CN110354116B - 一种毛菊苣木质素类提取物的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种毛菊苣提取物的制备方法和应用，具体涉及一种毛菊苣木质素类提取物的制备方法和应用。毛菊苣木质素类提取物C₂₀H₂₄O₆可作为炎症先导化合物，该化合物对LPS激活的RAW264.7细胞产生的NO、TNF‑α、PGE₂均有抑制作用，并且细胞毒性低，可显著降低COX‑2蛋白的表达；该化合物还可改善由LPS引起的小鼠脾脏指数和胸腺指数，降低由LPS引起小鼠血清中IL‑1β的浓度。本技术方案揭示了木质素类化合物C₂₀H₂₄O₆的新用途和提供了一种该化合物的制备方法，该新性质可以拓宽该化合物的应用范围。本技术方案的化合物可以应用到药物制备等领域中。

Description

一种毛菊苣木质素类提取物的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种毛菊苣提取物的制备方法和应用，具体涉及一种毛菊苣木质素类提取物的制备方法和应用。

背景技术

毛菊苣(Cichorium glandulosum Boiss)是菊科菊苣属2年生或多年生宿根植物，原产于地中海、中亚和北非，在欧洲栽培甚多。国家药材标准《维吾尔药志》上有记载：“菊苣可入药，味微苦、咸，性凉。维吾尔医临床广泛应用于肝炎、胆囊炎等肝胆疾病的治疗”。

但是原药材毛菊苣的抗炎作用并不明显，需要从毛菊苣中分离纯化出具有抗炎效果的成分才能更好的发挥毛菊苣的抗炎功效。对毛菊苣抗炎成分的研究主要集中在毛菊苣水提物上(维药毛菊苣水提取物抗炎作用的实验研究，杨巧丽，中国医学导报，2016)，该研究揭示毛菊苣水提物抑制炎症的分子机制，但仍然存在如下问题：(1)毛菊苣水提物是一种具有多种水溶性成分的混合物，没有分离得到毛菊苣中具有抑制炎症作用的单一化合物，对混合物的药理和毒理研究较为困难，从而限制了毛菊苣水提物在临床上的运用；(2)毛菊苣中还含有大量的非水溶性成分，非水溶性成分对原药毛菊苣实现抗炎作用也具有一定贡献，但现有技术的方案缺少对非水溶性成分的抗炎效果研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种毛菊苣木质素类提取物在治疗或预防炎症的药物中的应用，从毛菊苣中提取得到的木质素类化合物具有抗炎作用，该木质素类化合物可以作为治疗或预防炎症的药物。

为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：

一种毛菊苣木质素类提取物在治疗或预防炎症的药物中的应用，所述毛菊苣木质素类提取物为C₂₀H₂₄O₆，C₂₀H₂₄O₆的结构式为：

采用上述技术方案，技术原理如下：

C₂₀H₂₄O₆的系统名为：

(2R,3S)-2,3-dihydro-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxy-3-benzofuranme thanol。C₂₀H₂₄O₆对脂多糖(LPS)激活的RAW264.7细胞产生的NO具有抑制作用，并且对RAW264.7细胞的IC₅₀为(35.06±6.08)μM/mL，对RAW264.7细胞表现出较低的细胞毒性。对LPS激活的RAW264.7细胞产生的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、前列腺素E₂(PGE₂)均具有抑制作用，可显著降低COX-2蛋白(Cyclooxygenase-2，环氧化酶2)的表达；该化合物C₂₀H₂₄O₆还可改善由LPS引起的小鼠脾脏指数和胸腺指数升高的现象，还可以降低由LPS引起小鼠血清中IL-1β的浓度。

有益效果：

炎症是人体先天免疫系统的生理防御，可抵御有害刺激，如病原体，刺激物等。然而，异常消退或长期性的炎症会促进癌症，心血管疾病，糖尿病等疾病的发生。巨噬细胞在调节由促炎因子(如LPS)诱导的炎症反应和活性氧/氮物的水平中，起着至关重要的作用。化合物C₂₀H₂₄O₆是一种具有较好抗炎作用的天然产物，可以调节巨噬细胞参与的炎症反应通路，该化合物C₂₀H₂₄O₆能作为抗炎先导化合物等治疗或预防炎症的药物，具有较好的应用前景。

C₂₀H₂₄O₆为木质素类化合物，木质素是一系列天然化合物，广泛分布于自然界中。现有技术中，通常是利用木质素的机械性能和可降解的性质制作一些复合材料，这些复合材料被应用于耐磨件、管材等的制作当中。现有的木质素的药理研究也仅仅局限在木质素作为膳食纤维的研究上，木质素是一种不溶性膳食纤维，是食物中不能消化的多糖，对减肥有一定营养学意义。在较长一段时间中，对木质素类化合物的研究和使用没有突破传统的限制，导致木质素类化合物的优良性质没有被充分利用，C₂₀H₂₄O₆就是其中之一。发明人研究发现，木质素类化合物C₂₀H₂₄O₆还具有抗炎功效，可以被用于制备抗炎先导化合物等治疗或预防炎症的药物。发明人发现了木质素类化合物C₂₀H₂₄O₆的新性质，该新性质可以拓宽C₂₀H₂₄O₆的应用范围。将C₂₀H₂₄O₆的抗炎性质和其聚合物(木质素类聚合物)的机械性能结合，可生产出具有抗炎效果的医用材料(如各种医用支架等)，也可以将单体C₂₀H₂₄O₆作为抗炎药物使用。

进一步，一种毛菊苣木质素类提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)预处理：对毛菊苣根进行脱水处理；

步骤(2)醇冷提：用乙醇对脱水处理后的毛菊苣根进行浸泡处理，收集浸泡处理后的滤液；

步骤(3)浓缩：将步骤(2)中的滤液浓缩得稠浸膏；

步骤(4)萃取纯化：将稠浸膏分散到水中，得混悬液；使用正丁醇对混悬液进行萃取，取水层；使用乙酸乙酯对所述水层进行萃取，取乙酸乙酯层；将所述乙酸乙酯层浓缩得乙酸乙酯浸膏；

步骤(5)过柱纯化：将步骤(4)中的乙酸乙酯浸膏上硅胶柱Ⅰ，通过梯度洗脱得洗脱液Ⅰ，将洗脱液Ⅰ蒸干得干粉Ⅰ；将所述干粉Ⅰ溶于甲醇后上硅胶柱Ⅱ，通过梯度洗脱得洗脱液Ⅱ，将洗脱液Ⅱ蒸干的干粉Ⅱ；将干粉Ⅱ溶于甲醇后上ODS填料，甲醇洗脱得洗脱液Ⅲ，将洗脱液Ⅲ蒸干得干粉Ⅲ；将干粉Ⅲ溶于甲醇后上Sephadex LH-20填料，甲醇洗脱得洗脱液Ⅳ，将洗脱液Ⅳ蒸干得干粉Ⅳ；将干粉Ⅳ溶于甲醇后上硅胶柱Ⅲ，通过梯度洗脱得洗脱液Ⅴ，将洗脱液Ⅴ蒸干得干粉Ⅴ；将所述干粉Ⅴ溶于甲醇后上ODS填料，甲醇洗脱后得洗脱液Ⅵ，将洗脱液Ⅵ蒸干得干粉Ⅵ，所述干粉Ⅵ为C₂₀H₂₄O₆。

采用上述技术方案，从毛菊苣中提取分离得到C₂₀H₂₄O₆，并且上述提取制备方法简单，成本低，可以获得高纯度的C₂₀H₂₄O₆。用乙醇冷浸的方法可以使C₂₀H₂₄O₆充分溶出，并且相对于传统提取方法(乙醇蒸馏提取法)，减少了提取过程中乙醇对环境的污染，提高了安全性。传统的乙醇蒸馏提取法会产生大量乙醇蒸汽，污染环境，且对操作者的健康有一定影响。且乙醇易燃易爆，属于易制毒试剂监管范围，加热乙醇进行毛菊苣提取物制备有可能会导致安全事故的发生。另外，乙醇冷浸的方法对设备要求较低，只需要提供浸泡药材的设备，有助于扩大生产，以提高C₂₀H₂₄O₆产量。其中，脱水处理是指脱去毛菊苣根内部的水分。

由本法提取纯化制备的干粉Ⅵ为黄色粉末。对干粉Ⅵ进行光谱分析，对

¹H NMR(pyridine-d₅,400MHz)的光谱分析结果进行了统一分析，结果显示使用本法提取获得的化合物(干粉Ⅵ)为C₂₀H₂₄O₆。C₂₀H₂₄O₆的系统名为：

(2R,3S)-2,3-dihydro-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxy-3-benzofuranme thanol。

进一步，在所述步骤(1)中，对毛菊苣根进行脱水处理是采用晾干的方式，脱水处理后的毛菊苣根的含水量为1-10％。

采用上述技术方案，在提取之前进行脱水处理，可以减少植物内部水分对后续提取效率的影响。

进一步，在所述步骤(2)中，用脱水处理后的毛菊苣根的质量的3～5倍的95％乙醇对脱水处理后的毛菊苣根进行浸泡处理。

采用上述技术方案，采用上述95％乙醇用量可以充分溶出植物中的C₂₀H₂₄O₆。

进一步，在所述步骤(3)中，用减压蒸馏装置在压力0～0.1MPa和温度40～50℃的条件下，将步骤(2)中的滤液浓缩得稠浸膏；所述稠浸膏的浓度为0.1～0.4g/ml。

采用上述技术方案，在压力0～0.1MPa和温度40～50℃的条件下，将滤液浓缩成稠浸膏，既可以保证目的化合物的分子完整性，又可以除去原有的溶剂(乙醇)，便于后面的萃取步骤进行。

进一步，在步骤(4)中，将1体积份的稠浸膏分散到3体积份的水中，得混悬液；使用1体积份的正丁醇对1体积份的混悬液进行萃取；使用1体积份的乙酸乙酯对1体积份的水层进行萃取。

采用上述技术方案，将1体积份的稠浸膏分散到3体积份的水中，可以使浸膏充分混悬在水中。使用1:1的萃取溶剂比例，可以保证目的化合物被充分分配到有机相(正丁醇或者乙酸乙酯)中。

进一步，在步骤(4)中，在压强0.1～0.2MPa和温度40～80℃的条件下将所述乙酸乙酯层蒸馏浓缩得乙酸乙酯浸膏，所述乙酸乙酯浸膏的浓度为0.2～0.6g/ml。

采用上述技术方案，在压力0～0.1MPa和温度40～50℃的条件下，将滤液浓缩成稠浸膏，既可以保证目的化合物的分子完整性，又可以除去原有的溶剂(乙酸乙酯)，便于后面的过柱纯化步骤进行。

进一步，在步骤(5)中，硅胶柱Ⅰ、硅胶柱Ⅱ和硅胶柱Ⅲ的孔径范围均为200～300目；硅胶柱Ⅰ的硅胶类型为硅胶H、硅胶G和硅胶HF中的任意一种；硅胶柱Ⅱ的硅胶类型为硅胶H、硅胶G和硅胶HF中的任意一种；硅胶柱Ⅲ的硅胶类型为硅胶H、硅胶G和硅胶HF中的任意一种。

采用上述技术方案，硅胶具有优良的机械强度，是目前应用最广泛的色谱柱填料。硅胶H、硅胶G和硅胶HF均为现有技术中常见的色谱柱填料。

进一步，在步骤(5)中，将步骤(4)中的乙酸乙酯浸膏上硅胶柱Ⅰ，用氯仿和甲醇组成的混合物对硅胶柱Ⅰ进行梯度洗脱得洗脱液Ⅰ；将所述干粉Ⅰ溶于甲醇后上硅胶柱Ⅱ，用氯仿和甲醇组成的混合物对硅胶柱Ⅱ进行梯度洗脱得洗脱液Ⅱ；将干粉Ⅳ溶于甲醇后上硅胶柱Ⅲ，用氯仿和甲醇组成的混合物对硅胶柱Ⅲ进行梯度洗脱得洗脱液Ⅴ。

采用上述技术方案，顺次进行上述梯度洗脱操作可以纯化分离出纯度高且杂质少的目的化合物C₂₀H₂₄O₆。

进一步，在步骤(5)中，所述Sephadex LH-20填料的颗粒直径的范围18～111μm。

采用上述技术方案，SephadexLH-20既有分子筛作用，可再生利用。颗粒直径为18～111μm的Sephadex LH-20填料可实现对目的化合物的纯化分离。

附图说明

图1为实施例1的核磁共振氢谱图。

图2为实施例1的核磁共振碳谱图。

图3为实验例中MTT实验结果图。

图4为实验例中Griess Reagent法检测结果图。

图5为实验例中ELISA法检测TNF-α的结果图。

图6为实验例中ELISA法检测PGE₂的结果图。

图7为实验例中Western Blot法检测COX-2、iNOS蛋白表达结果图。

图8为图6的COX-2、iNOS蛋白条带的相对强度图(检测条带灰度值)。

图9为实验例中ELISA法检测小鼠血清中IL-1β、IL-6的结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例1：C₂₀H₂₄O₆的制备过程

步骤(1)预处理：将毛菊苣根晾干，并使毛菊苣根的含水率为5％。

步骤(2)醇冷提：采用冷提法，取晾干的毛菊苣根5kg，用4倍量的95％乙醇浸泡5次，每次3天，收集每次浸泡的滤液，并将5次收集的滤液合并。

步骤(3)浓缩：取合并后的滤液，用减压蒸馏装置，在压力0.1MPa和温度45℃的条件下，蒸馏除去乙醇，得0.3g/ml的稠浸膏。

步骤(4)萃取纯化：将1体积份的稠浸膏分散到3体积份的水中，得混悬液；使用1体积份的正丁醇对1体积份的混悬液进行萃取，取水层；使用1体积份的乙酸乙酯对1体积份的水层进行萃取，取乙酸乙酯层。在压强0.2MPa和温度60℃的条件下，对乙酸乙酯层进行蒸馏浓缩，得0.5g/ml的乙酸乙酯浸膏。

步骤(5)过柱纯化：将步骤(4)中乙酸乙酯浸膏上300目的硅胶柱Ⅰ，硅胶柱Ⅰ的硅胶类型为硅胶H，用体积比30:1～3:1的氯仿：甲醇进行梯度洗脱得洗脱液Ⅰ，洗脱液Ⅰ用减压蒸馏装置，在压强0.1MPa和温度45℃的条件下蒸干得干粉Ⅰ。将所述干粉Ⅰ溶于甲醇后上300目的硅胶柱Ⅱ，硅胶柱Ⅱ的硅胶类型为硅胶H，用体积比10:1～1:1的氯仿：甲醇进行梯度洗脱得洗脱液Ⅱ，洗脱液Ⅱ用减压蒸馏装置，在压强0.1MPa和温度45℃的条件下蒸干得干粉Ⅱ。将干粉Ⅱ溶于甲醇后上ODS填料，60％甲醇洗脱得洗脱液Ⅲ，洗脱液Ⅲ用减压蒸馏装置，在压强0.1MPa和温度45℃的条件下蒸干得干粉Ⅲ。将干粉Ⅲ溶于甲醇后上Sephadex LH-20填料，Sephadex LH-20填料的颗粒直径为90μm，甲醇洗脱得洗脱液Ⅳ，洗脱液Ⅳ用减压蒸馏装置，在压强0.1MPa和温度45℃的条件下蒸干得干粉Ⅳ。将干粉Ⅳ溶于甲醇后上300目的硅胶柱Ⅲ，硅胶柱Ⅲ的硅胶类型为硅胶H，用体积比300:1～50:1的氯仿：甲醇进行梯度洗脱得洗脱液Ⅴ，洗脱液Ⅴ用减压蒸馏装置，在压强0.1MPa和温度45℃的条件下蒸干得干粉Ⅴ。将上述所得干粉Ⅴ上用甲醇溶解上ODS填料，50％甲醇洗脱得洗脱液Ⅵ，洗脱液Ⅵ用减压蒸馏装置，在压强0.1MPa和温度45℃的条件下蒸干得干粉Ⅵ。

对干粉Ⅵ进行鉴定(核磁共振氢谱)，结构以及性质鉴定结果如图1和图2所示。对

¹H NMR(pyridine-d₅,400MHz)的光谱分析结果进行了统一分析，结果显示在表1。

表1. C₂₀H₂₄O₆光谱分析结果

干粉Ⅵ即单体C₂₀H₂₄O₆，C₂₀H₂₄O₆的系统名为：

(2R,3S)-2,3-dihydro-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxy-3-benzofuranmethanol，C₂₀H₂₄O₆的结构式为：

实施例2：C₂₀H₂₄O₆的制备过程

本实施例基本同实施例1，不同点在于：在步骤(2)醇冷提中，使用采用冷提法，取晾干的毛菊苣根，用3倍量的95％乙醇浸泡5次，每次3天，收集每次浸泡的滤液，并将5次收集的滤液合并。硅胶柱Ⅰ、硅胶柱Ⅱ和硅胶柱Ⅲ的硅胶类型均为硅胶HF。

实施例3：C₂₀H₂₄O₆的制备过程

本实施例基本同实施例1，不同点在于：在步骤(2)醇冷提中，使用采用冷提法，取晾干的毛菊苣根，用5倍量的95％乙醇浸泡5次，每次3天，收集每次浸泡的滤液，并将5次收集的滤液合并。硅胶柱Ⅰ、硅胶柱Ⅱ和硅胶柱Ⅲ的硅胶类型均为硅胶G。

实验例：C₂₀H₂₄O₆抗炎活性研究

RAW264.7巨噬细胞是主要的免疫效应细胞，如何有效地抑制巨噬细胞的活化增殖和降低炎症因子的水平成为抗炎的关键。核转录因子-κB(NF-κB)和肿瘤坏死因子(TNF)介导的信号转导通路在炎症反应中起着至关重要的作用。减少不同类型细胞中TNF-α的表达，抑制其所在的信号通路，进一步减少下游炎症因子的分泌表达，可以减轻炎症反应。NF-κB信号传导通路是LPS所介导的信号传导通路中最重要的下游通路，也是巨噬细胞激活的中心环节。LPS诱导内皮细胞表达包括一氧化氮(NO)、前列腺素E₂(PGE₂)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素1β(IL-1β)等炎症因子。其中NO的过量生成与炎症反应关系密切，PGE₂可诱导炎症细胞释放趋化因子，募集炎性细胞移动，并在巨噬细胞中与LPS协同诱导表达IL-6,IL-1。因此寻找可以负反馈调节这些细胞因子，并具有潜在抗炎活性的化合物尤为重要。

因此，在本实验例中，体外以脂多糖(LPS)刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7建立体外炎症模型，通过MTT法评价细胞毒性,采用Griess Reagent法检测细胞培养上清一氧化氮(NO)含量并计算炎症抑制率,ELISA法检测细胞培养上清PGE₂、TNF-α含量，蛋白质印迹法检测iNOS(诱导型一氧化氮合酶)、COX-2蛋白(Cyclooxygenase-2，环氧化酶2)表达。体内以LPS诱导小鼠建立体内炎症模型，通过ELISA法检测小鼠血清中IL-1β和IL-6的含量。

在本实验例中使用的C₂₀H₂₄O₆是按照实施例1中的提取方法提取制得。将C₂₀H₂₄O₆粉末依照下述各实验的浓度要求溶于无菌去离子水，进行体外和体内实验。在实验例中，使用到的主要试剂和仪器为：MTT试剂盒(sigma，美国)，ELISA试剂盒(sigma，美国)，LPS(脂多糖，E.coli O55:B5，sigma，美国)，全蛋白抽提试剂盒(凯基生物，中国)，二氧化碳细胞培养箱(Heal Force，美国)，可调移液器(Finnpipette，美国)，SDS-PAGE电泳仪(Bio-RAD，美国)。

1、体外实验：

(1)MTT法评价细胞毒性

结果如图3所示，左侧为空白对照，右侧为使用100μM C₂₀H₂₄O₆处理小鼠巨噬细胞RAW264.724h。图4可以看出，与空白对照组相比100μM C₂₀H₂₄O₆对细胞活力有一定影响，细胞活力为空白对照的96.11％，对细胞增殖的抑制率为3.89％，表现出较低的细胞毒性。进一步测试的半致死量，C₂₀H₂₄O₆对RAW264.7细胞的IC₅₀值为(35.06±6.08)μM/mL。

(2)Griess Reagent法检测NO含量

如图4所示，左侧为空白对照，右侧为使用100μM C₂₀H₂₄O₆处理小鼠巨噬细胞RAW264.724h。使用1μg/ml的LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7建立体外炎症模型，C₂₀H₂₄O₆能够抑制经LPS刺激的RAW264.7细胞产生NO的能力，与空白对照组相比具有显著性差异(P<0.01)。与空白对照组相比，C₂₀H₂₄O₆对NO的抑制率为80.83％。

(3)酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α、PGE₂含量

如图5、图6所示，使用1μg/ml的LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7建立体外炎症模型，同时用12.5、25、50、100μM的C₂₀H₂₄O₆处理小鼠巨噬细胞RAW264.7 24h，然后吸取细胞培养液，使用ELISA试剂盒测定各细胞培养液中TNF-α，PGE₂的含量。与空白对照组相比，50μM和100μM的C₂₀H₂₄O₆均能显著降低由LPS引起的TNF-α、PGE₂水平，与空白对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。

(4)蛋白质印迹法(Western Blot)检测iNOS、COX-2蛋白表达

如图7、图8所示，使用100μM C₂₀H₂₄O₆预处理小鼠巨噬细胞RAW264.7 0.5h，然后再使用1μg/ml的LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7，刺激0.5h后迅速收取细胞蛋白，使用WesternBlot方法检测iNOS、COX-2蛋白表达。结果表明C₂₀H₂₄O₆可以显著的下调由LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7产生的COX-2蛋白表达，抑制炎症的产生，起到抗炎的作用。

2、体内实验：

(1)酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清中IL-1β，IL-6含量

将健康昆明种小鼠16只适应性喂养1周后，按体重随机分为4个组,分别为Control组、LPS模型组、LPS+C₂₀H₂₄O₆组、阳性组(地塞米松)，每组各4只。对小鼠编号后称重，给药组每天采用灌胃给药的方式给予1mg/kg，Control组和LPS模型组每天口服灌胃等量生理盐水，阳性对照组以10mg/kg腹腔注射地塞米松，每天2次，连续给药7天，在第7天的最后一次给药后所有动物都禁食而不禁水。除正常对照组外，其它各组在第8天以15mg/kg的剂量一次性腹腔注射LPS,用于建立小鼠急性炎症模型。3h后立即进行用眼球取血,室温静置30min后,以4000r/min的速度离心10min取上清并分装后存于-80℃冰箱待用。采血后的动物颈椎脱臼处死并剖取小鼠的脾脏和胸腺，称重，保存于4％多聚甲醛溶液固定待用。

结果如图9所示，与空白对照组相比，模型组小鼠IL-1β显著升高(P<0.01)；与模型组相比，C₂₀H₂₄O₆组可以降低血清中IL-1β，对IL-6无明显作用。

(2)小鼠脾脏指数与胸腺指数检测

使用上一步采集的脾脏和胸腺进行脾脏指数与胸腺指数的检测。表2显示与空白对照组相比，模型组小鼠脾脏指数与胸腺指数升高；与模型组相比，给药组可以降低脾脏指数和胸腺指数，地塞米松组可以降低脾脏指数和胸腺指数。

表2. C₂₀H₂₄O₆对LPS诱导的急性炎症小鼠脾脏指数、胸腺指数影响(

n＝4)

胸腺指数，脏器指数(mg/g)＝脏器质量(mg)/体质量(g)

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (6)

1.一种毛菊苣木质素类提取物的制备方法，其特征在于，

所述毛菊苣木质素类提取物为C₂₀H₂₄O₆，C₂₀H₂₄O₆的结构式为：

包括以下步骤：

步骤（1）预处理：对毛菊苣根进行脱水处理；

步骤（2）醇冷提：用乙醇对脱水处理后的毛菊苣根进行浸泡处理，收集浸泡处理后的滤液；

步骤（3）浓缩：将步骤（2）中的滤液浓缩得稠浸膏；

步骤（4）萃取纯化：将稠浸膏分散到水中，得混悬液；使用正丁醇对混悬液进行萃取，取水层；使用乙酸乙酯对所述水层进行萃取，取乙酸乙酯层；将所述乙酸乙酯层浓缩得乙酸乙酯浸膏；

步骤（5）过柱纯化：将步骤（4）中的乙酸乙酯浸膏上硅胶柱Ⅰ，用氯仿和甲醇组成的混合物对硅胶柱Ⅰ进行梯度洗脱得洗脱液Ⅰ，将洗脱液Ⅰ蒸干得干粉Ⅰ；将所述干粉Ⅰ溶于甲醇后上硅胶柱Ⅱ，用氯仿和甲醇组成的混合物对硅胶柱Ⅱ进行梯度洗脱得洗脱液Ⅱ，将洗脱液Ⅱ蒸干的干粉Ⅱ；将干粉Ⅱ溶于甲醇后上ODS填料，甲醇洗脱得洗脱液Ⅲ，将洗脱液Ⅲ蒸干得干粉Ⅲ；将干粉Ⅲ溶于甲醇后上Sephadex LH-20填料，甲醇洗脱得洗脱液Ⅳ，将洗脱液Ⅳ蒸干得干粉Ⅳ；将干粉Ⅳ溶于甲醇后上硅胶柱Ⅲ，用氯仿和甲醇组成的混合物对硅胶柱Ⅲ进行梯度洗脱得洗脱液Ⅴ，将洗脱液Ⅴ蒸干得干粉Ⅴ；将所述干粉Ⅴ溶于甲醇后上ODS填料，甲醇洗脱后得洗脱液Ⅵ，将洗脱液Ⅵ蒸干得干粉Ⅵ，所述干粉Ⅵ为C₂₀H₂₄O₆；

在步骤（5）中，硅胶柱Ⅰ、硅胶柱Ⅱ和硅胶柱Ⅲ的孔径范围均为200～300目；硅胶柱Ⅰ的硅胶类型为硅胶H、硅胶G和硅胶HF中的任意一种；硅胶柱Ⅱ的硅胶类型为硅胶H、硅胶G和硅胶HF中的任意一种；硅胶柱Ⅲ的硅胶类型为硅胶H、硅胶G和硅胶HF中的任意一种；所述Sephadex LH-20填料的颗粒直径的范围18～111μm。

2.根据权利要求1所述的一种毛菊苣木质素类提取物的制备方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，对毛菊苣根进行脱水处理是采用晾干的方式，脱水处理后的毛菊苣根的含水量为1-10%。

3.根据权利要求2所述的一种毛菊苣木质素类提取物的制备方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，用脱水处理后的毛菊苣根的质量的3～5倍的95%乙醇对脱水处理后的毛菊苣根进行浸泡处理。

4.根据权利要求3所述的一种毛菊苣木质素类提取物的制备方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，用减压蒸馏装置在压力0～0.1 MPa和温度40～50℃的条件下，将步骤（2）中的滤液浓缩得稠浸膏；所述稠浸膏的浓度为0.1～0.4g/ml。

5.根据权利要求4所述的一种毛菊苣木质素类提取物的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，将1体积份的稠浸膏分散到3体积份的水中，得混悬液；使用1体积份的正丁醇对1体积份的混悬液进行萃取；使用1体积份的乙酸乙酯对1体积份的水层进行萃取。

6.根据权利要求5所述的一种毛菊苣木质素类提取物的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，在压强0.1～0.2MPa和温度40～80℃的条件下将所述乙酸乙酯层蒸馏浓缩得乙酸乙酯浸膏，所述乙酸乙酯浸膏的浓度为0.2～0.6g/ml。

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