CN114948855B - 一种鼻腔给药野黄芩苷镁温度敏感原位凝胶制剂及其制备方法 - Google Patents

一种鼻腔给药野黄芩苷镁温度敏感原位凝胶制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种鼻腔给药野黄芩苷镁温敏原位凝胶及其制备方法，是以野黄芩苷镁为原料药，采用泊洛沙姆407和泊洛沙姆P188为基质，羟丙基‑β‑环糊精为吸收促进剂，各组分的质量浓度为：野黄芩苷镁0.5％～15％，泊洛沙姆407 17％～25％，泊洛沙姆188 0％～2％，羟丙基‑β‑环糊精0％或0.5％。制备方法：取处方量的泊洛沙姆407和泊洛沙姆188，置于50mL烧杯中，加入纯水10mL，搅拌溶解。在4℃下存放24h以上，得到空白凝胶基质；再取处方量的野黄芩苷镁和羟丙基‑β‑环糊精(也可以不加)，置于空白凝胶基质中，在常温下搅拌，直至野黄芩苷镁全部溶解，放入4℃冰箱24h得到野黄芩苷镁温敏型原位凝胶。本发明的野黄芩苷镁温敏原位凝胶鼻腔给药后，使得野黄芩苷镁在脑组织的浓度显著提高。

Description

一种鼻腔给药野黄芩苷镁温度敏感原位凝胶制剂及其制备 方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种鼻腔给药野黄芩苷镁温度敏感原位凝胶的制备方法。
背景技术
心脑血管疾病是由于血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压、高脂血症等导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病，具有“发病率高、复发率高、死亡率高、致残率高和并发症多”即“四高一多”等特点。目前心脑血管疾病已成为我国第一位疾病死亡原因，严重威胁了我国人民的健康。
心脑血管疾病包括心血管和脑血管疾病。脑卒中是一类急性的脑血管疾病，其发病后，由于脑组织坏死或发生缺血缺氧损伤，常引起循环系统、消化系统和呼吸系统等多种系统的并发症。根据病理特点脑卒中主要分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中。其中缺血性脑卒中的发病率较高，占脑卒中患者的80％-85％。缺血性脑卒中后脑内产生的病理生理过程包括炎症反应的激活、自由基产物的堆积、兴奋毒性、细胞Na+和Ca2+内流中断、酶活性的改变、内皮素的释放、血小板和白细胞的激活以及内皮功能紊乱等，这些过程都会造成脑损伤，从而引起认知功能障碍。缺血性脑卒中患者常伴有言语不利、吞咽困难、肢体运动障碍、二便失禁及情绪异常等后遗症，导致患者的家庭及医疗保健系统都面临着巨大的压力。对于缺血性脑卒中的治疗，以往的单纯西药治疗有一定局限性。随着中医中药的发展，中药治疗取得了显著效果。目前临床上用于缺血性脑卒中的常见中药有丹参和灯盏花等。
灯盏花素是从灯盏花中分离的黄酮类有效成分。灯盏乙素，又名野黄芩苷，是灯盏花素的主要药效成分，含量占95％以上。在临床上，灯盏花素用于治疗缺血性脑卒中具有良好的效果，可显著改善缺血性脑卒中患者神经功能，降低全身炎症反应和致残率。药理学研究表明野黄芩苷具有改善微循环、扩张血管、降低外周血管阻力、抗血小板聚集及抑制血栓形成，还可以抗氧自由基、抗钙内流、抑制和防止脑缺血神经元凋亡，从而保护脑神经等作用。分子机制研究表明野黄芩苷通过抑制NF-κB和p38/JNK信号通路来抑制促炎性介质(NO、氧自由基等)的产生，抑制小胶质细胞过度反应，进而减小脑梗死面积，减轻神经功能损伤，进而起到脑保护作用。然而，由于灯盏花乙素脂溶性和水溶性差，口服制剂生物利用度小于6％，因此近年在改善灯盏花乙素制剂工艺、提高其生物利用度方面的研究受到高度重视，取得大量技术成果，主要包括将灯盏花乙素制备成钠盐结晶、固体分散体、环糊精包合物、磷脂复合物、纳米粒等。但是，上述这些新制剂技术，钠盐结晶技术只能够增加溶解度，不能提高野黄芩苷的临床效果，固体分散体、环糊精包合物、磷脂复合物、纳米粒虽能一定程度提高灯盏花乙素口服制剂的溶解度和临床效果，但也存在制造工艺复杂、成本高、流程长的缺点。
针对上述提高野黄芩苷生物利用度的技术存在的问题，结合已有研究证实镁离子具有抗缺血再灌注损伤的药理作用，Mg2+参与脑缺血损伤后的兴奋性氨基酸的细胞毒作用、 Ca2+超载、过度的级联炎性反应、氧自由基及脂质过氧化及细胞凋亡等神经损伤的多种途径，进而改善缺血后脑神经元损伤。课题组前期研究已经采用适当的实验方法，得到野黄芩苷镁(纯度在90％以上)，其溶解度显著高于野黄芩苷，而且初步的药效学研究证实注射给药后，在抗大鼠脑缺血再灌注损伤方面，野黄芩苷镁盐的药效明显优于野黄芩苷，提示野黄芩苷镁替代野黄芩苷用于缺血性脑卒中疾病的治疗具有较大的潜力。
目前，市场上灯盏花素的主要剂型有口服片剂和注射剂。然而，药物经口服给药时，容易受到胃肠道内的稳定性和肝脏首过效应的影响，导致生物利用度降低；而注射给药需专业的医护人员操作，而且给药次数较频繁，患者依从性差。因此，探索野黄芩苷镁科学有效的给药途径和剂型，使野黄芩苷镁到达脑内的浓度增加，提高野黄芩苷镁的生物利用度，进而提高其对缺血性脑卒中的作用效果，是本论文要解决的主要科学问题。
鼻腔给药是一种非侵入性且方便的方法，药物经鼻腔黏膜吸收后能够发挥局部和全身治疗作用，而且不同于静脉、肌注及皮下给药等有创操作，患者能实现自我给药，依从性更好。药物通过鼻腔黏膜吸收的途径有嗅通路、三叉神经通路和血液循环通路，其中嗅通路和三叉神经通路可使药物绕过血脑屏障进入脑内。在嗅通路中，药物可以从嗅神经神经元轴突被运送到到嗅球，再被分布到脑实质，药物也可以通过嗅神经束周期间隙转运到脑脊液中。而血液循环通路可使药物避免肝脏首过效应，直接进入血液循环发挥药物作用。因此，药物经鼻腔给药不仅有利于提高药物的生物利用度，而且能够增加药物向脑内递释，使其在治疗脑部疾病方面具有优势。
传统鼻腔给药剂型有气雾剂、喷雾剂和粉雾剂等，随着科技的发展，一些新的工艺和剂型被引入这个领域中，如脂质体、微球和纳米粒等，但是这些剂型都存在药物易被鼻纤毛清除，药物生物利用度低的缺点。原位凝胶是一种新型的给药系统，以溶液状态给药后，由于环境条件刺激(如光、温度、pH值、亲疏水性、离子强度等因素)使其立即在用药部位发生相变，由液态转化形成半固体凝胶，其具有一定的黏附性和组织相容性，延长药物在鼻腔的滞留时间。研究证实将灯盏花素制成鼻用温敏型原位凝胶，研究其对脑梗死的作用，研究结果表明该制剂对脑缺血确有改善作用，且优于静脉注射。而且以注射给药为对照，于灯盏乙素鼻腔给药后一定时间测定灯盏乙素在大鼠脑脊液、脑组织和血中药物含量，结果发现相等剂量给药下，灯盏乙素鼻腔给药后嗅球、嗅区、脑脊液的AUC0～240分别为静注的5.54，5.07，5.51倍,其他脑组织的AUC0～240均大于静注。灯盏乙素鼻腔给药后各脑组织的AUCbrain/AUCplasma均显著高于静注给药，表明灯盏乙素鼻腔给药后药物可绕过血脑屏障而直接转运入脑，在脑组织中的分布具有明显的靶向性。但是由于鼻腔的生理结构，鼻用制剂的单次用剂量有限，而灯盏花素的溶解度低，使其鼻用制剂具有一定的局限性。野黄芩苷镁溶于水，能够保证鼻腔给药体积在满足治疗要求的同时也符合鼻腔可接纳药物的许可体积。因此，将野黄芩苷镁制成鼻用原位凝胶可能是提高其生物利用度和脑内浓度的一条有效药剂学策略。
综上所述，本论文将设计并制备野黄芩苷镁鼻用原位凝胶剂，通过比较野黄芩苷镁分别经注射、口服和鼻腔给药后，同等剂量的野黄芩苷镁在正常大鼠体内的血药浓度和脑内浓度，探索野黄芩苷镁在同时提高生物利用度和脑内分布的优势给药途径，以期为野黄芩苷镁用于治疗缺血性脑卒中的剂型开发提供实验数据，为其进行深入的治疗缺血性脑卒中的药效学研究提供基础。
发明内容
本发明目的是提供一种鼻腔给药野黄芩苷镁温度敏感原位凝胶，该原位凝胶具有在室温下为液体状态，在鼻腔生理环境下形成半固体的凝胶；野黄芩苷镁的释放呈现一定的缓释特征；提高野黄芩苷镁生物利用度和增加野黄芩苷镁在脑组织中的递送量的特点。
本发明的另一个目的是提供一种鼻腔给药野黄芩苷镁温度敏感原位凝胶的制备方法，为实现上述目的，本发明提供了下述技术方案。
本发明提供一种野黄芩苷镁鼻腔温敏原位凝胶，包括如下组分：野黄芩苷镁0.5％～15％、泊洛沙姆407的质量分数17％～25％，优选地，19％；泊洛沙姆188的质量分数0％～2％，优选地，0.5％；溶剂为去离子水。
本发明提供另一种野黄芩苷镁鼻腔温敏原位凝胶，包括如下组分：野黄芩苷镁0.5％～15％、泊洛沙姆407的质量分数17％～25％，优选地，19％；泊洛沙姆188的质量分数0％～2％，优选地，0.5％；羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)的质量分数0.5％或1.0％，优选地0.5％，溶剂为去离子水。
本发明还提供了所述的一种野黄芩苷镁鼻腔温敏原位凝胶的制备方法，步骤如下：
(1)分别精密称取处方量的泊洛沙姆温度敏感凝胶基质，加入去离子水中，搅拌溶解。在4℃环境下存放24h以上，充分溶胀，得到澄清、无气泡、无团块的空白凝胶基质；
(2)在步骤(1)得到的空白凝胶基质中加入野黄芩苷镁，在常温下搅拌混匀，直至野黄芩苷镁全部溶解，放入4℃冰箱24h得到野黄芩苷镁温敏型原位凝胶；
本发明还提供了所述的另一种野黄芩苷镁鼻腔温敏原位凝胶的制备方法，步骤如下：
(1)分别精密称取处方量的泊洛沙姆温度敏感凝胶基质，加入去离子水中，搅拌溶解。在4℃环境下存放24h以上，充分溶胀，得到澄清、无气泡、无团块的空白凝胶基质；
(2)在步骤(1)得到的空白凝胶基质中加入野黄芩苷镁和HP-β-CD，在常温下搅拌混匀，直至野黄芩苷镁全部溶解，放入4℃冰箱24h得到野黄芩苷镁温敏型原位凝胶；
根据本发明，所述的室温为22℃～25℃，搅拌过程使用的设备是智能数显磁力(加热锅)搅拌器，该设备要求智能数显控温(内外控温)，搅拌速度为200～1000r/min。
所述的原位凝胶在室温下为黄色、透明、澄清的溶液，pH值为6.74～6.95，胶凝温度为29℃～34℃。
本发明的有益效果体现在以下几方面：
(1)本发明所用的泊洛沙姆407、泊洛沙姆188和HP-β-CD具有良好的生物相容性和生物安全性。
(2)本发明所提供的原位凝胶制备工艺稳定、可行，操作简便。
(3)本发明中野黄芩苷镁在原位凝胶中的质量分数为0.5％～15％时，在常温下均可以得到透明澄清的溶液，而且在29℃～34℃下均可以形成凝胶。
(4)体外释放研究结果表明，本发明制备的野黄芩苷镁原位凝胶剂有效地实现了药物的缓慢释放，而且凝胶的释放以溶蚀为主，在8h后基本实现药物完全释放。
(5)体内研究结果发明，本发明制备的野黄芩苷镁原位凝胶剂，通过鼻腔给药的方式提高了野黄芩苷镁的生物利用度及其在脑组织中的递送量，而且具有明显的脑靶向性。
附图说明
图1为实施例1所制备的野黄芩苷镁温敏原位凝胶的黏度-温度曲线；
图2为实施例1所制备的野黄芩苷镁温敏原位凝胶振荡稀释法的体外释放度曲线；
图3为实施例1所制备的野黄芩苷镁温敏原位凝胶溶蚀曲线；
图4为实施例1所制备的野黄芩苷镁温敏原位凝胶无膜溶出法的释放曲线；
图5为实施例1所制备的野黄芩苷镁温敏原位凝胶溶蚀率-释药率的相关性曲线；
图6为实施例1所制备的野黄芩苷镁温敏原位凝胶血药浓度-时间曲线；
图7为实施例1所制备的野黄芩苷镁温敏原位凝胶在不同时间点的脑组织中浓度；
图8为实施例1所制备的野黄芩苷镁温敏原位凝胶脑内浓度-时间曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例式性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1：野黄芩苷镁温敏原位凝胶的制备
(1)野黄芩苷镁温敏原位凝胶(Scu-Mg-NG)的制备
采用冷溶法制备空白凝胶基质。首先，分别精密称取适量的泊洛沙姆407(P407)和泊洛沙姆188(P188)，置于烧杯中，加入去离子水10mL，搅拌溶解。在4℃环境下存放24h以上，充分溶胀，得到澄清、无气泡、无团块的空白凝胶基质。加入处方量的野黄芩苷镁，在常温下搅拌混匀，直至野黄芩苷镁全部溶解，在4℃下，静置24h，得到 Scu-Mg-NG。
(2)胶凝温度(T)的测定
采用搅拌子法测定。将温度计插入装有原位凝胶的烧杯中，温度探头完全浸没在原位凝胶溶液中，将其放在可水浴加热的磁力搅拌器上，转速为200r/min，缓慢升温，磁力搅拌子完全停止转动的温度即为T。
(3)Scu-Mg-NG的处方优化
1)单因素考察
A.P407浓度对胶凝温度的影响
本实验选择P407的质量分数分别为17％，19％，21％，23％，25％，制备Scu-Mg-NG，测定胶凝温度。结果质量分数范围为17％～21％。
B.P188浓度对胶凝温度的影响
固定P407质量浓度为19％，选择P188的质量分数分别为0％，1％，2％，制备Scu-Mg-NG，测定胶凝温度。确定质量分数范围为0％～1％。
2)星点设计-效应面法
A.试验设计
应用Design-Expert10软件设计试验，按照(1)项下方法制备Scu-Mg-NG。以胶凝温度(T)为响应值，P407质量分数(A)和P188质量分数(B)为考察因素。由单因素试验结果，选取A的范围为17％～21％，B的范围为0％～1％。根据星点设计-效应面法原理，每个因素设置五个水平，本实验仅考察两因素，因此代码值分别为：±1.414，±1，0。
表1效应面设计因素与水平
因素 水 平
符号 -1.414 -1 0 +1 +1.414
A 17 17.58 19 20.42 21
B 0 0.15 0.5 0.85 1
B.模型拟合
采用Design-Expert10软件对P407和P188质量分数范围与T进行回归分析，得到拟合方程；绘制二维等高线图和三维效应面图。根据鼻腔生理温度为29℃～34℃，确定预测的最优处方为P407质量分数为19％，P188质量分数为0.5％。
表2实验设计及响应值
表3二项式方程拟合模型方差分析结果
方差来源 SS f MS F值 p值
模型 217.51 5 43.50 62.04 <0.0001
A 179.74 1 179.74 256.35 <0.0001
B 7.10 1 7.10 10.12 0.0155
AB 1.00 1 1.00 1.43 0.2713
A2 27.83 1 27.83 39.68 0.0004
B2 0.43 1 0.43 0.62 0.4568
C.处方验证
按照预测的最优处方平行制备3批Scu-Mg-NG，测定T。结果见下表。
表4处方验证结果
样品 预测值(℃) 实测值(℃) 平均值(℃)
1 30 30
2 30 31 30.33±0.57
3 30 30
D.确定的最优处方
表5处方组成
处方组成 质量分数(％，g/100mL)
野黄芩苷镁 10
P407 19
P188 0.5
(4)HP-β-CD浓度的优选
采用最优处方，按照(1)项下方法制备空白凝胶基质，然后加入HP-β-CD和处方量的野黄芩苷镁，制成含有吸收促进剂的原位凝胶Scu-Mg-NG-H，通过考察HP-β-CD浓度(0.5％，1％)对其胶凝温度的影响。结果HP-β-CD浓度为0.5％时，T为31℃，满足要求。
实施例2：野黄芩苷镁温敏原位凝胶的含量测定方法
(1)色谱条件
Agilent C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)，流动相为乙腈-0.1％磷酸水(22∶78， v:v)，检测波长为335nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量10μL。
(2)溶液制备
对照品溶液：精密称取野黄芩苷对照品适量，置于50mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，放置室温，定容，制成196.392μg/mL的对照品溶液。
供试品溶液：精密量取50μL Scu-Mg-NG于100mL容量瓶中，加纯水超声溶解，放置室温，定容，摇匀，得供试品溶液。
阴性对照溶液：精密称取空白凝胶适量，同供试品溶液制备，得阴性对照溶液。
(3)方法学考察
按照《中国药典》2020年版进行专属性、线性范围、精密度、加样回收率和稳定性考察。
(4)含量测定
取含有吸收促进剂的野黄芩苷镁温敏原位凝胶(Scu-Mg-NG-H)和不含吸收促进剂的野黄芩苷镁温敏原位凝胶(Scu-Mg-NG-W)，按照(2)项下方法平行制备6份供试品溶液，按(1)项下色谱条件测定峰面积，外标一点法，计算凝胶中野黄芩苷镁的含量。结果见下表。
表6 Scu-Mg-NG的含量测定
实施例3：野黄芩苷镁温敏原位凝胶的质量评价
(1)外观检查和pH值
取3批平行制备的Scu-Mg-NG-W和Scu-Mg-NG-H，肉眼观察其性状，并测定其pH 值。结果Scu-Mg-NG-H和Scu-Mg-NG-W的外观和pH值均符合鼻用制剂的相关要求。
表7 Scu-Mg-NG pH及外观的测定结果
(2)黏度的测定
取平行制备的Scu-Mg-NG-W和Scu-Mg-NG-H，使用旋转粘度计测定其黏度，选择3号转子，在6r/min的速度下进行测定。结果见图1。
(3)膨胀系数的测定
分别量取1mL Scu-Mg-NG-W和Scu-Mg-NG-H，加入5mL离心管中，放置在25℃水浴中，记体积V0，再将其放于37℃水浴中，记体积V，依照下列公式，计算膨胀系数S。结果Scu-Mg-NG-W和Scu-Mg-NG-H的膨胀系数分别是为2％和1.67％。
S(％)＝(V－V0)/V0×100％。
(4)初步稳定性的考察
1)机械稳定性
取适量的Scu-Mg-NG-W和Scu-Mg-NG-H于离心管中，3500r/min离心30min后， Scu-Mg-NG-W和Scu-Mg-NG-H的外观均为黄色、澄清的溶液，且无分层与絮凝现象，表明机械稳定性良好。
2)温度稳定性
将Scu-Mg-NG-W和Scu-Mg-NG-H放在4℃和25℃条件下，分别于0，8，15天取出观察外观，并测定其胶凝温度、pH值和野黄芩苷镁的含量。结果见下表。
表8 Scu-Mg-NG-W的温度稳定性
表9 Scu-Mg-NG-H的温度稳定性
实施例4：野黄芩苷镁温敏原位凝胶体外释放行为
(1)振荡透析释放法
精密移取Scu-Mg-NG-W、Scu-Mg-NG-H和野黄芩苷镁水溶液(Scu-Mg-S)各2mL (相当于野黄芩苷镁196.0mg)，置于活化后的透析袋中，除去袋内气泡，然后透析袋两端用透析夹夹好。将透析袋置于250mL的具塞三角瓶中，加入100mL溶出介质(34℃的 pH6.8磷酸盐缓冲溶液)，使透析袋完全浸泡在磷酸盐缓冲溶液中。然后，将三角瓶置于恒温振荡器中，设置温度为34℃，振荡频率为100r/min，分别于10，20，40，60，90， 120，180，240，360，480，720和1440min取样2mL，同时立即补加2mL同温度的溶出介质(每种样品各平行测定3份)。精密量取样品溶液1mL，置于25mL容量瓶中，加入pH6.8磷酸缓冲盐溶液定容至刻度，摇匀。取适量经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液， HPLC法测定不同时间点样品中的野黄芩苷镁的浓度。按照下列公式，计算各时间点样品中的野黄芩苷镁累积释放度(Qn)，以Qn-t作图，绘制释放度曲线，并对其进行模型拟合。释放度曲线见图2。模型拟合结果见下表。
表10释放度动力学分析的相关性系数
(2)无膜溶出法
分别取2mL的Scu-Mg-NG-W和Scu-Mg-NG-H置于已称重的5mL离心管中，预热至34℃，使其完全形成凝胶，精密称重后，加入1mL同温度的释放介质(pH 6.8的磷酸盐缓冲液)，将离心管放入恒温振荡箱中，设置温度为34℃，振荡频率为100r/min，分别于10，20，40，60，90，120，180，240，360，480，600min把释放介质倾倒至容量瓶中，迅速擦干离心管外面的液体并精密称定。补充同温度的释放介质1mL，重复上述操作，直到凝胶全部溶蚀完(每种凝胶平行测定3份)。相邻时间点样品的重量之差即为凝胶溶蚀量。以累积溶蚀率对时间作图，绘制累积溶蚀曲线(图3)。将每次倾倒出的释放介质用去离子水稀释至一定倍数，稀释液经经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，HPLC 法测定不同时间点样品中的野黄芩苷镁的浓度，计算累积释放率，绘制释放曲线(图4)。分别以累计溶蚀率为横坐标，累计释药率为纵坐标作图，绘制两者的相关曲线(图5)。
实施例5：野黄芩苷镁温敏原位凝胶在大鼠血浆内的浓度测定
(1)UPLC色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm，Waters Corp.,USA)；流动相：A相(含有0.1％甲酸水溶液)，B相(甲醇)，C相(乙腈)采用梯度洗脱程序，如下：0～0.5min，78％；0.5～0.6min，
78％～70％A；0.6～1.5min，70％A；1.5～1.6min，70％～10％A；1.6～3.0min，10％A；3.0～3.1 min，10％～78％A；3.1～5.0min，78％A，B相(乙腈)0～5min均为10％；流速：3.0mL/min，柱温：40℃，进样量：2.0μL。
(2)质谱条件
离子源为电喷雾离子源(ESI源)，采用多反应监测(MRM)负离子检测；离子源参数：气帘气(CUR)为35psi，喷雾电压(IS)-4500v，雾化气温度(TEM)为550℃，物化气(GS1)为50psi，辅助加热气(GS2)为50psi；野黄芩苷(镁盐)和槲皮素(IS) 经优化后的参数：去簇电压(DP)、入口电压(EP)、碰撞能量(CE)、碰撞室出口电压(CXP)分别为-32V、-10V、-25eV、-17V和-24V、-10V、-28eV、-17V，扫描时间均为200msec；野黄芩苷和槲皮素检测离子对分别为m/z461.0→284.9和m/z301.2→151.0。
(3)溶液的配制
对照品溶液的制备
精密称取野黄芩苷对照品适量，置于100mL容量瓶中加入甲醇超声溶解，放置室温，定容，混匀得50.325μg/mL野黄芩苷对照品溶液。精密量取该对照品溶液，用初始流动相逐级稀释成不同浓度的野黄芩苷系列标准溶液，于4℃冰箱中保存。
内标溶液的配制
精密称取槲皮素对照品适量，置于25mL容量瓶中加入甲醇超声溶解，放置室温，定容，混匀得196.784μg/mL槲皮素对照品溶液。精密量取该对照品适量，用甲醇稀释成浓度为512.46ng/mL的内标溶液，于4℃冰箱保存。
(4)血浆的处理方法(沉淀蛋白法)
空白血浆：精密吸取50μL的空白血浆，加2M磷酸2μL进行酸化，涡旋30s，加入 30μL的初始流动相，涡旋30s，加入200μL的甲醇，涡旋3min，离心5min(4℃，10000 rpm/min)，取上清150μL，再离心5min，取上清75μL进样检测。
血浆样品：精密吸取50μL的血浆样品，加入2M磷酸2μL进行酸化，涡旋30s，加入10μL的初始流动相，20μL的内标，涡旋30s，加入200μL的甲醇，涡旋3min，离心 5min(4℃，10000rpm/min)，取上清150μL，再离心5min，取上清75μL进样检测。
QC样品：精密吸取50μL的空白血浆，加2M磷酸2μL进行酸化，涡旋30s，加入10μL的野黄芩苷对照品溶液，20μL的内标，涡旋30s，加入200μL的甲醇，涡旋3min，离心5min(4℃，10000rpm/min)，取上清150μL，再离心5min，取上清75μL进样检测。
(5)方法学考察
建立的分析方法的专属性、线性范围、精密度与准确度、基质效应、稀释可靠性和稳定性符合《中国药典》2020年版生物样品定量分析方法验证指导原则项下要求。
实施例6：野黄芩苷镁温敏原位凝胶在大鼠脑组织的浓度测定
(1)UPLC色谱条件
同实施例5(1)项下方法。
(2)质谱条件
同实施例5(2)项下方法。
(3)溶液的配制
同实施例5(3)项下方法。
(4)脑组织的处理方法(沉淀蛋白法)
空白脑组织：将脑组织解冻，取50mg，加入2M的磷酸2μL进行酸化，10μL初始流动相，150μL甲醇，使用高通量组织研磨器研磨(70HZ，30s/次，4次)，将组织液匀浆离心10min(4℃，10000rpm/min)，取100μL，加入20μL的初始流动相，涡旋30s，加100μL的甲醇，涡旋3min，离心10min(4℃，10000rpm/min)，取上清检测。
脑组织样品：将脑组织解冻，取50mg，加入2M的磷酸2μL进行酸化，10μL初始流动相，150μL甲醇，使用高通量组织研磨器研磨(70HZ，30s/次，4次)，将组织液匀浆离心10min(4℃，10000rpm/min)，取100μL，加入20μL的内标，涡旋30s，加100 μL的甲醇，涡旋3min，离心10min(4℃，10000rpm/min)，取上清检测。
QC样品：将脑组织解冻，取50mg，加入2M的磷酸2μL进行酸化，10μL野黄芩苷对照品，150μL甲醇，使用高通量组织研磨器研磨(70HZ，30s/次，4次)，将组织液匀浆离心10min(4℃，10000rpm/min)，取100μL，加入20μL的内标，涡旋30s，加 100μL的甲醇，涡旋3min，离心10min(4℃，10000rpm/min)，取上清检测。
(5)方法学考察
建立的分析方法的专属性、线性范围、精密度与准确度、基质效应、稀释可靠性和稳定性符合《中国药典》2020年版生物样品定量分析方法验证指导原则项下要求。
实施例7：野黄芩苷镁温敏原位凝胶在大鼠血浆的药物动力学研究
(1)样品的制备
Scu-Mg-NG-S：精密称取0.1g野黄芩苷镁，加入10mL去离子水中，超声溶解，即得9.80mg/mL的Scu-Mg-S。
Scu-Mg-NG-W：分别精密称取1.9g P407和0.05g P188，置于烧杯中，加入去离子水10mL，搅拌溶解。在4℃环境下存放24h以上，充分溶胀。加入1g的野黄芩苷镁，在常温下搅拌混匀，直至野黄芩苷镁全部溶解，在4℃下，静置24h，即得98.0mg/mL的 Scu-Mg-NG-W。
Scu-Mg-NG-H：分别精密称取1.9g P407和0.05g P188，置于烧杯中，加入去离子水10mL，搅拌溶解。在4℃环境下存放24h以上，充分溶胀。加入0.05g的HP-β-CD，搅拌至溶解，然后加入1g的野黄芩苷镁，在常温下搅拌混匀，直至野黄芩苷镁全部溶解，在4℃下，静置24h，即得98.0mg/mL的Scu-Mg-NG-H。
(2)分组与给药
健康SD大鼠24只，随机分为4组，每组6只。分别经灌胃给药(Scu-Mg-S，10mL/kg)、尾静脉注射给药(Scu-Mg-S，0.5mL/kg)和鼻腔给药(每只大鼠单侧鼻孔分别滴入10μL Scu-Mg-NG-W和Scu-Mg-NG-H，相当于野黄芩苷镁3.2mg/kg，于给药后5，10，20，30， 45，60，120，240，360，480，720，1440min眼眶静脉丛取血，置于肝素化的离心管中，在4℃和10000rpm/min条件下，离心10min，取上层血浆于-80℃冰箱中保存。
(3)药动学数据的处理及分析
绘制血药浓度-时间曲线(图6)，应用DAS 3.0药动学软件计算主要药动学参数，并计算绝对生物利用度Fabs。采用SPSS软件进行统计学分析，P<0.05表示具有显著性差异。
表11大鼠给药后血浆中野黄芩苷镁的主要药动学参数
注：“*”表示原位凝胶与灌胃组比较，*P<0.05，**P<0.01；
“#”表示原位凝胶与尾静脉注射比较，#P<0.05，##P<0.01。
实施例8：野黄芩苷镁温敏原位凝胶在大鼠脑组织的药物动力学研究
(1)样品的制备
同实施例7(1)项下方法。
(2)分组与给药
144只SD大鼠实验前禁食(自由饮水)12h，随机分为4组，每组36只。4组大鼠分别经灌胃给药(Scu-Mg-S，10mL/kg)、尾静脉注射给药(Scu-Mg-S，0.5mL/kg)和鼻腔给药(每只大鼠单侧鼻孔分别滴入10μL左右的Scu-Mg-NG-W和Scu-Mg-NG-H，相当于野黄芩苷镁3.2mg/kg)，于给药后0.16，0.5，1，2，6，12h将大鼠麻醉(每个时间点每组取6只大鼠)，立即解剖，摘取大鼠脑组织，生理盐水冲洗组织表面的血迹，并用滤纸吸干水分，放置于-80℃冰箱中保存。
(3)药动学数据的处理及分析
绘制各组大鼠脑组织浓度在不同时间点的条形图(图7)，以及脑组织浓度-时间曲线 (图8)，应用DAS 3.0药动学软件计算主要药动学参数，并计算脑靶向性指数BTI。结果Scu-Mg-NG-W的BTI鼻/iv为18.07，Scu-Mg-NG-H的BTI鼻/iv为20.58，ig组的BTIig/iv为0.78。表明Scu-Mg-NG通过鼻腔给药比iv和ig提高了野黄芩苷镁进入脑组织的浓度，表明Scu-Mg-NG经鼻腔给药具有较好的脑靶向性。
表12大鼠给药后脑组织中野黄芩苷镁的主要药动学参数
药动学参数 ig iv Scu-Mg-NG-W Scu-Mg-NG-H
AUC(0-t)(ng/mg*h) 13.612 8.453 20.681 33.509
Tmax(h) 0.333 0.083 0.167 0.083
Cmax(ng/mg) 28.611 44.004 55.006 59.677
MRT(0-t)(h) 0.472 0.247 0.313 0.67
AUC(0-t)/dose(ng/mg*h) 0.136 1.691 6.463 10.472
Cmax/dose(ng/mg) 0.286 8.801 17.189 18.649

Claims (5)

1.一种鼻腔给药野黄芩苷镁温度敏感原位凝胶制剂，其特征在于，包含：野黄芩苷镁，质量分数10％；泊洛沙姆407，质量分数19％；泊洛沙姆188，质量分数0.5％；羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)的质量分数为0.5％；其余为去离子水。
2.根据权利要求1所述的鼻腔给药野黄芩苷镁温度敏感原位凝胶制剂，其特征在于，所述原位凝胶的胶凝温度为29℃～34℃。
3.一种根据权利要求1所述的鼻腔给药野黄芩苷镁温度敏感原位凝胶制剂的制备方法，其特征在于：(1)分别精密称取处方量的泊洛沙姆407和泊洛沙姆188，加入去离子水中，搅拌溶解；在4℃环境下存放24h以上，充分溶胀，得到澄清、无气泡、无团块的空白凝胶基质；(2)在步骤(1)得到的空白凝胶基质中加入野黄芩苷镁和HP-β-CD，在常温下搅拌混匀，直至野黄芩苷镁全部溶解，放入4℃冰箱24h得到野黄芩苷镁温敏型原位凝胶。
4.根据权利要求1所述的鼻腔给药野黄芩苷镁温度敏感原位凝胶制剂在制备治疗心脑血管疾病的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述治疗心脑血管疾病的药物为治疗脑卒中药物。
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