CN103494848A

CN103494848A - 一种沙棘黄酮的提取方法及应用

Info

Publication number: CN103494848A
Application number: CN201310466687.3A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Nanjing Zhengliang Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Zhengliang Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date: 2013-10-09
Filing date: 2013-10-09
Publication date: 2014-01-08

Abstract

本发明提供一种沙棘黄酮的提取方法，采用超临界萃取和微波萃取制备而成，使得含量有很大提高，本发明还提供了提供沙棘黄酮在制备抑制C57BL/6小鼠纤维肉瘤细胞S180细胞增殖药物中的应用和制备增加骨密度药物中的应用。

Description

一种沙棘黄酮的提取方法及应用

技术领域

本发明涉及中药提取技术领域，具体涉及一种沙棘黄酮的提取方法及应用。

背景技术

植物沙棘为胡颓子科沙棘属，是一种落叶性灌木，其特性是耐旱，抗风沙，可以在盐碱化土地上生存，因此被广泛用于水土保持。国内分布于华北、西北、西南等地。沙棘为药食同源植物。沙棘的根、茎、叶、花、果，特别是沙棘果实含有丰富的营养物质和生物活性物质，可以广泛应用于食品、医药、轻工、航天、农牧鱼业等国民经济的许多领域。沙棘果实入药具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀之功效。现代医学研究，沙棘可降低胆固醇，缓解心绞痛发作，还有防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用。

沙棘黄酮是主要含异鼠李素（isorhamnetin）、异鼠李素-3-B-D-葡萄糖甙（isorhamnetin-3-B-D-glucoside）、异鼠李素-3-B-芸香糖甙（isorhamnetin-3-B-rutinoside）、槲角素及山奈酚的低糖甙（oligosides）。

现有技术中，尚未有沙棘黄酮在提取制备方面采用超临界和微波技术的联合应用报道，而目前的提取方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。

发明内容

发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种沙棘黄酮的提取方法。

本发明的另一个目的在于提供沙棘黄酮在制备抑制C57BL/6小鼠纤维肉瘤细胞S180细胞增殖药物中的应用和制备增加骨密度药物中的应用。

技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的：

一种沙棘黄酮的提取方法，取沙棘，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO₂流量1-3m1/g生药·min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍，得萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得沙棘黄酮提取物。

上述沙棘黄酮的提取方法，所述CO₂超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。

上述沙棘黄酮的提取方法，所述CO₂超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40℃，CO₂流量2ml/g生药·min，萃取时间160min。

上述沙棘黄酮的提取方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。

上述沙棘黄酮在制备抑制C57BL/6小鼠纤维肉瘤细胞S180细胞增殖药物中的应用，沙棘黄酮的提取步骤为：取沙棘，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO₂流量1-3m1/g生药·min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍，得萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得沙棘黄酮提取物。

上述沙棘黄酮在制备抑制C57BL/6小鼠纤维肉瘤细胞S180细胞增殖药物中的应用，沙棘黄酮的提取方法中所述CO₂超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，所述CO₂超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40℃，CO₂流量2ml/g生药·min，萃取时间160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。

上述沙棘黄酮在制备增加骨密度药物中的应用，沙棘黄酮的提取步骤为：取沙棘，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO₂流量1-3m1/g生药·min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍，得萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得沙棘黄酮提取物。

上述沙棘黄酮在制备增加骨密度药物中的应用，沙棘黄酮的提取方法中所述CO₂超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，所述CO₂超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40℃，CO₂流量2ml/g生药·min，萃取时间160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。

现有技术中，沙棘黄酮采用醇提的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，本发明制备的沙棘黄酮中异鼠李素得率增加，含量高，纯度达53-56%，现有技术未发现其在制备抑制C57BL/6小鼠纤维肉瘤细胞S180细胞增殖药物中的应用和制备增加骨密度药物中的应用，表明本品有希望做成这样的药物。

具体实施方式

以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

取沙棘1000g，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力15MPa，温度30℃，CO₂流量1m1/g生药·min，萃取时间150min，得超临界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400W，萃取2次，每次4分钟，每次加入的70%乙醇量为2000g，得萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得沙棘黄酮提取物，经高效液相色谱法测定异鼠李素的含量为53.6%。

实施例2

取沙棘1000g，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，温度50℃，CO₂流量3m1/g生药·min，萃取时间180min，得超临界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分钟，每次加入的70%乙醇量为2000g，得萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得沙棘黄酮提取物，经高效液相色谱法测定异鼠李素的含量为54.3%。

实施例3

取沙棘1000g，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力20MPa，温度40℃，CO₂流量2m1/g生药·min，萃取时间160min，得超临界萃取物，再加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次6分钟，每次加入的70%乙醇量为2000g，得萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得沙棘黄酮提取物，经高效液相色谱法测定异鼠李素的含量为55.2%。

上述实施例中沙棘为胡颓子科多年生灌木或乔木植物沙棘Hippophae rhamnoidesLinn.的果实。

实施例4：沙棘黄酮抑制C57BL/6小鼠纤维肉瘤细胞S180细胞增殖的实验研究资料

1实验材料

1.1实验用细胞株

C57BL/6小鼠纤维肉瘤细胞（S180），南京正亮医药科技有限公司实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。

1.2实验药物

研究药物：本发明沙棘黄酮：按实施例3方法制备。

药液储液：称取100mg沙棘黄酮，溶于5ml无水乙醇中，0.2μm滤器过滤，500μldoff管分装，-20℃存储，同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。

1.3实验试剂

DMEM（GIBCO公司Cat.No.12100-061Lot.No.758137）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419）；NaHCO3（上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033Lot.No.1088387）；Trypsin（AMRESCO公司批号：2010/04）；EDTA（AMRESCO公司批号：2009/10）；Penicillin G Sodium Salt（AMRESCO公司批号：2010242）；Streptomycin Sulfate（AMRESCO公司批号：2010382）；无水乙醇（南京化学试剂有限公司批号：080310182）；MTT(Biosharp批号：0793);PBS（实验室自配）；1.4实验器材

莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DM1L）；可见-紫外光微孔板检测仪（美国MD公司型号：SPECTRA MAX190）；CO2培养箱（FORMA型号：3111）；超净台（苏净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD）；纯水仪（美国Spring公司型号：S/N020579）；精密移液器（法国吉尔森公司型号：P2）；电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S）；全自动高压灭菌锅（日本SANYO公司型号：MLS-3020）；台式电热鼓风干燥箱（上海精密实验设备公司型号：DHG9123A）；冰箱（西门子公司型号：KG18V21TI）；液氮罐（CBS型号：2001）；低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000）；0.2μm滤器（MILLIPORE型号：SLGP033RB）；10cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。

2实验方法

1）S180细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%CO2进行常规培养（10cm培养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37℃消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3×104个/ml。

2）将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μl，培养板放入细胞培养箱中（37℃，5%CO2）常规培养。

3）根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入得生片溶液，继续培养24h。

4）24h后加入20μl MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。

5）4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。6）同时设置本底（不加细胞，只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。

7）结果以药物对细胞的抑制率表示：

细胞增值抑制率（%）=（对照孔OD值-给药孔OD值）/对照孔OD值×100%。实验重复3次。

3统计处理

采用Microsoft Excel2003软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean±S.D.表示。

4实验结果

MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对S180细胞增殖抑制有差异（P<0.05），剂量在10mg/ml时该差异具有显著性（P<0.01），当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异（P<0.001）。

表1沙棘黄酮对S180细胞增殖抑制影响研究

注：与对照组比较，*P<0.05；**P<0.01

5实验结论

沙棘黄酮可以抑制S180细胞增殖，减少S180细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。

实施例5：对实验动物的骨密度的影响的药效学研究

1样品制备

本发明沙棘黄酮：按实施例3方法制备。珍壮肾骨胶囊，山东会仙药业集团有限公司，批号：20120711。维A酸片，山东良福制药有限公司，批号：130120

2动物

Wistar大鼠，雄性，体重180-240g，上海斯莱克实验动物有限公司提供。

3实验分组及骨质疏松大鼠模型的建立

取正常Wistar大鼠30只随机分为5组，取其中6只为NS组；取其中6只作为模型组，单纯按维A酸70mg/kg灌胃两周；取其中6只作为珍壮肾骨胶囊对照组；剩余的12只大鼠作为本发明高低剂量组。作为珍牡肾骨胶囊对照组和本发明高、低剂量组按70mg/kg的剂量灌服维A酸的同时灌服相应的药物，灌服两周后停服维A酸继续给药两周测定各项指标。大鼠断头处死，取其股骨按组排列，使用X-线乳腺摄像机摄制光片，用黑白密度计于股骨的大转子、股骨头、股骨颈、转子间线上及转子间线下5部位定点测定并记录骨密度值。

本发明对大鼠骨密度的影响

注：与模型组比较，*P<0.05；**P<0.01

4实验结果

本发明与模型组比较，具有显著性差异，说明本发明能提高骨密度，治疗骨折，而且效果优于珍壮肾骨胶囊，可用于制备增加骨密度药物中的应用。

Claims

1.一种沙棘黄酮的提取方法，其特征在于取沙棘，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO₂流量1-3m1/_g生药·min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍，得萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得沙棘黄酮提取物。

2.根据权利要求1所述一种沙棘黄酮的提取方法，其特征在于所述CO₂超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。

3.根据权利要求1所述一种沙棘黄酮的提取方法，其特征在于所述CO₂超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40℃，CO₂流量2ml/g生药·min，萃取时间160min。

4.根据权利要求1所述一种沙棘黄酮的提取方法，其特征在于所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。

5.根据权利要求1所述一种沙棘黄酮在制备抑制C57BL/6小鼠纤维肉瘤细胞S180细胞增殖药物中的应用，其特征在于沙棘黄酮的提取步骤为：取沙棘，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO₂流量1-3m1/g生药·min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍，得萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得沙棘黄酮提取物。

6.根据权利要求5所述一种沙棘黄酮在制备抑制C57BL/6小鼠纤维肉瘤细胞S180细胞增殖药物中的应用，其特征在于沙棘黄酮的提取方法中所述CO₂超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，所述CO₂超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40℃，CO₂流量2ml/g生药·min，萃取时间160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。

7.根据权利要求1所述一种沙棘黄酮在制备增加骨密度药物中的应用，其特征在于沙棘黄酮的提取步骤为：取沙棘，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO₂流量1-3m1/g生药?min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，加入70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍，得萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得沙棘黄酮提取物。

8.根据权利要求7所述一种沙棘黄酮在制备增加骨密度药物中的应用，其特征在于沙棘黄酮的提取方法中所述CO₂超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，所述CO₂超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40℃，CO₂流量2ml/g生药·min，萃取时间160min，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。