CN116270647A - 利匹韦林在制备抗h1n1亚型猪流感病毒药物中的应用 - Google Patents
利匹韦林在制备抗h1n1亚型猪流感病毒药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体涉及利匹韦林在制备抗H1N1亚型猪流感病毒药物中的应用。本发明首次发现化合物利匹韦林能够有效抑制H1N1亚型猪流感病毒的增殖，且对细胞的毒性较小，经实验证明，利匹韦林在体外实验PK15细胞模型上能够有效抑制和杀灭H1N1亚型猪流感病毒，能够有效抑制H1N1亚型猪流感病毒的入侵，且细胞毒性较小，可作为一类新的抗H1N1亚型猪流感病毒的药物，为利匹韦林开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗H1N1亚型猪流感病毒药物奠定实验基础并提供新的视野。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及利匹韦林在抗H1N1亚型猪流感病毒药物中的应用。
背景技术
H1N1亚型猪流感病毒是一株由人流感病毒和猪流感病毒重配而来的新型H1N1亚型猪流感病毒，该病毒PB2、PB1和M基因来源于甲型H1N1流感病毒，PA、NP和NS基因来源于猪源H3N2亚型流感病毒，HA和NA基因来源于猪源H1N1亚型流感病毒，是一株新型猪流感病毒重配病毒。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供利匹韦林在制备H1N1亚型猪流感病毒药物中的应用。
利匹韦林是一种非核苷类逆转录酶抑制剂，多和其他的抗逆转录病毒药物进行联合使用，对于HIV-1感染极为有效。但迄今尚未有关于利匹韦林用于预防或治疗H1N1亚型猪流感病毒的记载。
本发明首次证实利匹韦林能够有效抑制H1N1亚型猪流感病毒的增殖，且对细胞的毒性较小，因此具有开发成抗H1N1亚型猪流感病毒药物的前景。
本发明的目的之一是提供利匹韦林在制备抗H1N1亚型猪流感病毒药物中的应用。
本发明的目的之二是提供一种抗H1N1亚型猪流感病毒的药物组合物。
为实现上述发明目的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供利匹韦林在制备抗H1N1亚型猪流感病毒药物中的应用。并因此，利匹韦林对于预防和/或治疗H1N1亚型猪流感病毒相关的疾病是有效的。
“抗H1N1亚型猪流感病毒药物”表示一种物质，其对H1N1亚型猪流感病毒具有明显的抑制杀灭作用，对病毒的直接杀灭、吸附阻断、复制阻断方面都有很好的效果。
根据本发明，利匹韦林还可以与其它非药物活性成分组合使用。
有鉴于此，本发明的第二个方面，提供一种抗H1N1亚型猪流感病毒的药物组合物，所述药物组合物由利匹韦林和至少一种其它非药物活性成分构成。
其中，利匹韦林取不低于半数有效浓度(EC50)的药物浓度，利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒的半数有效浓度(EC50)为5.16μM；利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒的治疗指数为19.38。当然，当利匹韦林与其他具有抑制和/或杀灭或者协助抑制和/或杀灭H1N1亚型猪流感病毒等与本发明内容中所提及的相同应用的药物或活性成分联合使用时，其药物浓度理论上可以低于上述半数有效浓度，但也不排除特殊的例外情况。
本发明与现有技术相比，具有如下效果和优点：
本发明首次发现化合物利匹韦林能够有效抑制H1N1亚型猪流感病毒的增殖，且对细胞的毒性相对较小，经实验证明，利匹韦林对PK15细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)是≥100μM，而对H1N1亚型猪流感病毒病毒的半数有效浓度(EC50)为5.16μM；利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒的治疗指数为19.38，表明其具有开发成抗H1N1亚型猪流感病毒药物的前景，为利匹韦林开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗H1N1亚型猪流感病毒药物奠定实验基础并提供新的视野。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例利匹韦林抗H1N1亚型猪流感病毒损伤细胞的作用图；图1A为病毒对照组；图1B为PK15正常细胞组；图1C为感染细胞药物试验组(使用6.25μM利匹韦林)。
图2为本发明实施例2中利匹韦林对PK15细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)图。
图3为本发明实施例3中利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒的半数有效浓度(EC50)图。
图4为本发明实施例5中利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒直接杀伤作用效果图。
图5为本发明实施例5中利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒吸附的阻断作用效果图。
图6为本发明实施例5中利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒复制的阻断作用效果图。
具体实施方式
正如背景技术所介绍的，现有技术中，迄今尚未有利匹韦林用于预防和治疗H1N1亚型猪流感病毒中的报道。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供利匹韦林在制备抗H1N1亚型猪流感病毒药物中的应用。并因此，利匹韦林对于预防和/或治疗H1N1亚型猪流感病毒病毒相关的疾病是有效的。抗H1N1亚型猪流感病毒药物中的活性成分为利匹韦林。需要说明的是，该应用是首次公开，与其已知的临床用药用途并不相同，其结构式如下：
其中，抗H1N1亚型猪流感病毒药物中，利匹韦林取不低于半数有效浓度(EC50)的药物浓度，利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒病毒的半数有效浓度(EC50)为5.16μM；
在本发明的意义上，“抗H1N1亚型猪流感病毒药物”表示一种物质，其所含有的利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒病毒具有明显的抑制作用。
因此，本发明的一些实施例中，提供利匹韦林在制备抑制和/或杀灭H1N1亚型猪流感病毒的药物中的应用；或，利匹韦林在制备抑制H1N1亚型猪流感病毒增殖药物中的应用；具体的，所述抑制H1N1亚型猪流感病毒增殖是指对病毒的直接杀灭、吸附阻断、复制阻断方面都有很好的效果。
根据本发明，利匹韦林还可以与其它非药物活性成分组合使用。
因此，本发明的又一具体实施方式中，提供一种抗H1N1亚型猪流感病毒的药物组合物，所述药物组合物由利匹韦林和至少一种其它非药物活性成分构成。
利匹韦林在该药物组合物中，可以作为唯一的抗H1N1亚型猪流感病毒的活性成分，当利匹韦林与其它至少一种药物活性成分的组合施用时，可以增强利匹韦林在抗H1N1亚型猪流感病毒的作用，因此本发明的一些实施例中，所述药物组合物还包括其它至少一种药物活性成分。
具体地，所述其它药物活性成分包括具有抑制和/或杀灭H1N1亚型猪流感病毒或者协助抑制和/或杀灭H1N1亚型猪流感病毒的物质。
本发明的一些实施例中，利匹韦林取不低于半数有效浓度(EC50)的药物浓度，利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒病毒的半数有效浓度(EC50)为5.16μM。
具体地，其它非药物活性成分包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
本发明的一些实施例中，给药剂型包括液体剂型、固体剂型、外用制剂或喷剂。
具体地，给药剂型包括真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型、片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂。
下面结合具体实施例对本发明技术方案做进一步阐述。
实施例1病毒TCID50的测定
将PK15细胞消化后以每孔1×105个/mL的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液，将H1N1亚型猪流感病毒连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10-1～10-10)接种于长满单层细胞的96孔板，每孔100μL，放入37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞的CPE情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设3个重复，待不再继续发生细胞病变时，用96孔V型板做血凝试验，每孔加入50微升细胞液，然后加入50微升0.75％鸡红细胞，室温静置20分钟，看鸡血是否凝集，读取血凝结果并记录，按Karber法计算病毒TCID50。
表1H1N1亚型猪流感病毒的TCID50
注：TCID50，Tissue culture infective dose，半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量；即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathiceffect,CPE)所需的病毒量。
结果图1所示，在显微镜下的形态学观察发现48h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，72h后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的血凝孔数，并计算出不同浓度的血凝比率，并按Karber法计算H1N1亚型猪流感病毒的TCID50值：
LgTCID50＝L-D(S-0.5)
(L:最高稀释度的对数；D:稀释度对数之间的差；S阳性孔比率总和)
LgTCID50＝L-D(S-0.5)＝-1-1×(5.3-0.5)＝-5.8
TCID50＝10-5.8/0.1mL
即将该病毒稀释105.8接种100μL可使50％的细胞发生病变。
实施例2利匹韦林对PK15细胞的毒性实验：
PK15细胞是H1N1亚型猪流感病毒的易感细胞。因此，首先检测利匹韦林对PK15细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：
(1)在96孔板内接种100μL细胞(PK15 1×104个/孔)。
(2)培养至PK15单层后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μL含不同药物浓度的无血清DMEM(按照200μM初始药物浓度，两倍浓度梯度稀释加药)，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μL无血清DMEM培养基。调零孔：不铺细胞。
(3)在37℃，5％ CO2条件下培养72h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。
(4)37℃，5％ CO2条件下继续培养1h后，在450nm测定吸光值。将正常生长细胞的A450nm设为100％细胞对照。
(5)分析数据，利用GraphPad Prism5计算利匹韦林的半数细胞毒性浓度(CC50)值。其结果如图2所示。
结果：利匹韦林出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定利匹韦林半数中毒浓度为≥100μM。
实施例3利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒的抑制实验：
(1)在96孔板的每个孔中接种1×104个PK15细胞，37℃，5％ CO2培养箱中过夜培养；
(2)弃去培养基，每孔加入100μL 10000TCID50的H1N1亚型猪流感病毒稀释液(用无血清DMEM细胞长满后加入病毒稀释液，按照50μM初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％CO2培养箱中培养；
(3)72h后，用96孔V型板做血凝试验，每孔加入50微升细胞液，然后加入50微升0.75％鸡红细胞，室温静置20分钟，看鸡血是否凝集，读取血凝结果并记录。
(4)分析数据，其结果如图3所示。然后按公式TI＝CC50/EC50，计算相应的治疗指数TI值。
结果：通过血凝检测结果，可以计算出药物对H1N1亚型猪流感病毒的有效抑制率。从结果可以看出，利匹韦林在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对H1N1亚型猪流感病毒的半数有效浓度(EC50)为5.16μM。利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒的治疗指数为19.38。
实施例4化合物不同时间加入对H1N1亚型猪流感病毒复制的影响
将利匹韦林分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。
(1)药物对病毒的直接杀伤作用
将等量的10000TCID50病毒液与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用2h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，按照50μM初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，每个药液梯度100μL/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加细胞维持液继续培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，72h后进行血凝试验检测结果，用GraphPad Prism5软件得化合物的EC50。
结果：利匹韦林与H1N1亚型猪流感病毒预先作用的给药方式下，通过分析软件，利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒的作用效果如图4所示。从图4中可以看出，在这种作用式下，利匹韦林在安全浓度范围内大于6.25μM对H1N1亚型猪流感病毒表现出100％的完全抑制作用，表明利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒具有一定的直接灭活的作用。
(2)药物对H1N1亚型猪流感病毒吸附的阻断作用
按每孔1×104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，按照50μM初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μL/孔，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用2h后，弃去上清液，用PBS洗两遍，加入等量的10000TCID50病毒液置于37℃、5％CO2培养箱中培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，72h后进行血凝试验检测结果，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。
结果：通过分析软件，利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒的作用效果如图5所示，结果显示，在安全浓度范围内，12.5μM及以上浓度对H1N1亚型猪流感病毒的有效抑制率能达到100％，6.25μM浓度对H1N1亚型猪流感病毒的有效抑制率能达到33.33％，表明利匹韦林能阻止H1N1亚型猪流感病毒对细胞的吸附作用。
(3)药物对H1N1亚型猪流感病毒复制的阻断作用
按每孔1×104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将等量的10000TCID50病毒液加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用1h后，然后弃去上清液，PBS将细胞洗2遍，按照50μM初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，然后加入不同浓度的药物稀释液，每个药液梯度100μL/孔，本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，72h后进行血凝试验检测结果，分析数据，得出结论。
结果：通过分析软件，利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒的复制阻断作用效果如图6所示，结果显示，在安全浓度范围内，6.25μM及以上浓度利匹韦林对H1N1亚型猪流感病毒的有效抑制率为100％，表明利匹韦林能有效阻断H1N1亚型猪流感病毒在PK15细胞内的复制。
本发明应用实施例以PK15细胞为载体，在细胞致病模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现利匹韦林的新型抗病毒作用，对H1N1亚型猪流感病毒有一定的抑制作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.利匹韦林在制备抗H1N1亚型猪流感病毒药物中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，抗H1N1亚型猪流感病毒药物中的活性成分为利匹韦林。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于，利匹韦林作为抗H1N1亚型猪流感病毒药物中的唯一活性成。
4.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述抗H1N1亚型猪流感病毒药物中，利匹韦林的半数有效浓度为5.16μM。
5.如权利要求1所述应用，其特征在于，利匹韦林在制备抑制和/或杀灭H1N1亚型猪流感病毒的药物中的应用。
6.如权利要求1所述应用，其特征在于，利匹韦林在制备抑制H1N1亚型猪流感病毒增殖药物中的应用。
7.一种抗H1N1亚型猪流感病毒的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由利匹韦林和至少一种其它非药物活性成分构成。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，还包括其它药物活性成分，所述其它药物活性成分包括具有抑制和/或杀灭H1N1亚型猪流感病毒或者协助抑制和/或杀灭H1N1亚型猪流感病毒的物质。
9.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，其它非药物活性成分包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
10.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，给药剂型包括液体剂型、固体剂型、外用制剂或喷剂。
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