平；(c)：TNF-α表达水平；#p<0.01vs CON；0.01<*p<0.05 and **p<0.01vs Model）；
图6：FA对细胞炎症因子mRNA表达水平的影响（CON：空白对照组；Model：模型对照组；DEX：地塞米松组；0.5，1，5为sltFA治疗组；(a)：IL-1β 表达水平；(b)：IL-6 表达水平；(c)：TNF-α 表达水平；#p<0.01vs CON；0.01<*p<0.05 and **p<0.01vs Model）。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步描述，但本发明并不限定于上述实施方式。在权利要求书所示的范围之内通过一些修改，可实现不同的实施方式，而这种修改应属于本发明的范围。
实施例1
1）称取白英药材（前科前属植物白英Thunb）45kg，加入10倍量水回流提取3次，每次两小时，合并提取液，过滤，弃去沉渣；
2）将上清液通过预先处理过的大孔吸附树脂D101，用去离子水洗至无色，弃去水液，然后依次用75％乙醇进行洗脱，洗至流出液无色，合并洗脱液，回收乙醇，用乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯部位（135g）；
3）然后采用硅胶柱分离、二氯甲烷－甲醇梯度洗脱［95:5，90:10，85:15，80:20，75:25，70:30，60:40和50:50］后，再对其分反复硅胶柱分离，并经MCI树脂柱、SephadexLH-20柱色谱、半制备液相纯化得到化合物阿魏酸；
利用1H NMR和13C NMR解析手段对分离得到的阿魏酸化合物化合物进行结构鉴定，具体解析如下（图1）：
由1H NMR可见一个存在一个甲氧基δ (ppm) = 3.81 (s, 3H)，两个低场氢信号，δ(ppm) = 12.13 (s, 1H)和δ (ppm) = 9.55 (s, 1H)，为羧基和酚羟基质子。δ (ppm) =6–8之间有一个单峰δ (ppm) = 7.28 (s, 1H)，其余为二重峰。结合耦合常数，两个二重峰δ(ppm) = 6.36 (d, J = 15.9 Hz, 1H)和δ (ppm) = 7.49(d, J = 15.9 Hz, 1H)为一组相耦合的质子，为烯烃质子，两个双峰δ (ppm) = 7.08 (d, J = 8.2 Hz, 1H)和δ (ppm) =6.79 (d, J = 8.1 Hz, 1H)为一组相耦合的质子，为芳环质子。
13C NMR中有一个甲氧基的信号δ (ppm) = 56.13，一个羰基碳信号δ (ppm) =168.45，除此之外在δ (ppm) = 110–150之间还有8个碳信号，推测为芳环碳原子或者烯烃碳原子。结合氢谱、碳谱以及相关文献，鉴定其结构为阿魏酸，其结构式如下：
Figure 873272DEST_PATH_IMAGE002
其化学名称为：3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，化学分子式为C10H10O4，分子量为194.184。
通过以下实验证明本发明化合物的医用效果
实验例1
白英阿魏酸对小鼠的急性炎症作用
1）实验方法：
将50只昆明鼠随机分为6组（A-F），其中B-E组尾静脉注射2mL的3%巯基乙酸盐肉汤，A组和B组注射等量无菌生理盐水分别作为空白对照组和模型组；C组给予地塞米松（1.25mg/kg）作为阳性对照；D-F组分别尾静脉注射不同剂量（0.025、0.05和0.25mg/kg）的白英阿魏酸（sltFA）。给药3小时后，眼球取血，一部分以3000rpm离心10min收集血清，用ELISA试剂盒于检测小鼠血清中IL-1β和IL-6的浓度；另一部分制备血涂片，并用瑞氏染色（Wright’S）计数中性粒细胞。然后处死小鼠，用2 mL的生理盐水灌洗，收集腹腔液。1000rpm离心5 min后，用血球记数板进行总腹腔白细胞的双盲(double blindly)记数。
）实验结果
①血涂片结果显示，与空白组相比，模型组小鼠血液中性粒细胞数量显著增多（p<0.01）；而sltFA及阳性药物（地塞米松磷酸盐注射液）处理组小鼠血液中性粒细胞数量与模型组相比均明显减少（p<0.01）（图2）。
②小鼠腹腔液结果显示，模型组小鼠腹腔白细胞数量显著增多，与空白组相比差异极显著（p<0.01）；而sltFA及阳性药物处理组小鼠腹腔白细胞数量均明显减少，与模型组相比差异极显著（p<0.01）（图3）。
③小鼠血清结果显示，与空白组相比，模型组小鼠血清中IL-1β和IL-6含量显著增加；阳性对照组和不同浓度的sltFA预处理组小鼠血清中IL-1β和IL-6含量显著降低，其中0.25mg/kg的sltFA预处理组血清中IL-1β和IL-6的含量最低，与空白组相比差异不显著（P>0.05）（图4）。这表明，sltFA能抑制小鼠急性腹腔炎症，且呈明显浓度依赖性。
实验例2
本发明白英阿魏酸对RAW264.7细胞的炎症作用
1）实验方法：
将1×104细胞/孔RAW264.7细胞均匀接种于96孔板，并于37℃，5%CO2中孵育4h，待细胞贴壁后换液。实验分6组，每组三个复孔，其中空白对照组（CON）加等体积培养基；其余各组每孔加入 1μg/mL的LPS，而模型组（Model）为仅含LPS；阳性对照组（DEX）加入25μg/mL地塞米松，其余各组分别加入浓度为0.5、1、5μg/mL浓度的sltFA；培养24小时后，提取上清液并以1000 rpm离心5 min，然后按ELISA试剂盒使用说明书方法检测细胞培养基上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度；
将2.5×105细胞/孔RAW264.7细胞接种于6孔板，并于37℃，5%CO2中孵育4h，待细胞贴壁后换液。实验分6组，其中空白对照组（CON）加等体积培养基；其余各组每孔加入1μg/mL的LPS，而模型组（Model）为仅含LPS；阳性对照组（DEX）加入25μg/mL地塞米松，其余各组分别加入浓度为0.5、1、5μg/mL浓度的sltFA。培养6小时后，按试剂盒说明书方法进行细胞总RNA的提取和鉴定。然后在ABI QuantStuidio 3机器上进行qPCR反应，以管家基因β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法测定mRNA的相对表达量。所有反应均重复进行三次。
）实验结果
①细胞结果显示，LPS刺激细胞24小时后，模型组细胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均升高，与空白组相比差异显著（P< 0.05）；而不同浓度的sltFA处理组中，IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均明显下降，且具有明显的浓度依赖性，与模型组相比差异显著（P<0.05）（图5）；
②qPCR结果显示，LPS刺激细胞6小时后，细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平显著上调；而经不同浓度梯度的sltFA处理后，细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平显著降低，且具有明显的浓度依赖性，与模型组相比差异极显著（P<0.05）。其中5μg/mL浓度的sltFA抗炎活性最佳（图6）；
这些结果表明，sltFA能明显抑制LPS刺激的RAW264.7细胞表达炎症因子，sltFA在体外具有明显抗炎活性。

Claims (3)

1.一种白英阿魏酸化合物，其特征在于具有以下结构式：
Figure 908947DEST_PATH_IMAGE001
化学名称为：3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，化学分子式为C10H10O4，分子量为194.184。
2.如权利要求1所说的一种白英阿魏酸化合物制备方法，具体步骤如下：
1）称取白英药材加入10倍量水回流提取3次，每次两小时，合并提取液，过滤，弃去沉渣；
2）将上清液通过预先处理过的大孔吸附树脂D101，用去离子水洗至无色，弃去水液，然后依次用75％乙醇进行洗脱，洗至流出液无色，合并洗脱液，回收乙醇，用乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯部位；
3）然后采用硅胶柱分离、二氯甲烷－甲醇梯度洗脱：95:5，90:10，85:15，80:20，75:25，70:30，60:40和50:50后，再对其分反复硅胶柱分离，并经MCI树脂柱、SephadexLH-20柱色谱、半制备液相纯化，即得。
3.如权利要求1所说的白英阿魏酸化合物在制备抗炎作用药物的中用途。
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