CN103483309B - 一种胡椒碱的提取方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种胡椒碱的提取方法,采用超临界萃取和微波萃取制备而成,使得含量有很大提高,本发明还提供了提供胡椒碱在制备抑制人宫颈癌细胞HELA细胞增殖药物中的应用和制备增加骨密度药物中的应用。

Description

_种胡椒碱的提取方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及中药提取技术领域,具体涉及一种胡椒碱的提取方法及应用。
背景技术
[0002] 胡椒碱是一种广谱抗惊厥药,对小鼠实验性电惊厥有良好的对抗作用,对戊四氮、 印防己毒素、士的宁,以及脑室内注射筒箭毒碱、谷氨酸等引起的惊厥发作和听源性发作, 都有不同程度的对抗作用。对某些类型的癫痫病也有疗效。胡椒碱对蝇类的毒性比除虫菊 尚。
[0003] 现有技术中,尚未有胡椒碱在提取制备方面采用超临界和微波技术的联合应用报 道,而目前的提取方法,工艺粗糙、落后,杂质多,导致患者用量过大,不方便服用,严重影响 了本品在临床上应用。
发明内容
[0004] 发明目的:为了解决上述问题,本发明的目的在于提供一种胡椒碱的提取方法。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供胡椒碱在制备抑制人宫颈癌细胞HELA细胞增殖药 物中的应用和制备增加骨密度药物中的应用。
[0006] 技术方案:本发明的目的是通过如下的方案实现的:
[0007] -种胡椒碱的提取方法,取胡椒,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹 带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%,萃取压力15-30MPa,温度30-50°(3,〇) 2流量1-31111/ g生药· min,萃取时间150-180min,得超临界萃取物,加入70%乙醇,投入微波萃取装置中进 行微波萃取,萃取功率400-600W,萃取2次,每次4-8分钟,每次加入的70%乙醇的量为药材重 量的2倍,得萃取液,浓缩,加到DlOl大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗 脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得胡椒碱提取物。
[0008] 上述胡椒碱的提取方法,所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比 为5%。
[0009] 上述胡椒碱的提取方法,所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa,温度40°(3,〇)2流量 2ml/g生药· min,萃取时间160min。
[0010] 上述胡椒碱的提取方法,所述微波萃取功率500W,每次萃取6分钟。
[0011] 上述胡椒碱在制备抑制人宫颈癌细胞HELA细胞增殖药物中的应用,胡椒碱的提取 步骤为:取胡椒,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积 百分比为4-6%,萃取压力15-30MPa,温度30-50°C,C〇2流量l_3ml/g生药· min,萃取时间 150-180min,得超临界萃取物,加入70%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率 400-600W,萃取2次,每次4-8分钟,每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍,得萃取液,浓 缩,加到DlOl大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓 缩并干燥,得胡椒碱提取物。
[0012] 上述胡椒碱在制备抑制人宫颈癌细胞HELA细胞增殖药物中的应用,胡椒碱的提取 方法中所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%,所述CO2超临界萃取的 萃取压力20MPa,温度40°C,C02流量2ml/g生药· min,萃取时间160min,所述微波萃取功率 500W,每次萃取6分钟。
[0013] 上述胡椒碱在制备增加骨密度药物中的应用,胡椒碱的提取步骤为:取胡椒,加入 到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%,萃取 压力15-30MPa,温度30-50°C,C0 2流量l-3ml/g生药· min,萃取时间150-180min,得超临界 萃取物,加入70%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率400-600W,萃取2次,每 次4-8分钟,每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍,得萃取液,浓缩,加到DlOl大孔吸附 树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得胡椒碱提 取物。
[0014] 上述胡椒碱在制备增加骨密度药物中的应用,胡椒碱的提取方法中所述CO2超临 界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%,所述CO 2超临界萃取的萃取压力20MPa,温 度40°C,CO2流量2ml/g生药· min,萃取时间160min,所述微波萃取功率500W,每次萃取6分 钟。
[0015] 现有技术中,胡椒碱采用醇提的方法,工艺粗糙、落后,杂质多,导致患者用量过 大,不方便服用,本发明制备的胡椒碱得率增加,含量高,纯度达98-99%,现有技术未发现其 在制备抑制人宫颈癌细胞HELA细胞增殖药物中的应用和制备增加骨密度药物中的应用,表 明本品有希望做成这样的药物。
具体实施方式
[0016] 以下通过实施例形式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明,但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例,凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。
[0017] 实施例!
[0018] 取胡椒1000 g,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂 的体积百分比为4%,萃取压力15MPa,温度30°C,C0 2流量lml/g生药· min,萃取时间150min, 得超临界萃取物,再加入70%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率400W,萃取 2次,每次4分钟,每次加入的70%乙醇量为2000g,得萃取液,浓缩,加到DlOl大孔吸附树脂柱 上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得胡椒碱提取物, 经高效液相色谱法测定胡椒碱的含量为98.4%。
[0019] 实施例2
[0020] 取胡椒1000 g,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂 的体积百分比为6%,萃取压力30MPa,温度50°C,C0 2流量3ml/g生药· min,萃取时间180min, 得超临界萃取物,再加入70%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率600W,萃取 2次,每次8分钟,每次加入的70%乙醇量为2000g,得萃取液,浓缩,加到DlOl大孔吸附树脂柱 上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得胡椒碱提取物, 经高效液相色谱法测定胡椒碱的含量为98.5%。
[0021] 实施例3
[0022]取胡椒1000 g,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂 的体积百分比为5%,萃取压力20MPa,温度40°C,C02流量2ml/g生药· min,萃取时间160min, 得超临界萃取物,再加入70%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率500W,萃取 2次,每次6分钟,每次加入的70%乙醇量为2000g,得萃取液,浓缩,加到DlOl大孔吸附树脂柱 上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得胡椒碱提取物, 经高效液相色谱法测定胡椒碱的含量为99.1%。
[0023]上述实施例中胡椒为胡椒科植物胡椒Piper nigrum L.的干燥近成熟或成熟果 实。
[0024] 实施例4:胡椒碱抑制人宫颈癌细胞HELA细胞增殖的实验研究资料
[0025] 1实验材料
[0026] 1.1实验用细胞株
[0027] 人宫颈癌细胞(HELA),南京正亮医药科技有限公司实验室细胞库,DMEM+10%FBS常 规培养。
[0028] 1.2实验药物
[0029] 研究药物:本发明胡椒碱:按实施例3方法制备。
[0030] 药液储液:称取IOOmg胡椒碱,溶于5ml无水乙醇中,0.2μηι滤器过滤,500μ1 doff管 分装,-20°C存储,同时0.2μπι滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0031] 1.3实验试剂
[0032] DMEM(GIBC0公司Cat .No · 12100-061Lot .No · 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科 技有限公司Lot. No. 100419) ;NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司0&1心.11810-033Lot .No · 1088387) ; TrypsinUMRES⑶公司批号:2010/04) ;EDTA(AMRESC0公司批号: 2009/10);Penicillin G Sodium SaltUMRESCO 公司批号:2010242);Streptomycin Sulfate(AMRESC0公司批号:2010382);无水乙醇(南京化学试剂有限公司批号: 080310182) ;MTT(Biosharp批号:0793); PBS(实验室自配);1.4实验器材
[0033]莱卡倒置显微镜(德国Leica型号:DMlL);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司 型号:SPECTRA MAX190);C02培养箱(FORMA型号:3111);超净台(苏净集团安泰公司制造型 号:SW-CJ-ΖΠ));纯水仪(美国Spring公司型号:S/N020579);精密移液器(法国吉尔森公司 型号:P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号:BT323S);全自动高压灭菌锅(日本SANYO 公司型号:MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号:DHG9123A);冰箱 (西门子公司型号:KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂 型号:KA-1000) ; 0 · 2μπι滤器(MILLIP0RE型号:SLGP033RB) ; IOcm培养皿(NEST公司)、96孔培 养板(NEST公司);细胞计数板;离心管、移液管、Tips若干。
[0034] 2实验方法
[0035] 1)HELA细胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02进行常规培养(10cm培养皿),当细胞生 长至对数期时,收集细胞,弃去培养液,PBS轻洗3遍,加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37 °C消化2min后,向其中加入5ml完全培养基中和反应,吹打细胞后将其转入离心管中, 1000 rpm离心5min,调整细胞悬液浓度3 X 104个/ml。
[0036] 2)将细胞种入96孔培养板中,每孔加入细胞悬液180μ1,培养板放入细胞培养箱中 (37°C,5%C02)常规培养。
[0037] 3)根据细胞生长情况,一般长至50%_70%,加入得生片溶液,继续培养24h。
[0038] 4)24h 后加入 20μ1 MTT 溶液(5mg/ml,即 0.5%MTT),继续培养 4h。
[0039] 5)4h后扣板法倒去上清,用吸水纸轻轻拍干,每孔加入200μ1二甲基亚砜,置摇床 上低速振荡l〇min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0040] 6 )同时设置本底(不加细胞,只加培养液),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定6个复孔。
[0041 ] 7)结果以药物对细胞的抑制率表示:
[0042] 细胞增值抑制率(%)=(对照孔OD值-给药孔OD值)/对照孔OD值X 100%。实验重复3 次。
[0043] 3统计处理
[0044] 米用Microsoft Excel2003软件中的相关分析和Student t检验,数据以mean土 S.D.表示。
[0045] 4实验结果
[0046] MTT法实验后统计结果显示,与对照组比较,当剂量达到5mg/ml时,对HELA细胞增 殖抑制有差异(P〈〇.〇5),剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(?〈0.01),当剂量达到15_ 20mg/ml时有极显著性差异(P〈0.001)。
[0047] 表1胡椒碱对HELA细胞增殖抑制影响研究(¾ SD)
Figure CN103483309BD00061
[0049] 注:与对照组比较,*P〈0.05 ;,〈0.01
[0050] 5实验结论
[0051]胡椒碱可以抑制HELA细胞增殖,减少HELA细胞的细胞生长数目,该作用呈剂量依 赖性。
[0052 ]实施例5:对实验动物的骨密度的影响的药效学研究 [0053] 1样品制备
[0054] 本发明胡椒碱:按实施例3方法制备。珍壮肾骨胶囊,山东会仙药业集团有限公司, 批号:20120711。维A酸片,山东良福制药有限公司,批号:130120
[0055] 2 动物
[0056] Wistar大鼠,雄性,体重180_240g,上海斯莱克实验动物有限公司提供。
[0057] 3实验分组及骨质疏松大鼠模型的建立
[0058]取正常Wistar大鼠30只随机分为5组,取其中6只为NS组;取其中6只作为模型组, 单纯按维A酸70mg/kg灌胃两周;取其中6只作为珍壮肾骨胶囊对照组;剩余的12只大鼠作为 本发明高低剂量组。作为珍牡肾骨胶囊对照组和本发明高、低剂量组按70mg/kg的剂量灌服 维A酸的同时灌服相应的药物,灌服两周后停服维A酸继续给药两周测定各项指标。大鼠断 头处死,取其股骨按组排列,使用X-线乳腺摄像机摄制光片,用黑白密度计于股骨的大转 子、股骨头、股骨颈、转子间线上及转子间线下5部位定点测定并记录骨密度值。
[0059]本发明对大鼠骨密度的影响
Figure CN103483309BD00071
LUU61」 汪:与模型组比较ΓΡ<0 · 05厂'P<0 · 01 [0062] 4实验结果
[0063]本发明与模型组比较,具有显著性差异,说明本发明能提高骨密度,治疗骨折,而 且效果优于珍壮肾骨胶囊,可用于制备增加骨密度药物中的应用。

Claims (2)

1. 一种胡椒碱提取物在制备增加骨密度药物中的应用,其特征在于胡椒碱提取物的提 取步骤为:取胡椒,加入到CO 2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体 积百分比为4-6%,萃取压力15-30MPa,温度30-50°C,C0 2流量l-3ml/g生药· min,萃取时间 150-180min,得超临界萃取物,加入70%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功 率400-600W,萃取2次,每次4-8分钟,每次加入的70%乙醇的量为药材重量的2倍,得萃取 液,浓缩,加到DlOl大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收 乙醇,浓缩并干燥,得胡椒碱提取物。
2. 根据权利要求1所述一种胡椒碱提取物在制备增加骨密度药物中的应用,其特征在 于胡椒碱的提取方法中所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%,所述 CO2超临界萃取的萃取压力20MPa,温度40°C,C02流量2ml/g生药· min,萃取时间160min,所 述微波萃取功率500W,每次萃取6分钟。
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