CN114907497A - 一种牡丹花低聚糖提取物的制备方法及其用途 - Google Patents

一种牡丹花低聚糖提取物的制备方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于天然植物提取技术领域，公开了一种牡丹花低聚糖提取物的制备方法及其用途。制备步骤包括：(1)向牡丹花中加入含纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶总浓度0.1%～0.3%的复合酶液进行第一次酶解，水提，浓缩，得浓缩液；(2)向浓缩液中加入含纤维二糖酶、葡聚糖酶和β‑半乳糖苷酶总浓度0.05%～0.2%的混合酶液进行第二次酶解，脱色，得脱色液；(3)将脱色液进行醇沉、浓缩，过滤和冻干处理，得到牡丹花低聚糖提取物。本发明制备的牡丹花低聚糖提取物收率达15%以上，提取物总糖含量达90%以上。本发明制备的牡丹花低聚糖产品具有修复紫外线引起的皮肤损伤的作用，有效提高皮肤光泽，提高抗氧化作用。

Description

一种牡丹花低聚糖提取物的制备方法及其用途
技术领域
本发明属于天然植物提取技术领域，具体涉及一种牡丹花低聚糖提取物的制备方法及其用途。
背景技术
牡丹花朵饱满、颜色艳丽，浑身是宝，不仅具有重要的观赏价值，还具有重要的开发应用价值。研究表明牡丹花瓣中含有丰富的黄酮、多酚类物质、维生素(维生素B1、维生素B2和类胡萝卜素等)、矿物质(Ca、K、P、Mg、Se等)、蛋白质和氨基酸，是一种较好的天然营养保健资源。从牡丹花中提取的牡丹花精油具有改善血液循环，抵抗敏感，美容养颜，促进细胞再生，缓解肌肤老化，调节皮肤问题，平衡女性体内荷尔蒙分泌等作用，因此，可作为原料用于食品、饮料、医药、化妆品中。
目前牡丹花中功效成分的提取主要集中在精油、黄酮和多酚类物质，对其寡糖、多糖等糖类成分的开发利用鲜有报道。植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等多种生物活性、毒副作用小和不易造成残留等优点。但是植物多糖分子量大，水溶性差，不利于生物吸收，应用范围受限，将其通过现代生物技术制备成分子量较小，水溶性好的活性物质将极大的促进其开发利用。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供一种牡丹花低聚糖提取物的制备方法及其用途。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种牡丹花低聚糖提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将牡丹花与复合酶液按质量比1:4～6混合，进行第一次酶解，然后向酶解液中加入牡丹花质量6～12倍的水，于60～90℃条件下进行提取，提取后过滤，得到提取液，对提取液进行浓缩，得到浓缩液；
所述复合酶液为纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶的混合水溶液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液与混合酶液按质量比3～8:1混合，进行第二次酶解，酶解后离心，取上清液，对上清液进行脱色处理，得到脱色液；
所述混合酶液为纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶的混合水溶液；
(3)对步骤(2)得到的脱色液进行醇沉处理，醇沉后收集上清液，上清液经除醇、浓缩处理后采用大孔吸附树脂进行分离，收集洗脱液；对洗脱液进行过滤处理，对过滤后的洗脱液进行冻干，得到牡丹花低聚糖提取物。
优选地，步骤(1)所述复合酶液中纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶的质量比为6～12:1～2:1～4，所述纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶的总重占复合酶液总重的0.1％～0.3％。
优选地，步骤(2)所述混合酶液中纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶的质量比为1～4:1～3:5～10，所述纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶的总重占混合酶液总重的0.05％～0.2％。
优选地，所述第一次酶解和第二次酶解的酶解条件相同，酶解的温度为40℃～60℃，pH为5.0～6.0，时间为2h～5h。
优选地，步骤(1)中提取的时间为1h～3h，提取的次数为两次。
优选地，步骤(1)对提取液进行浓缩为减压浓缩，减压浓缩的温度为55℃～75℃，压力为0.6～0.9MPa。
优选地，步骤(2)离心处理的转速为2000～8000rpm，时间10min。
优选地，步骤(2)脱色处理是向上清液中添加活性炭和活性白土。更加优选地，所述活性炭和活性白土的质量比为1～2：0～2，活性炭和活性白土加入量为牡丹干花质量的10％～20％。
优选地，步骤(2)脱色处理的温度为60～80℃，时间0.5～1h。
优选地，步骤(3)醇沉处理的具体操作为：向脱色液中加入90％乙醇至乙醇浓度为60～80％，静置12～36h。
优选地，步骤(3)采用大孔吸附树脂进行分离，收集洗脱液的具体操作为：将浓缩液注入非极性或中等极性大孔吸附树脂中，用3～6倍柱体积的纯化水冲洗，流速为1～3倍柱体积/h，收集洗脱液。
优选地，步骤(3)对洗脱液进行过滤处理的操作为：将洗脱液依次经超滤膜过滤和纳滤膜纳滤。
更加优选地，超滤膜过滤的条件包括：常温，压力为0.2～0.3MPa，截留分子量依次为50000～105Da、5000～10000Da；纳滤膜纳滤的条件包括：温度为30～50℃，压力为0.6～0.9MPa，截留分子量为100～300Da。
优选地，步骤(3)中对过滤后的洗脱液进行冻干的具体操作为：55～65℃条件下将洗脱液减压浓缩，得到浓缩液，浓缩液在真空度10～100Pa条件下于-10℃～-20℃冷冻干燥3～6h，得到牡丹花低聚糖提取物。
本发明还提供了一种由上述制备方法制备的牡丹花低聚糖产品。
优选地，所述牡丹花低聚糖产品的分子量为300～2000，其完全水解后得到的单糖有阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。
本发明还提供了由上述牡丹花低聚糖产品在制备皮肤损伤修复产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明先利用纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶的协同作用对牡丹花进行第一次酶解，破坏牡丹花的细胞壁，加快糖类溶出细胞的速率，缩短提取时间，同时除去纤维素、蛋白质和果胶等杂质，有利于后续的分离纯化。再利用纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶进行第二次酶解，加快大分子多糖降解为低聚糖或低分子量多糖，从而克服牡丹花多糖分子量大，水溶性差，应用范围受限的问题。
(2)本发明提供的制备方法，酶解反应条件温和，提取过程使用乙醇和水进行处理，无毒无害，保证了产品安全。
(3)本发明提供的制备方法中洗脱液依次经超滤膜过滤和纳滤膜纳滤，能进一步除去低聚糖中残留的蛋白质、小分子单糖和无机盐等杂质，从而提高低聚糖的纯度。
(4)本发明制备的牡丹花低聚糖提取物分子量为300～2000，牡丹花低聚糖提取物的收率达15％以上，牡丹花低聚糖提取物的总糖含量达90％以上。
(5)经实验验证，本发明制备的牡丹花低聚糖产品可显著提高受损的皮肤表皮细胞的成活率，提高受损细胞中抗氧化物质SOD、GSH-Px的含量，降低受损细胞中的促氧化物质ROS、成纤维细胞胶原蛋白酶MMP-1含量，从而发挥修复紫外线引起的皮肤损伤的作用，有效提高皮肤光泽，提高抗氧化作用。
附图说明
图1为实施例1制备的牡丹花低聚糖提取物的凝胶渗透色谱图；
图2为实施例1制备的牡丹花低聚糖提取物的单糖组成图，图中1为阿拉伯糖，2为甘露糖，3为葡萄糖，4为半乳糖。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。
(一)牡丹花酶解次数的探讨实验：
为了探讨牡丹花酶解次数对牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量的影响，本发明进行了实施例1和对比例1～2实验，实验具体内容如下：
实施例1：
一种牡丹花低聚糖提取物的制备，包括以下步骤：
(1)将纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶按质量比8:1:2溶于水配制成复合酶液，并使纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶的总重占复合酶液总重的0.20％。将复合酶液与牡丹干花按质量比5:1混合，于55℃、PH 5.5条件下酶解3h，再向酶解液中加入牡丹干花8倍质量的水混合，于80℃提取2h，过滤分离渣子和提取液。取渣子与水按质量比1:8混合，于80℃提取1h，过滤，渣子弃去，合并两次提取液，于65℃减压浓缩至相对密度1.08，得浓缩液；
(2)将纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶按质量比3:1:5溶于水配制成混合酶液，并使纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶的总重占复合酶液总重的0.10％。再将混合酶液与步骤(1)得到的浓缩液按质量比1:5混合，于50℃，PH 5.5条件下，酶解3h，酶解结束后冷却，将冷却后的酶解液3000r/m离心10min。离心后取上清液，向上清液中加入活性炭和活性白土，于80℃脱色0.5h，过滤除去活性炭和活性白土，得脱色液。所述活性炭和活性白土的加入量为牡丹干花质量的10％，所述活性炭和活性白土的质量比为1:1。
(3)向步骤(2)得到的脱色液中加入95％乙醇至乙醇浓度为80％，静置24h，分离沉淀和上清液，取上清液减压浓缩并回收乙醇，浓缩至相对密度为1.04。将得到的浓缩液注入AB-8大孔吸附树脂中，用4倍柱体积水洗脱，收集洗脱液。洗脱液于常温、0.25MPa下依次经50000～105Da、5000～10000Da超滤膜过滤，收集透过液，透过液再于40℃、0.8MPa下经100～300Da的纳滤膜纳滤，收集截留液。将截留液于60℃减压浓缩至相对密度为1.12，得到浓缩液，将浓缩液于真空度50～55Pa、温度-15℃条件下冷冻干燥5h，得牡丹花提取物。
对比例1：
对比例1的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤(2)中是将水与步骤(1)得到的浓缩液按质量比1:5混合。
对比例2：
对比例2的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤(1)中是将水与牡丹干花按质量比5:1混合。
测定实施例1、对比例1和对比例2得到的牡丹花提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量，并测定实施例1得到的牡丹花提取物的相对分子量和单糖组成，计算公式或具体测定方法如下：
(1)牡丹花提取物收率的计算公式为：
收率％＝牡丹花提取物的质量/牡丹干花的质量×100％，结果参见表1；
(2)采用“苯酚-硫酸法”(GB/T 15672)测定实施例1、对比例1和对比例2所得牡丹花提取物的总糖含量，结果参见表1；
苯酚-硫酸法的具体操作为：精密称取待测样品0.25g，使用250mL容量瓶配制成试样待测液。准确吸取试样待测液0.2mL于10mL具塞试管，用蒸馏水补至1.0mL。向试液中加入1.0mL5％苯酚溶液，然后快速加入5.0mL浓硫酸(ρ＝1.84g/mL)(与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便于反应液充分)，反应液静置10min。使用涡旋振荡器使反应液混合，然后将试管放置于30℃水浴锅中反应20min。取适量反应液在490nm处测吸光度。同法制备不同浓度的葡萄糖标准溶液，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制定标准曲线。待测样品测定时，以空白溶液(空白试验与测定平行进行，用同样的方法和试剂，但不加待测样品)调零，测得吸光度，以标准曲线计算总糖含量。
待测样品中总糖含量以质量分数w计，数值以百分率％表示，按下式计算。
Figure BDA0003714600200000051
式中：
V1为样品定容体积，单位为毫升(mL)；
V2为比色测定时所移取样品测定液的体积，单位为毫升(mL)；
m1为从标准曲线上查得样品测定液中的含糖量，单位为微克(μg)；
m2为样品质量，单位为克(g)；
ω为样品含水量，％。
计算结果以葡萄糖计，表示到小数点后一位。
(3)采用“考马斯亮蓝法”(SN/T 3926)测定实施例1、对比例1和对比例2所得牡丹花提取物的蛋白质含量，结果参见表1。
具体方法为：精密称取待测样品1g，使用100mL容量瓶配制溶液，取部分溶液于4000r/min离心15min，上清液为试样待测液。准确吸取试样待测液0.5mL于10mL比色管中，加0.5mL蒸馏水，再加5mL考马斯亮蓝G-250溶液，振荡混匀，静置2min。用1cm比色池以试剂空白为参比液或调零点，用分光光度计于波长595nm处测定吸光度(应在出现蓝色2min～1h内完成)，同法制备不同浓度牛血清白蛋白(BSA)标准溶液，以
牛血清白蛋白(BSA)标准溶液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制定标准曲线，根据标准曲线计算出样品中蛋白质含量。
待测样品中蛋白质的含量以X计，数值以百分率％表示，按下式计算。
Figure BDA0003714600200000061
式中：
X为样品中蛋白质的含量，单位为克每百克(g/100g)；
C为从标准曲线上得到的蛋白质浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；
C0为空白试验中蛋白质浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；
V为最终样液的定容体积，单位为毫升(mL)；
m为样品质量，单位为克(g)；
计算结果以葡萄糖计，表示到小数点后一位。
表1酶解次数对牡丹花提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量的影响
Figure BDA0003714600200000062
由表1可知，对比例1中只进行第一次酶解，低聚糖提取物的收率较低，因为第一次酶解可以破坏牡丹花的细胞壁，分解植物中的果胶、纤维素和蛋白质，加快糖类溶出细胞的速率，但是提取出来的多糖不能有效酶解为低聚糖，在后续醇沉时，大部分多糖被以沉淀形式除去，导致提取物收率降低；对比例2中只进行第二次酶解，收率比对比例1明显提高，但是仍低于实施例1，且对比例2中，低聚糖提取物的总糖含量低于其他实施例，所以，两次酶解都非常必要。
(4)采用凝胶渗透色谱法测定实施例1得到的牡丹花提取物的分子量
色谱柱：WATERS Ultrahydrogel TML inear 7.8mm×300mm；流动相：超纯水；流速：0.5mL/min；示差检测器：Agilent 1260；柱温：40℃；进样量：10ul。
用聚乙二醇300、600、800、1000、2000、4000标准物校准分子质量，以保留时间t(min)为横坐标，分子量Mw的对数lgMw为纵坐标得到标准曲线方程lgMw＝-0.0528t+3.8219，r＝0.9995。测定结果参见表2，实施例1制备的牡丹花提取物的凝胶渗透色谱图见图1。
表2.标准品和实施例1样品的保留时间及相对分子量
化合物 保留时间(min) 相对分子量Mw
PEG300 25.42 300
PEG600 19.932 600
PEG800 17.659 800
PEG1000 15.153 1000
PEG2000 9.887 2000
PEG4000 4.226 4000
牡丹花低聚糖组分1 10.056 1954
牡丹花低聚糖组分2 15.052 1064
牡丹花低聚糖组分3 22.778 416
由表2可知，本发明制备的牡丹花提取物由3个组分构成，平均分子量分别为1954、1064、416，从主要组分的平均分子量可知，本发明制备的牡丹花提取物中主要成分为低聚糖。
(5)牡丹花低聚糖提取物的单糖组成测定
牡丹花低聚糖水解：称取10mg实施例1制备的牡丹花低聚糖提取物于安瓿瓶中，加入10mL 3mol/L的三氟乙酸甲醇溶液，充入氮气后酒精喷灯封口，于115℃烘箱中水解2h，水解结束后冷却至室温，将水解液转移到25mL圆底烧瓶中，60℃下减压蒸干，加200μL水溶解后再加入1mL 0.5mol/LNaBH4的DMSO溶液，混匀后于40℃水浴还原反应90min。反应结束后，向反应液中依次逐滴加入100μL冰醋酸、200μL 1-甲基咪唑和1mL乙酸酐，混匀，于40℃水浴下进行乙酰化反应10min，反应结束即加入2ml蒸馏水，混匀，再加入2mL氯仿萃取乙酰化产物，用吸管吸出并弃去大部分上层水溶液，下层溶液加2mL水洗涤一次后用1g无水硫酸钠干燥，经0.45μm滤膜过滤后密封放置。
采用气相质谱仪检测，Rxi-5MS毛细管柱，初始温度50℃，保持1min，以3℃/min升温至75℃，保持1min，然后以10℃/min升温至300℃，保持10min；载气为氮气，分流比为10:1，进样口温度为260℃，进样量为1.0uL，测定结果参见图2。
由图2可知，实施例1制备的牡丹花低聚糖水解后的单糖为阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，其物质的量比为2.2:4.5:9.8:7.9。
(二)第一次酶解时复合酶液中酶的种类探讨实验
为了探讨第一次酶解时复合酶液中酶的种类对牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量和的影响，本发明进行了实施例2～7实验，实施例2～7实验的具体内容如下。
实施例2～7：
实施例2～7的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤(1)复合酶液中酶的种类不同，具体参见表3。
测定实施例2～7所得牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量，结果参见表3。
表3复合酶液中酶的种类对牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量的影响
Figure BDA0003714600200000081
由表3可知，使用纤维素酶可提高提取物中总糖的含量，蛋白酶可降解提取物中的蛋白质，果胶酶对提高提取物的收率有一定作用，且其中任一种酶或任意两种酶组合均不能达到三种酶同时使用的效果。
(三)第一次酶解时复合酶液中纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶的质量比探讨实验
1.为了探讨复合酶液中纤维素酶含量对牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量的影响，本发明进行了实施例8～12实验，实施例8～12实验的具体内容如下。
实施例8～12：
实施例8～12的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤(1)复合酶液中纤维素酶的含量不同，具体参见表4。
测定实施例8～12制备的牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量，测定结果参见表4：
表4纤维素酶含量对牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量的影响
Figure BDA0003714600200000091
由表4可知，复合酶液中纤维素酶的用量对总糖含量有较大影响，同时对提取物的收率也有一定影响，纤维素酶的比例过多或过少，均会导致总糖含量低于90％，所以纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶的质量比以6～12：1：2为宜。
2.为了探讨复合酶液中果胶酶含量对牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量和蛋白质含量的影响，本发明进行了实施例13～15实验，实施例13～15实验的具体内容如下。
实施例13～15：
实施例13～15的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤(1)复合酶液中果胶酶的含量不同，具体参见表5。
测定实施例13～15制备的牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量，测定结果参见表5：
表5果胶酶含量对牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量的影响
Figure BDA0003714600200000101
由表5可知：复合酶液中果胶酶的用量对提取物的收率有较大影响，随着果胶酶的增多，提取物的收率提高，但增加到一定程度，提取物中总糖的含量降低，所以纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶的质量比以8：1：1～4为宜。
(四)第一次酶解时复合酶液中三种酶总含量探讨实验：
为了探讨复合酶液中三种酶总含量对牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量的影响，本发明进行了实施例16～19实验，实施例16～19实验的具体内容如下。
实施例16～19：
实施例16～19的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤(1)复合酶液中纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶的总含量不同，具体参见表3。
测定实施例16～19制备的牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量，测定结果参见表6：
表6复合酶液中三种酶含量对牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量的影响
Figure BDA0003714600200000102
由表6可知，随着复合酶液中三种酶总含量的增加，提取物的收率逐渐增加，但当增加至0.35％时，提取物中总糖含量降低，所以第一次酶解的复合酶液中三种酶总含量在0.1％～0.3％范围内为宜。
(五)第二次酶解时混合酶液中酶的种类探讨实验
为了探讨第二次酶解时混合酶液中酶的种类对牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量及相对分子量的影响，本发明进行了实施例20～25的实验，实施例20～25实验的具体内容如下。
实施例20～25：
实施例20～25的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤(2)混合酶液中酶的种类不同，具体参见表7。
测定实施例20～25所得牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量，测定结果参见表7：
表7混合酶液中酶的种类对牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量的影响
Figure BDA0003714600200000111
由表7可知，第二次酶解时混合酶液中纤维素二糖酶、葡聚糖酶、β-半乳糖苷酶对提取物的收率影响较大，原因可能为，这些酶主要的作用是降解提取液中的多糖类成分成为低聚糖，其中任一种酶或任意两种酶组合均不能达到三种酶同时使用的效果。
(六)第二次酶解时混合酶液中纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶的质量比探讨实验：
1.为了探讨第二次酶解时混合酶液中葡聚糖酶含量对低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量影响，本发明进行了实施例26～28实验，实施例26～28实验的具体内容如下。
实施例26～28：
实施例26～28的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤(2)混合酶液中葡聚糖酶的含量不同，具体参见表7。
测定实施例26～28制备的牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量，测定结果参见表8：
表8葡聚糖酶含量对低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量的影响
Figure BDA0003714600200000121
由表8可知，在纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶的质量比为3:(1～3):5范围内，牡丹花低聚糖提取物的收率稳定，总糖含量可达90％以上；再增加葡聚糖酶的比例，牡丹花低聚糖提取物的收率和总糖含量明显降低，说明葡聚糖酶比例增加会加速浓缩液中大分子糖类成分的分解，不利于牡丹花低聚糖的提取。
2.为了探讨第二次酶解时混合酶液中β-半乳糖苷酶的含量对低聚糖提取物的收率、总糖含量的影响，本发明进行了实施例29～32实验，其具体内容如下。
实施例29～32：
实施例29～32的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤(2)混合酶液中β-半乳糖苷酶的含量不同，具体参见表9。
测定实施例29～32制备的低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量，测定结果参见表9：
表9β-半乳糖苷酶含量对低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量影响
Figure BDA0003714600200000131
由表9可知，在纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶的质量比为3:1:(5～10)范围内，牡丹花低聚糖提取物的收率稳定，总糖含量可达90％以上；再增加或降低β-半乳糖苷酶的比例，牡丹花低聚糖提取物的收率和总糖含量明显均降低，不利于本发明牡丹花低聚糖提取物的提取。
3.为了探讨第二次酶解时混合酶液中纤维二糖酶的含量对低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量的影响，本发明进行了实施例33～36实验，其具体内容如下。
实施例33～36：
实施例33～36的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤(2)混合酶液中纤维二糖酶的含量不同，具体参见表10。
测定实施例33～36制备的低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量，测定结果参见表10：
表10纤维二糖酶含量对牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量的影响
Figure BDA0003714600200000132
由表10可知：在纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶的质量比为(1～4):1:5范围内，提取物的收率稳定，总糖含量可达90％以上；
(七)第二次酶解时混合酶液中三种酶总含量探讨实验：
为了探讨第二次酶解时混合酶液中三种酶总含量对低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量的影响，本发明进行了实施例37～41实验的具体内容如下。
实施例37～41：
实施例37～41的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤(2)混合酶液中纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶的总含量不同，具体参见表11。
测定实施例37～41制备的低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量和相对分子量，测定结果参见表11：
表11混合酶液中三种酶总含量对牡丹花低聚糖提取物的收率、总糖含量、蛋白质含量的影响
Figure BDA0003714600200000141
由表11可知，混合酶液中纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶三种酶总含量在0.05％～0.2％范围内，提取物的收率稳定，总糖含量可达90％以上，过多或过少均会对提取物的收率有较大影响，所以第二次酶解的混合酶液中三种酶总含量在0.05％～0.2％范围内为宜。
实施例42：
一种牡丹花低聚糖提取物的制备，包括以下步骤：
(1)将纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶按质量比10:2:2溶于水配制成复合酶液，并使纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶的总重占复合酶液总重的0.10％。将复合酶液与牡丹干花按质量比6:1混合，于60℃、PH 5.0条件下酶解2h，再向酶解液中加入牡丹干花10倍质量的水混合，于90℃提取2.5h，过滤分离渣子和提取液。取渣子与水按质量比1:8混合，于90℃提取2h，过滤，渣子弃去，合并两次提取液，于70℃减压浓缩至相对密度1.08，得浓缩液；
(2)将纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶按质量比2:2:8溶于水配制成混合酶液，并使纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶的总重占复合酶液总重的0.15％。再将混合酶液与步骤(1)得到的浓缩液按质量比1:3混合，于60℃，PH 5.0条件下，酶解3h，酶解结束后冷却，将冷却后的酶解液5000r/m离心10min。离心后取上清液，向上清液中加入活性炭和活性白土，于80℃脱色1h，过滤除去活性炭和活性白土，得脱色液。所述活性炭和活性白土的加入量为牡丹干花质量的15％，所述活性炭和活性白土的质量比为2:1。
(3)向步骤(2)得到的脱色液中加入95％乙醇至乙醇浓度为70％，静置30h，分离沉淀和上清液，取上清液减压浓缩并回收乙醇，浓缩至相对密度为1.04。将得到的浓缩液注入AB-8大孔吸附树脂中，用6倍柱体积水洗脱，收集洗脱液。洗脱液于常温、0.20MPa下依次经50000～105Da、5000～10000Da超滤膜过滤，收集透过液，透过液再于40℃、0.9MPa下经100～300Da的纳滤膜纳滤，收集截留液。将截留液于60℃减压浓缩至相对密度为1.12，得到浓缩液，将浓缩液于真空度60～65Pa、温度-15℃条件下冷冻干燥5h，得牡丹花低聚糖提取物。
实施例43：
一种牡丹花低聚糖提取物的制备，包括以下步骤：
(1)将纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶按质量比6:2:3溶于水配制成复合酶液，并使纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶的总重占复合酶液总重的0.10％。将复合酶液与牡丹干花按质量比4:1混合，于60℃、PH 5.5条件下酶解2h，再向酶解液中加入牡丹干花9倍质量的水混合，于80℃提取3h，过滤分离渣子和提取液。取渣子与水按质量比1:9混合，于80℃提取2h，过滤，渣子弃去，合并两次提取液，于65℃减压浓缩至相对密度1.05，得浓缩液；
(2)将纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶按质量比4:1:7溶于水配制成混合酶液，并使纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶的总重占复合酶液总重的0.15％。再将混合酶液与步骤(1)得到的浓缩液按质量比1:6混合，于60℃，PH 5.5条件下，酶解3h，酶解结束后冷却，将冷却后的酶解液8000r/m离心10min。离心后取上清液，向上清液中加入活性炭，于80℃脱色1h，过滤除去活性炭，得脱色液。所述活性炭的加入量为牡丹干花质量的20％。
(3)向步骤(2)得到的脱色液中加入90％乙醇至乙醇浓度为80％，静置36h，分离沉淀和上清液，取上清液减压浓缩并回收乙醇，浓缩至相对密度为1.04。将得到的浓缩液注入AB-8大孔吸附树脂中，用5倍柱体积水洗脱，收集洗脱液。洗脱液于常温、0.30MPa下依次经50000～105Da、5000～10000Da超滤膜过滤，收集透过液，透过液再于40℃、0.9MPa下经100～300Da的纳滤膜纳滤，收集截留液。将截留液于60℃减压浓缩至相对密度为1.12，得到浓缩液，将浓缩液于真空度60～65Pa、温度-10℃条件下冷冻干燥4h，得牡丹花低聚糖提取物。
(八)本发明制备的牡丹花低聚糖产品的性能测试：
以实施例1制备的牡丹花低聚糖产品为例，对牡丹花低聚糖产品的皮肤损伤修复效果进行试验，具体测试牡丹花低聚糖产品在抗紫外线UVB诱导的人皮肤成纤维细胞(HSF)氧化损伤的效果试验，其分组和测试的操作如下。
(1)HSF细胞(购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)培养：
配制10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM完全培养基，将细胞置于37℃、5％CO2密闭的培养箱中培养，每天换液1次，细胞生长融合至80％，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，显微镜观察待大部分的贴壁细胞形态圆化由瓶壁脱落时，加入新鲜DMEM完全培养基终止消化，然后将细胞悬液分装入多个细胞培养瓶，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养，取对数生长期的3～6代细胞用于实验。
(2)模型组培养：
将HSF细胞以1×106个细胞/孔的密度接种于6孔板中，在37℃的DMEM完全培养液中孵育24h，倒掉培养液，用PBS洗涤2次，每孔留500μL PBS然后进行照射。使用TL-D18W BLB紫外线黑光灯以20J/cm2的剂量照射HSF细胞2.5h，同时正常组细胞培养板以不透光黑布遮盖，其它各组细胞均在相同孵箱内培养。
(3)各分组加药情况：
模型组不加药，试验组细胞经UVB照射后分别在含有不同浓度牡丹花低聚糖的完全培养基中再培养24h后检测。采用MTT法检测细胞存活率，采用流式细胞仪检测细胞中活性氧ROS含量，采用ELISA法测定细胞中超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽氧化物酶GSH-Px和成纤维细胞胶原蛋白酶MMP-1活性。
测定结果参见表12：
表12牡丹花低聚糖产品的性能测试
Figure BDA0003714600200000171
注：同一列，不同的字母表示组间差异显著(P<0.01)
表12的结果显示：与正常组比较，模型组细胞存活率显著降低(P<0.01)，细胞中SOD、GSH-Px含量显著降低(P<0.01)，ROS水平和MMP-1含量显著升高(P<0.01)。与模型组相比，试验组均能显著提高细胞存活率(P<0.01)，细胞中SOD、GSH-Px含量显著升高(P<0.01)，ROS水平和MMP-1含量显著降低(P<0.01)。
结论：紫外线(ultraviolet，UV)是导致皮肤衰老、损伤重要的原因之一，紫外线分3个波段，其中中波段紫外线UVB能量较强、穿透力较弱，主要损伤表皮细胞，破坏皮肤屏障，抑制免疫作用，造成红斑、色素沉着。根据已有的研究显示，紫外线通过氧化作用损伤皮肤中的成纤维细胞，从而造成皮肤的光衰老。所以本试验采用紫外线UVB诱导的人皮肤成纤维细胞HSF氧化损伤模型，验证牡丹花低聚糖的修复作用，结果表明牡丹花低聚糖可显著提高受损细胞的成活率，提高细胞中抗氧化物质SOD的含量，降低促氧化物质，对紫外线UVB诱导的人皮肤成纤维细胞HSF氧化损伤具有明显的修复作用。
上述实施例为本发明的具体实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何不超出本发明设计思路组合、改变、修饰、替代、简化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种牡丹花低聚糖提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将牡丹花与复合酶液按质量比1:4～6混合，进行第一次酶解，然后向酶解液中加入牡丹花质量6～12倍的水，于60～90℃条件下进行提取，提取后过滤，得到提取液，对提取液进行浓缩，得到浓缩液；
所述复合酶液为纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶的混合水溶液；
（2）将步骤（1）得到的浓缩液与混合酶液按质量比3～8:1混合，进行第二次酶解，酶解后离心，取上清液，对上清液进行脱色处理，得到脱色液；
所述混合酶液为纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶的混合水溶液；
（3）对步骤（2）得到的脱色液进行醇沉处理，醇沉后收集上清液，上清液经除醇、浓缩处理后采用大孔吸附树脂进行分离，收集洗脱液；对洗脱液进行过滤处理，对过滤后的洗脱液进行冻干，得到牡丹花低聚糖提取物。
2.根据权利要求1所述的牡丹花低聚糖提取物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述复合酶液中纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶的质量比为6～12:1～2:1～4。
3.根据权利要求2所述的牡丹花低聚糖提取物的制备方法，其特征在于，所述复合酶液中纤维素酶、酸性蛋白酶和果胶酶的总重占复合酶液总重的0.1%～0.3%。
4.根据权利要求1所述的牡丹花低聚糖提取物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述混合酶液中纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶的质量比为1～4:1～3:5～10。
5.根据权利要求4所述的牡丹花低聚糖提取物的制备方法，其特征在于，所述混合酶液中纤维二糖酶、葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶的总重占复合酶液总重的0.05%～0.2%。
6.根据权利要求1所述的牡丹花低聚糖提取物的制备方法，其特征在于，第一次酶解和第二次酶解的酶解条件相同，酶解的温度为40℃～60℃，pH为5.0～6.0，时间为2h～5h。
7.根据权利要求1所述的牡丹花低聚糖提取物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中对洗脱液进行过滤处理的操作为：将洗脱液依次经超滤膜过滤和纳滤膜纳滤。
8.一种利用权利要求1～7任一所述制备方法制备的牡丹花低聚糖产品。
9.权利要求8所述牡丹花低聚糖产品在制备皮肤损伤修复产品中的应用。
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