CN114933554A - 一种基于异斯特维醇的可注射型超分子水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种基于异斯特维醇的可注射型超分子水凝胶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于异斯特维醇的可注射型超分子水凝胶及其制备方法与应用，属于药用材料领域。本发明通过对异斯特维醇进行酯化、磺化、成盐合成新型的超分子水凝胶剂。其具有如下结构通式：本发明水凝胶药物控缓释体系不但减小了化疗药物的用药剂量和频次，同时实现了药物的被动靶向作用和定位缓释效果。该凝胶剂体系合成路线简单易操作，成本低，生物相容性和生物安全性高，具有广泛的应用前景。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式1其中，n=2‑10；M=Na或K。

Description

一种基于异斯特维醇的可注射型超分子水凝胶及其制备方法 与应用
技术领域
本发明公开了一种异斯特维醇二酯磺酸盐类超分子凝胶及其作为可注射性药物控缓释材料的应用，属药用材料领域。
背景技术
目前，化学疗法是癌症治疗和抑制肿瘤复发的最普遍方法，但化疗药物存在毒性大、稳定性差、对肿瘤细胞识别性低等不足。注射与口服的全身系统化疗是临床上最常用的化疗方式，但是这样的方式很难使药物在肿瘤组织中达到有效的浓度，因此需要增加口服或者注射药物的浓度和频次。抗肿瘤药物大多存在毒性大、对肿瘤细胞识别性低等特点，传统的注射与口服的全身系统化疗的方式无法在肿瘤组织中达到有效的药物浓度，增加口服或者注射药物的浓度和频次会影响药物的治疗效果和病人的顺应性。因此，制备抗肿瘤药物的缓释载体实现药物的肿瘤部位给药，使肿瘤组织长时间与高浓度抗肿瘤药接触，避免了持续口服或注射药物带来的不便，提高药物利用度。同时减小正常细胞的药物符合，尽可能的降低毒副作用。
作为一种替代方法，局部药物传递的化学疗法可以减少全身化学疗法的毒性，同时在目标肿瘤部位持续释放化学疗法。与传统化学疗法相比，局部药物传递技术不仅降低了正常组织的毒性，从而避免了化学疗法的系统性循环，而且还提供了化学疗法的局部持续释放，从而提高治疗效果。论文(Biomaterials 2016,105,1-11)研究了负载的阿霉素药物的可注射苯基硼酸制备的超分子凝胶，动物实验表明对乳腺癌治疗有较好的效果，但其凝胶剂量为30mg/mL，并且溶剂为聚乙二醇和水的混合液；专利CN202111340218.8报道了Pluronic和羧甲基壳聚糖共聚得到聚合物类水凝胶，但聚合物类等大分子类凝胶剂存在分子量较大，凝胶剂浓度大，固含量高，载药量偏低，生物降解性相对较差，不利于药物缓释后载体的代谢排出而导致副作用。
由低分子量凝胶构成的给药系统，因其独特的多级自组装结构、良好的生物相容性和生物降解性，在可注射载体方面有着独特的优势。但其也存在可注射性、安全性问题，对相变温度和凝胶时间要求苛刻以及需要高温保持溶胶状态才能实现注射等不足。因此，目前还需研发更好的低分子量凝胶药物载体。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明目的在于提供一种可注射型超分子水凝胶；另一目的在于提供其制备方法和应用。
为实现本发明目的，本发明以异斯特维醇为原料，经二酯化、双磺化、成盐制备双磺酸盐类超分子凝胶。基于异斯特维醇磺酸双磺酸盐类凝胶剂的特点，采用注射凝胶前体和药物的水溶液，与机体中钠离子结合后原位凝胶化的理念，计并制备出新型的可注射载药水凝胶体系。
本发明采用的技术方案如下：
本发明所述异斯特维醇双磺酸盐类可注射型凝胶剂具有通式1所示结构：
Figure BDA0003675003690000021
其中，n＝2-10；M＝Na或K；
其前体具有通式2所示结构：
Figure BDA0003675003690000022
其中，n＝2-10。
本发明提供了上述衍生物的合成方法，所述反应过程如下：
Figure BDA0003675003690000023
(1)有机溶剂中，将异斯特维醇(化合物1)与C2-10的二卤代烷基化合物在在碱性化合物的存在下进行反应，结束后蒸干溶剂，向其中加入稀盐酸洗涤粗品，过滤，干燥得化合物2。
所述有机溶剂采用DMF，DMSO，乙腈，乙酸乙酯的一种或几种；所述C2-10的二卤代烷基化合物优选：C2-10二氯代烷基化合物、C2-10二溴代烷基化合物＝C2-10二碘代烷基化合物；所述碱碱性化合物采用KOH、NaOH、K2CO3或N,N-二甲氨基吡啶(DMAP)。优选DMSO作溶剂，C2-10二碘代烷基化合物为反应试剂在回流状态下反应。化合物1与C2-10的二卤代烷基化合物的摩尔比为2.0～2.5:1，优选2.1:1；反应温度为20-60℃，优选50℃。
(2)低温下将浓硫酸滴加到乙酸酐中，滴加完毕后向体系内加入溶剂和化合物2并缓慢升温至室温，继续反应至结束。加水稀释体系，有机溶剂萃取、重结晶得化合物3。
所述溶剂为乙酸乙酯、甲基叔丁基醚或正丁醇；所述重结晶溶剂为乙酸乙酯、冰乙酸、甲醇和乙醇中的一种或几种。优选冰醋酸做反应溶剂、乙酸乙酯-冰乙酸10:1体积比做重结晶溶剂。
所述反应温度0～30℃，反应时间8～24小时。优选0～5℃。
(3)向化合物3的溶液中加入钠盐或钾盐水溶液，洗涤后分出有机相，磺酸盐衍生物结晶析出，抽滤，少量水洗涤去除多余盐和钠离子交换生成的酸。
钠盐或钾盐与化合物3的摩尔比为4:1～2:1，优选2.2:1。
本发明通过将异斯特维醇双磺酸盐在溶剂中加热冷却的方法制备凝胶体系；也可将含有金属盐的溶液加入到异斯特维醇双磺酸的溶液中实现原位凝胶。
所述凝胶溶剂为水、甲醇、乙醇、DMSO、中的一种或几种。
所述凝胶剂的浓度为1％w/v-4％w/v。
采用注射针剂使用时，将异斯特维醇二酯磺酸化合物凝胶剂前体作为药物分子溶液的载体，制成注射凝胶剂，注射后机体内的Na+发生离子交换原位自组装形成载药凝胶体系，进行药物缓慢释放。
所述凝胶剂前体的浓度为1％-4％w/v。所述溶液为水、聚乙二醇中的中一种或混合物，优选水。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.通过注射凝胶剂前体化合物溶液，和机体内的Na+发生离子交换原位自组装形成载药凝胶体系,实现了药物的局部注射。避免了凝胶注射困难、载药量低的问题。不但减小了化疗药物的用药剂量和频次，同时实现了药物的被动靶向作用和定位缓释效果。
2.安全性实验表明：本发明提供的凝胶剂及其前体毒性小、生物相容性高，具有优秀的生物安全性。
附图说明
图1为本发明异斯特维醇丁二酯磺酸钠药物体外缓释效果：a-对盐酸多西环素的缓释效果；b-对布洛芬的缓释效果；
图2为本发明异斯特维醇丁二酯磺酸钠负载药物的干凝胶的SEM照：a-布洛芬，乙醇/水1:1；b-强力霉素，乙醇/水1:1；
图3为本发明异斯特维醇丁二酯磺酸钠的细胞增殖抑制活性；
图4为本发明异斯特维醇丁二酯磺酸钠的溶血作用；
图5皮下注射0.1mL异斯特维醇丁二酯磺酸水溶液(1％w/v)的原位凝胶效果：a)注射后1分钟；b)注射后2周；c)注射后4周；
图6注射1％wt本发明异斯特维醇丁二酯磺酸(0.1mL)皮下注射4周的血生化和血常规结果；
图7为注射1％wt本发明异斯特维醇丁二酯磺酸(0.1mL)后小鼠主要脏器的病理切片；
图8为皮下注射0.1mL 2.0％w/t本发明异斯特维醇丁二酯磺酸和盐酸阿霉素的小动物成像效果图。(A-对照组；B-注射后0天；C-注射后7天；D-注射后14天；E-注射后21天)。
图9为本发明异斯特维醇二酯磺酸化合物作为凝胶注射剂作用原理图：向机体内注射含治疗药物的该化合物的水溶液，该溶液和机体内的Na离子和K离子迅速作用生成相应的盐而在病灶原位成胶并缓慢释放。
具体实施方式
为了更好地实施本发明，现举实施例对本发明作进一步说明，但是这些实施例仅是用于说明本发明，但实施例不是对本发明的限制。
实施例1异斯特维醇丁二酯的制备
称取3.18g化合物2(1mmol)和1.0g K2CO3置于50mL圆底烧瓶中，加入25mL乙腈作为溶剂，搅拌下加入0.5mmol的1,4-二溴丁烷，并升温至回流。TLC监测至反应结束。待反应完毕后蒸干乙腈，向体系中加入50mL水充分混匀，再使用3×25mL乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和氯化钠反洗后分出有机相。
白色固体，93％收率。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ4.01-4.11(m,4H),2.60-2.63(d,J＝3.6Hz,2H),2.17-2.19(d,J＝13.2Hz.2H),1.89-1.92(m,2H),1.78-1.83(m,4H),1.65-1.70(m,5H),1.70-1.78(m,8H),1.54-1.58(m,4H),1.38-1.55(m,8H),1.21(s,8H),1.11-1.15(m,3H),1.01-1.03(m,2H),0.99(s,6H),0.88-0.93(m,2H),0.71(s,6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3):δ222.31,177.24,63.62,57.01,54.71,54.34,48.74,48.46,43.83,41.56,39.82,39.40,37.31,29.05,25.55,21.71,20.31,19.90,19.01,13.42；HRMS(ESI,m/z)calcd for C44H67O6[M+H]+691.4932,Found 691.4935.
实施例2异斯特维醇丁二酯磺酸的制备
于50mL烧瓶中加入7mL乙酸酐，冰浴搅拌下缓慢滴加1.5mL浓硫酸，滴加完毕后得粘稠液体。继续搅拌下加入上述二酯衍生物，继续搅拌2小时。撤去冰浴后升至室温继续反应10小时。TLC反应完成后(乙酸乙酯：乙醇：石油醚1：1：1)向反应体系中加入50mL水，加热溶解后，用3×50mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，蒸馏除去乙酸乙酯至体系呈粘稠油状，加入2mL乙酸乙酯，静置后析出晶体，过滤后晶体用少量乙酸乙酯洗涤，得白色产物。
白色晶体，92％收率。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ3.97(m,4H),3.33(s,2H),2.75-2.78(d,J＝13.2Hz,2H),2.37-2.39(d,J＝13.2Hz,2H),2.02-2.14(m,4H),1.56-1.78(m,2H),1.34-1.38(m,6H),1.13-1.14(m,13H),0.97-1.51(m,6H),0.87(m,9H),0.65(s,6H)；13C NMR(100MHz，DMSO,ppm):δ214.11,176.91,72.12,63.91,57.62,56.93,51.44,47.21,39.22,38.21,37.92,35.96,29.12,25.53,21.97,20.68,19.50,19.12,13.21；HRMS(ESI,m/z)calcd.for C44H67O12S2[M+H]+851.4068.Found:851.4073；HRMS(ESI,m/z)calcdfor C44H65O12S2[M-H]-849.3923,Found 849.3923.
实施例3异斯特维醇丁二酯磺酸盐
将异斯特维醇丁二酯磺酸溶于甲醇，搅拌下滴加饱和氯化钠或氯化钾溶液，滴加过程中体系先原位凝胶，搅拌后析出白色固体。过滤后少量水洗涤，干燥得目标化合物。白色固体，89％收率。1H NMR(400MHz,DMSO,ppm):δ3.95(s,4H),3.40(s,2H),2.75-2.78(d,J＝13.2Hz,2H),2.37-2.39(d,J＝10.8Hz,2H),2.12-2.19(m,2H),2.00-2.04(d,J＝12.4Hz,2H),1.56-1.76(m,12H),1.33-1.37(m,6H),1.12-1.18(m,12H),0.96-1.03(m,6H),0.87(m,8H),0.66(s,6H)；13C NMR(100MHz，DMSO,ppm):δ216.3,176.5,71.5,63.6,57.1,56.4,51.0,46.9,43.1,42.2,38.7,37.7,37.4,35.4,28.5,25.0,21.5,20.1,19.0,18.6,12.8.
实施例4干凝胶的制备
称取20mg的异斯特维醇丁二酯磺酸盐和1mL去离子水，于耐压管中密封加热。化合物溶解后冷却后转移到底部垫有硅片的蒸发皿中。溶剂自由蒸发后干凝胶附着到硅片上。取出硅片后将干凝胶喷金处理进行扫描电镜检测。
实施例5水凝胶的载药性能与体外释放性能研究
强力霉素：称取3.0mg强力霉素，加入0.5mL生理盐水制备出强力霉素溶液。称取10mg化合物异斯特维醇丁烷二酯磺酸并溶于0.5mL乙醇后转入缓释袋，向其中加入强力霉素溶液体系原位凝胶化。将密封好的透析袋加入到样品瓶中，加入10mL缓冲液(pH分别为7.4和5.8)，置于恒温振荡器中水浴振荡(37℃，100r/min)，分别在1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时每次取样1mL，并将所取样加入相应缓冲溶液稀释至3mL。每次取样完成后向样品瓶中补加相应缓冲液1mL。另将10mg强力霉素溶于缓冲溶液中配制1mg/mL的母液，分别移取0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL和1.0mL母液并稀释到10mL配制标准溶液，用紫外-可见分光光度法测量吸光度并制作标准曲线(波长273nm)。用同样的吸收波长检测所取样品药物含量，以药物释放百分比对时间作图。
(2)将3.0mg布洛芬和10mg异斯特维醇丁烷二酯磺酸分别溶于0.5mL乙醇后加入1mL生理盐水于透析袋中混匀，体系原位凝胶化。加入15mL的pH 7.4缓冲液与无水乙醇6：1混合的溶液并将并将透析袋浸入。样品瓶置于37℃的水浴恒温振荡器中，控制振荡速度100r/min。在1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、24小时、36小时和48小时每次取样3.0mL，并用相应缓冲溶液稀释至9.0mL。同时在样品瓶中补充3.0mL相应的缓冲液继续振荡。按上述方法制作标准曲线并测试样品药物含量，以药物释放百分比对时间作图。
实施例6水凝胶的原位皮下注射与安全性评价
取30mg异斯特维醇丁烷二酯磺酸于耐压瓶中加入去离子水3mL。加热溶解后冷却得溶液，加入盐酸阿霉素制备凝胶前体溶液。用0.5mL注射器给小鼠进行皮下注射。用小动物成像仪分别观察0天。7天、14天和21天药物的缓释情况，发现可以缓释21天。其中取注射凝胶后的21天小鼠的眼球血测试血常规；解剖取出心、肝、脾、肺和肾做病理切片。
细胞毒活性测试：本发明中癌细胞株包括HepG2(人肝癌)和Hela(人宫颈癌)。收集对数细胞并悬浮在完全DMEM(dulbecco's modified eagle medium)培养基中。将细胞悬液浓度调整为3×105细胞/mL，96孔细胞培养板接种100μL/孔。将上清液置于体积百分比5％CO2培养箱中37℃下培养24h。加入新鲜的上清和新鲜的完全DMEM培养基(90μL/孔)，加入不同浓度的供试液(10μL/孔)，然后在37℃、体积百分比5％CO2下放置48h。在每孔中加入100μL的MTT溶液(0.5mg/mL，不完整的DMEM培养基)，并在培养箱中孵育48小时。48小时后，终止培养并弃去上清液。每孔加入150μL DMSO。将振荡器低速摇动5分钟至晶体溶解。在570nm处测量每个孔的吸光度。
结果：
为了考察其凝胶控缓释性能，以水溶性药物强力霉素和脂溶性药物布洛芬为模板，初步考察了异斯特维醇丁二酯磺酸盐超分子凝胶体系对不同类型药物负载和体外缓释性能。我们将磺酸衍生物和药物溶于少量乙醇中然后转移到缓释袋中，加入生理盐水体系原位凝胶化。然后将缓释体系放置于不同pH的缓冲溶液中于摇床上震荡。在相应时间点取样，通过紫外标准曲线法测定药物缓释效果。体外研究表明其对二者都具有优良的负载性能，其中对强力霉素的缓释效果达到25小时以上、对布疏水药物洛芬的缓释性能大于40小时(附图1)。
布洛芬水溶性差，从附图2可以看出，布洛芬在凝胶中呈现出均匀分布的颗粒状。从强力霉素的干凝胶图片可以看出，因为强力霉素溶解性好，其凝胶体系自组装成带状纳米结构，未见强力霉素的聚集颗粒，说明强力霉素是均匀分布在凝胶纤维上的。
以Hela和HepG2细胞株考察了其细胞毒性，研究表明该类凝胶剂在150μM的浓度下没有表现出增殖抑制活性，表明该类凝胶剂毒性很小，安全性高(附图3)。
为了考察凝胶材料的安全性，测试了溶血效果，结果表明在9.3-1200μg/mL浓度下其溶血作用溶血比例都小于5％(附图4)，表明本发明化合物具有较好的安全性。
通过小鼠皮下注射评价凝胶系统的注射性能。将配置好的异斯特维醇丁二酯磺酸的水溶液对小鼠进行皮下注射，实验表明，在注射异斯特维醇丁二酯磺酸的水溶液后，磺酸衍生物与体液中的钠离子即可发生自组装生产凝胶(附图5)，注射后1分钟凝胶形成。并且该凝胶在机体内稳定存在，2周的结果表明凝胶体积变小，并于4周内完全吸收。表明该类化合物具有很好的生物相容性。
同时，我们对注射凝胶后28天的小鼠的血生化和血常规进行了研究。结果表明注射凝胶的小鼠和正常对照组的小鼠结果都在正常范围内，空白组和给药组的生理指标均无显著性差异(附图6)。这些结果表明异斯特维醇丁二酯磺酸具有较高的安全性。
同时我们对注射凝胶的小鼠在2周和4周的心、肝、脾、肺和肾等主要脏器进行了病理分析，结果没有发现病理变化，显示很好的生物安全性(附图7)。
以阿霉素为模板药物，制备异斯特维醇丁二酯磺酸与盐酸阿霉素的溶液，通过小动物活体成像仪考察皮下注射的原位凝胶及缓释性能。结果表明该体系可以原位形成凝胶，阿霉素在可以在小鼠体内缓释21天(附图8)。

Claims (8)

1.一种四环二萜类的异斯特维醇二酯磺酸化合物凝胶剂前体，其特征在于：具有通式1所示结构，
Figure FDA0003675003680000011
其中，n＝2-10。
2.如权利要求1所述的四环二萜类的异斯特维醇二酯磺酸化合物凝胶剂前体，其特征在于：
n＝4。
3.一种四环二萜类的异斯特维醇二酯磺酸盐化合物凝胶剂，其特征在于：具有通式2所示结构，
Figure FDA0003675003680000012
其中，n＝2-10；M＝Na或K。
4.如权利要求3所述的四环二萜类的异斯特维醇二酯磺酸化合物凝胶剂，其特征在于：n＝4。
5.制备权利要求3或4所述的四环二萜类的异斯特维醇磺酸盐化合物凝胶剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
Figure FDA0003675003680000013
R代表C2-10烷基；
(1)有机溶剂中，异斯特维醇(化合物1)与C2-10的二卤代烷基化合物在碱性化合物的存在下反应得异斯特维醇酯二酯化产物(化合物2)；
所述有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲基亚砜(DMSO)或乙腈；；所述碱性化合物为乙醇钠、甲醇钠、叔丁醇钾、氢氧化钠、氢氧化钾、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)或4-二甲氨基吡啶(DMAP)；
(2)加入化合物2，以硫酸和乙酸酐作为磺化试剂在溶剂中反应，得到异斯特维醇二酯双磺酸衍生物(化合物3)；
所述溶剂为甲苯、二甲苯、冰乙酸或者无溶剂反应；
(3)将钠盐或钾盐溶液滴加到化合物3溶液中，过滤得到异斯特维醇磺酸盐衍生物；
所述钠盐为氯化钠、硝酸钠或硫酸钠；钾盐为氯化钾、硝酸钾或硫酸钾。
6.如权利要求1或2所述的四环二萜类的异斯特维醇二酯磺酸化合物凝胶剂前体的应用，其特征在于，其和Na、K金属离子在溶液中原位反应，得到原位凝胶体系；
所述溶液为水、乙醇、甲醇或DMSO。
7.如权利要求1或2所述的四环二萜类的异斯特维醇二酯磺酸化合物凝胶剂前体的应用，其特征在于，其作为药物分子溶液的载体，制成注射凝胶剂。
8.如权利要求3、或4所述的四环二萜类的异斯特维醇二酯磺酸盐化合物凝胶剂的应用，其特征在于，加入溶剂，通过加热冷却法得到凝胶体系；所述溶剂为水、乙醇、甲醇或DMSO。
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