CN114886901A - 白桦脂酸和rn-18在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用 - Google Patents
白桦脂酸和rn-18在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域，提供白桦脂酸和RN‑18在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用。本发明首次发现化合物白桦脂酸能够有效抑制猪流行性腹泻病毒的增殖，且对细胞的毒性较小，经实验证明，白桦脂酸在体外实验Vero细胞模型上能够有效抑制和杀灭猪流行性腹泻病毒，能够有效抑制猪流行性腹泻病毒的入侵，且细胞毒性较小，可作为一类新的抗猪流行性腹泻病毒的药物，为白桦脂酸和RN‑18开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗猪流行性腹泻病毒药物奠定实验基础。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及白桦脂酸和RN-18在抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的病毒性传染病，以消化道(粪口)为主要传播途径，也可经呼吸道传染，主要特征为仔猪急性腹泻、呕吐、脱水和高死亡率。PEDV已蔓延至全球，是目前养猪业疾病防疫的重大挑战。国内外对PED疫苗开发做了大量的研究工作，但尚未研制出特别有效的PED疫苗。近年来，随着PED疫情的流行，目前经典毒株生产的疫苗已经起不到有效的保护作用。流行毒株产生的疫苗针对性强，但免疫效果也良莠不齐。
白桦脂酸是天然存在的五环三萜，具有抗逆转录病毒，抗疟疾和抗炎特性。白桦脂酸有几种生物来源，如从蒲桃树叶、白桦树皮、酸枣仁中提取；也可以用白桦脂醇为原料通过化学合成得到。九十年代中期经研究发现白桦脂酸可以选择性地杀死人类黑色素瘤细胞而不杀伤健康细胞；白桦脂酸对HIV-1型感染有抑制作用，另外近期的研究表明白桦脂酸对脑瘤、神经外胚层瘤、白血病等恶性肿瘤细胞也有抑制作用。但迄今尚未有关于白桦脂酸用于预防或治疗猪流行性腹泻病毒的报道。
RN-18是HIV-1病毒感染因子的抑制剂。RN-18在非许可的H9和CEM细胞中表现出强大的抗病毒活性，但在MT4或CEM-SS细胞中不具有强大的抗病毒活性。在RN-18的存在下，非允许性H9和CEM细胞中的倒向转录酶活性以依赖剂量的方式大幅减少。但迄今尚未有关于RN-18用于预防或治疗猪流行性腹泻病毒的报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供白桦脂酸在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用，本发明首次证实白桦脂酸和RN-18能够有效抑制猪流行性腹泻病毒的增殖，白桦脂酸对细胞的毒性非常小，在直接杀灭、吸附阻断、复制阻断猪流行性腹泻病毒都有非常显著的效果，RN-18细胞的毒性较小，在复制阻断猪流行性腹泻病毒没有效果，但在直接杀灭、吸附阻断猪流行性腹泻病毒有明显效果，因此具有开发成抗猪流行性腹泻病毒药物的前景。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了白桦脂酸在抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用。
本发明的第二个方面，提供了白桦脂酸在抑制和/或杀灭猪流行性腹泻病毒中的应用。
本发明的第三个方面，提供了RN-18在抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用。
本发明的第四个方面，提供了一种抗猪流行性腹泻病毒药物组合物，活性成分包括：RN-18。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明首次发现化合物白桦脂酸能够有效抑制猪流行性腹泻病毒的增殖，且对细胞的毒性相对较小，经实验证明，白桦脂酸对VERO细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)≥100μM，而对猪流行性腹泻病毒病毒的半数有效浓度(EC50)为50μM；白桦脂酸对猪流行性腹泻病毒的治疗指数为2，表明其具有开发成抗猪流行性腹泻病毒药物的前景，为白桦脂酸开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗猪流行性腹泻病毒药物奠定实验基础并提供新的视野。
(2)本发明首次发现化合物RN-18能够有效抑制猪流行性腹泻病毒的增殖，且对细胞的毒性相对较小，经实验证明，RN-18对VERO细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)大于等于12.5μM，而对猪流行性腹泻病毒的半数有效浓度(EC50)为12.5μM；RN-18对猪流行性腹泻病毒的治疗指数≥1，表明其具有开发成抗猪流行性腹泻病毒药物的前景，为RN-18开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗猪流行性腹泻病毒药物奠定实验基础并提供新的视野。
(3)本申请的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明抗猪流行性腹泻病毒损伤细胞的作用图；
其中：其中A为病毒对照组；B为Vero正常细胞组；C为感染细胞药物试验组(使用50μM白桦脂酸)；
图2为实施例2中白桦脂酸对Vero细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)图；
图3为实施例3中白桦脂酸对猪流行性腹泻病毒的半数有效浓度(EC50)图；
图4为实施例4中白桦脂酸对猪流行性腹泻病毒直接杀伤作用效果图。
图5实施例4中白桦脂酸对猪流行性腹泻病毒吸附的阻断作用效果图。
图6实施例4中白桦脂酸对猪流行性腹泻病毒复制的阻断作用效果图。
图7为实施例5中RN-18对Vero细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)图；
图8为实施例6中RN-18对猪流行性腹泻病毒的半数有效浓度(EC50)图；
图9为实施例7中RN-18对猪流行性腹泻病毒直接杀伤作用效果图。
图10实施例7中RN-18对猪流行性腹泻病毒吸附的阻断作用效果图。
图11实施例7中RN-18对猪流行性腹泻病毒复制的阻断作用效果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术所介绍的，现有技术中，迄今尚未有白桦脂酸用于预防和治疗猪流行性腹泻病毒中的报道。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供白桦脂酸在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用。并因此，白桦脂酸对于预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒相关的疾病是有效的。需要说明的是，该应用是首次公开，与其已知的临床用药用途并不相同，其结构式如下：
其中，抗猪流行性腹泻病毒药物中，白桦脂酸取不低于半数有效浓度(EC50)的药物浓度，白桦脂酸对猪流行性腹泻病毒的半数有效浓度(EC50)为50μM；
根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗猪流行性腹泻病毒相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗。或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
在本发明的意义上，“抗猪流行性腹泻病毒药物”表示一种物质，其所含有的白桦脂酸对猪流行性腹泻病毒具有明显的抑制作用。
因此，本发明的又一个具体实施方式中，提供白桦脂酸在制备抑制和/或杀灭猪流行性腹泻病毒的药物中的应用；或，白桦脂酸在制备抑制猪流行性腹泻病毒增殖药物中的应用；具体的，所述抑制猪流行性腹泻病毒增殖是指对病毒的直接杀灭、吸附阻断方面都有很好的效果。
根据本发明，不仅公开了白桦脂酸在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用，而且还公开了，施用白桦脂酸与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，白桦脂酸还可以与其它非药物活性成分组合使用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物，所述药物组合物由白桦脂酸与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。
本发明的又一具体实施方式中，白桦脂酸取不低于半数有效浓度(EC50)的药物浓度，白桦脂酸对猪流行性腹泻病毒的半数有效浓度(EC50)为50μM；
所述其它药物活性成分包括具有抑制和/或杀灭猪流行性腹泻病毒或者协助抑制和/或杀灭猪流行性腹泻病毒的物质。当然，当白桦脂酸与其他具有抑制和/或杀灭或者协助抑制和/或杀灭猪流行性腹泻病毒等与本发明内容中所提及的相同应用的药物或活性成分联合使用时，其药物浓度理论上可以低于上述半数有效浓度，但也不排除特殊的例外情况。
正如背景技术所介绍的，现有技术中，迄今尚未有RN-18用于预防和治疗猪流行性腹泻病毒中的报道。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供RN-18在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用。并因此，RN-18对于预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒病毒相关的疾病是有效的。需要说明的是，该应用是首次公开，与其已知的临床用药用途并不相同，其结构式如下：
其中，抗猪流行性腹泻病毒药物中，RN-18取不低于半数有效浓度(EC50)的药物浓度，RN-18对猪流行性腹泻病毒的半数有效浓度(EC50)为12.5μM；
根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗猪流行性腹泻病毒相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗。或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
在本发明的意义上，“抗猪流行性腹泻病毒药物”表示一种物质，其所含有的RN-18对猪流行性腹泻病毒具有明显的抑制作用。
因此，本发明的又一个具体实施方式中，提供RN-18在制备抑制和/或杀灭猪流行性腹泻病毒的药物中的应用；或，RN-18在制备抑制猪流行性腹泻病毒增殖药物中的应用；具体的，所述抑制猪流行性腹泻病毒增殖是指对病毒的直接杀灭、吸附阻断方面都有很好的效果。
根据本发明，不仅公开了RN-18在制备抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用，而且还公开了，施用RN-18与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，RN-18还可以与其它非药物活性成分组合使用。
其中，RN-18取不低于半数有效浓度(EC50)的药物浓度，RN-18对猪流行性腹泻病毒的半数有效浓度(EC50)为12.5μM；RN-18对猪流行性腹泻病毒的治疗指数≥1。当然，当RN-18与其他具有抑制和/或杀灭或者协助抑制和/或杀灭猪流行性腹泻病毒等与本发明内容中所提及的相同应用的药物或活性成分联合使用时，其药物浓度理论上可以低于上述半数有效浓度，但也不排除特殊的例外情况。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种抗猪流行性腹泻病毒的药物组合物，所述药物组合物由RN-18与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。
本发明的又一具体实施方式中，RN-18取不低于半数有效浓度(EC50)的药物浓度，RN-18对猪流行性腹泻病毒的半数有效浓度(EC50)为12.5μM；
所述其它药物活性成分包括具有抑制和/或杀灭猪流行性腹泻病毒或者协助抑制和/或杀灭猪流行性腹泻病毒的物质。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1病毒TCID50的测定
将Vero细胞消化后以每孔1×105个/mL的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液，将猪流行性腹泻病毒连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10-1～10-10)接种于长满单层细胞的96孔板，每孔100μL，细胞稀释液含有5μg/mL的胰酶，放入37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞的CPE情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设3个重复，待不再继续发生细胞病变时判定结果。细胞病变孔是以上的细胞发生病变对应的细胞孔，并按Karber法计算病毒TCID50。
表1猪流行性腹泻病毒的TCID50
注：TCID50，Tissue culture infective dose，半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量；即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathiceffect,CPE)所需的病毒量。
结果：在显微镜下的形态学观察发现48h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，72h后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的CPE孔数,并计算出不同浓度的CPE比率，并按Karber法计算猪流行性腹泻病毒的TCID50值：
LgTCID50＝L-D(S-0.5)
(L:最高稀释度的对数；D:稀释度对数之间的差；S阳性孔比率总和)
LgTCID50＝L-D(S-0.5)＝-1-1×(3.33-0.5)＝-3.83
TCID50＝10-3.83/0.1mL
即将该病毒稀释103.83接种100μL可使50％的细胞发生病变。
实施例2白桦脂酸对Vero细胞的毒性实验：
Vero细胞是猪流行性腹泻病毒的易感细胞。因此，首先检测白桦脂酸对Vero细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：
(1)在96孔板内接种100μL细胞(Vero 1×104个/孔)。
(2)培养至Vero单层后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μL含不同药物浓度的无血清DMEM，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μL无血清DMEM培养基。调零孔：不铺细胞。
(3)在37℃，5％CO2条件下培养72h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。
(4)37℃，5％CO2条件下继续培养1h后，在450nm测定吸光值。将正常生长细胞的A450nm设为100％细胞对照。
(5)分析数据，利用GraphPad Prism5计算白桦脂酸的半数细胞毒性浓度(CC50)值。其结果如图2所示。
结果：白桦脂酸出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定白桦脂酸半数中毒浓度≥100μM。
实施例3白桦脂酸对猪流行性腹泻病毒的抑制实验：
(1)在96孔板的每个孔中接种1×104个Vero细胞，37℃，5％CO2培养箱中过夜培养；
(2)弃去培养基，每孔加入100μL 100TCID50的猪流行性腹泻病毒稀释液(含有5μg/mL胰酶)，按照100μM初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％CO2培养箱中培养；
(3)72h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。
(4)分析数据，病毒抑制率(％)＝(药物处理组D450nm值-病毒对照组D450nm值)/(正常细胞对照组D450nm值-病毒对照组D450nm值)×100％，用GraphPad Prism5软件得化合物的半数有效浓度(EC50)值。其结果如图3所示。然后按公式TI＝CC50/EC50，计算相应的治疗指数TI值。
结果：通过CCK-8试剂盒检测细胞活力，可以计算出药物对猪流行性腹泻病毒的有效抑制率。从结果可以看出，白桦脂酸在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对猪流行性腹泻病毒的半数有效浓度(EC50)为50μM。白桦脂酸对猪流行性腹泻病毒的治疗指数为2。
实施例4化合物不同时间加入对猪流行性腹泻病毒复制的影响
将白桦脂酸分别采用药物和病毒预先作用、先加药后加病毒、先加病毒后加药的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。
(1)药物对病毒的直接杀伤作用
将等量的100TCID50病毒液(含有5μg/mL的胰酶)与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用4h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养箱继续培养，本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，72h进行细胞活力检测，用GraphPad Prism5软件得化合物的EC50。
结果：白桦脂酸与猪流行性腹泻病毒预先作用的给药方式下，通过分析软件，白桦脂酸对猪流行性腹泻病毒的作用效果如图4所示。从图4中可以看出，在这种作用式下，白桦脂酸在安全浓度范围内100μM、50μM、25μM对猪流行性腹泻病毒表现出较高抑制作用，表明白桦脂酸对猪流行性腹泻病毒具有一定的直接灭活的作用。
(2)药物对猪流行性腹泻病毒吸附的阻断作用
按每孔1×104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，用无血清DMEM清洗3遍，然后将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μL/孔，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用4h后，弃去上清液，用PBS洗两遍，加入等量的100TCID50病毒液(含有5μg/mL的胰酶)置于37℃、5％CO2培养箱中培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，72h后进行细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。
结果：通过分析软件，白桦脂酸对猪流行性腹泻病毒的作用效果如图5所示，结果显示，在安全浓度范围内，50μM及以上浓度对猪流行性腹泻病毒的有效抑制率能达到100％，表明白桦脂酸能阻止猪流行性腹泻病毒对细胞的吸附作用。
(3)药物对猪流行性腹泻病毒复制的阻断作用
按每孔1×104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，无血清DMEM将细胞洗3遍，将等量的100TCID50病毒液(含有5μg/mL的胰酶)加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用1h后，然后弃去上清液，无血清DMEM将细胞洗2遍，然后加入不同浓度的药物稀释液，每个药液梯度100μL/孔，本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，72h后进行细胞活力检测，分析数据，得出结论。
结果：通过分析软件，白桦脂酸对猪流行性腹泻病毒的复制阻断作用效果如图6所示，结果显示，在安全浓度范围内，100μM、50μM、25μM的白桦脂酸能有效阻断猪流行性腹泻病毒在Vero细胞内的复制。
本发明应用实施例以Vero细胞为载体，在细胞致病模型上，采用病毒药物预先作用、先加药后加病毒、先加病毒后加药的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现白桦脂酸的新型抗病毒作用，对猪流行性腹泻病毒有一定的抑制作用。
实施例5RN-18对Vero细胞的毒性实验：
Vero细胞是猪流行性腹泻病毒的易感细胞。因此，首先检测RN-18对Vero细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：
(1)在96孔板内接种100μL细胞(Vero 1×104个/孔)。
(2)培养至Vero单层后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μL含不同药物浓度的无血清DMEM，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μL无血清DMEM培养基。调零孔：不铺细胞。
(3)在37℃，5％CO2条件下培养60h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。
(4)37℃，5％CO2条件下继续培养1h后，在450nm测定吸光值。将正常生长细胞的A450nm设为100％细胞对照。
(5)分析数据，利用GraphPad Prism5计算RN-18的半数细胞毒性浓度(CC50)值。其结果如图7所示。
结果：RN-18出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定RN-18半数中毒浓度≥12.5μM。
实施例6RN-18对猪流行性腹泻病毒的抑制实验：
(1)在96孔板的每个孔中接种1×104个Vero细胞，37℃，5％CO2培养箱中过夜培养；
(2)弃去培养基，每孔加入100μL 100TCID50的猪流行性腹泻病毒稀释液，细胞稀释液含有5μg/mL的胰酶，按照100μM初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％CO2培养箱中培养；
(3)72h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。
(4)分析数据，病毒抑制率(％)＝(药物处理组D450nm值-病毒对照组D450nm值)/(正常细胞对照组D450nm值-病毒对照组D450nm值)×100％，用GraphPad Prism5软件得化合物的半数有效浓度(EC50)值。其结果如图8所示。然后按公式TI＝CC50/EC50，计算相应的治疗指数TI值。
结果：通过CCK-8试剂盒检测细胞活力，可以计算出药物对猪流行性腹泻病毒的有效抑制率。从结果可以看出，RN-18在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对猪流行性腹泻病毒的半数有效浓度(EC50)为12.5μM。RN-18对猪流行性腹泻病毒的治疗指数≥1。
实施例7化合物不同时间加入对猪流行性腹泻病毒复制的影响
将RN-18分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。
(1)药物对病毒的直接杀伤作用
将等量的100TCID50病毒液与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用4h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μL/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加细胞维持液继续培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，72h进行细胞活力检测，用GraphPad Prism5软件得化合物的EC50。
结果：RN-18与猪流行性腹泻病毒预先作用的给药方式下，通过分析软件，RN-18对猪流行性腹泻病毒直接杀伤作用效果如图9所示。从图9中可以看出，在这种作用式下，RN-18在安全浓度范围12.5μM对猪流行性腹泻病毒表现出60％的抑制作用，表明RN-18对猪流行性腹泻病毒具有一定的直接灭活的作用。
(2)药物对猪流行性腹泻病毒吸附的阻断作用
按每孔1×104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μL/孔，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用4h后，弃去上清液，用PBS洗两遍，加入等量的100TCID50病毒液，病毒液含有5μg/mL的胰酶，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，72h后进行细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。
结果：通过分析软件，RN-18对猪流行性腹泻病毒吸附的阻断作用效果如图10所示，结果显示，在安全浓度范围内，12.5μM浓度的RN-18对猪流行性腹泻病毒有68％的抑制效率，表明RN-18能在一定程度上阻止猪流行性腹泻病毒对细胞的吸附作用。
(3)药物对猪流行性腹泻病毒复制的阻断作用
按每孔1×104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将等量的100TCID50病毒液，含有5μg/mL的胰酶，加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用2h后，然后弃去上清液，PBS将细胞洗2遍，然后加入不同浓度的药物稀释液，每个药液梯度100μL/孔，本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，72h后进行细胞活力检测，分析数据，得出结论。
结果：通过分析软件，RN-18对猪流行性腹泻病毒的复制阻断作用效果如图11所示，结果显示，在安全浓度范围内，RN-18对猪流行性腹泻病毒的有效抑制率基本为零，表明RN-18不能有效阻断猪流行性腹泻病毒在Vero细胞内的复制。
本发明应用实施例以Vero细胞为载体，在细胞致病模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现RN-18的新型抗病毒作用，对猪流行性腹泻病毒有一定的抑制作用。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.白桦脂酸在抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白桦脂酸的给药浓度为25μM～100μM。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白桦脂酸的药物浓度不低于50μM。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白桦脂酸对Vero细胞具有细胞毒性；
或，白桦脂酸对Vero细胞的半数中毒浓度≥100μM。
5.一种抗猪流行性腹泻病毒药物，其特征在于，活性成分包括：白桦脂酸；
给药剂型包括：真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型、片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂。
6.RN-18在抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，RN-18的药物浓度为不低于12.5μM。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，RN-18具有阻止猪流行性腹泻病毒对细胞的吸附作用。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，RN-18对猪流行性腹泻病毒具有直接灭活的作用。
10.一种抗猪流行性腹泻病毒药物组合物，其特征在于，活性成分包括：RN-18。
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