CN114858887A - 一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建 - Google Patents

一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建 Download PDF

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Abstract

本发明属于电化学分析和电化学传感器制备技术领域，公开了一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建，包括硅片基底和由工作电极、辅助电极、参比电极组成的三电极系统，将三电极系统芯片化、微型化作为电化学传感平台，与电化学工作站联用后用于检测金黄色葡萄球菌。将巯基修饰的适配体特征序列自组装固定到金盘电极表面，完成金黄色葡萄球菌适配体特征序列（Apta）的固定。制备的适配体传感器与目标金黄色葡萄球菌(S.aureus)发生特异性结合后，以K3[Fe(CN)6]溶液为指示剂，通过电化学信号的变化如电流降低或阻抗升高可以实现对金黄色葡萄球菌的定性检测。本发明制备得到的微型化电化学适配体传感器对金黄色葡萄球菌有明显响应。

Description

一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建
技术领域
本发明涉及电化学分析和电化学传感器的制备技术领域，更具体的说是涉及一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建。
背景技术
电化学适配体生物传感器是电化学生物传感器的一种，其一般由一个特定适配体序列的电极和用于检测杂交反应的电活性杂交指示剂构成。Labib 等人将金纳米粒子修饰于丝网印刷碳电极上，通过自组装法固定对肠炎链球菌具有高亲和力的适配体探针，构建出一种阻抗型适配体传感器，实现对肠炎链球菌快速检测（Labib M, Zamay A S,Kolovskaya O S, et al. Aptamer-based impedimetric sensor for bacterialtyping. Analytical Chemistry, 2012, 84(19): 8114-8117.）。
芯片电极可适用于对目标物的测定，还可以在芯片电极上修饰和负载各种功能材料，构建不同功能的芯片电极传感器，如修饰适配体构建芯片电极适配体传感器；负载蛋白酶构建芯片电极生物酶传感器等等，有着应用范围广，操作便利，成本较低，样品用量少，检测速度快，更有手机端代替PC端完成控制检测和数据的采集等诸多优势。因体积小，便于携带，可适应各种复杂环境的检测，对社会的生产和发展有着广泛的应用前景。
因此，如何设计一种微型化电化学适配体检测平台的构建是本领域技术人员亟需解决的问题。。
发明内容
有鉴于此，为了改善了传统电化学传感器电极系统体积大，价格昂贵，所需样品多，设备笨重不便携带等诸多缺点，本发明提供了一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建，利用构建的微型化电化学适配体传感器实现对S.aureus更加便利、高效的检测。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建中，包括硅片基底和由工作电极、辅助电极、参比电极组成的三电极系统；
所述硅片基底表面镀有金膜，所述三电极系统集成在所述硅片基底上，所述工作电极为金盘电极（Φ=2 mm），所述辅助电极为金片电极，所述参比电极为Ag/AgCl电极。
所述芯片电极由电极夹固定，所述电极夹主要有固定芯片电极的电极槽以及连接芯片电极的引线针脚，所述引线针脚的末端为可伸缩针脚。
优选的，在上述一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建中，所述硅片基底是边长为1 cm的正方形硅片基底，所述硅片基底设置有边长为0.4 cm的正方形电解池。
本发明还公开了一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建中，包括以下步骤：
（1）将金原材料镀在硅片基底上；
（2）将芯片的三电极依次用浓硝酸、无水乙醇和蒸馏水超声清洗，得到洁净的电极表面；
（3）待电极表面干燥后，在作为参比电极的金基底上涂覆Ag/AgCl浆料，自然晾干后，得到金盘为工作电极，金片为辅助电极以及Ag/AgCl为参比电极的电化学传感器。待电极表面干燥后，在作为参比电极的基底上涂覆Ag/AgCl浆料，自然晾干后，得到Ag/AgCl为参比电极、金盘电极为工作电极，金片电极为辅助电极的电化学传感器。
优选的，在上述一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建中，步骤（1）具体为：
（1-1）备片，准备500μm厚度的硅片；
（1-2）清洗；
（1-3）第一次光刻；
（1-4）KOH腐蚀硅，腐蚀深度200μm，形成反应池，去除光刻胶；
（1-5）热氧生长SiO2，生长厚度200nm，形成一层绝缘层；
（1-6）第二次光刻；
（1-7）溅射Cr/Au：Cr/250nm/Au/750nm，总厚度1μm，形成电极层；
（1-8）正胶剥离，剥离Cr/Au。
优选的，在上述一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建中，所述硝酸为浓硝酸，所述乙醇为无水乙醇。
上述技术方案的有益效果是：利用硝酸的强氧化性除去电极表面部分不溶杂质，乙醇的主要目的是除去电极表面有机物，并且硝酸和乙醇容易从电极表面除去，需要注意的是，其它溶液若满足除杂和易清洗不损害电极的情况则也可替代使用。
优选的，在上述一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建中，所述超声清洗时间为5-8min/次，超声清洗1-3次。
本发明还公开了一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建，包括以下步骤：
（1）Apta在电极表面的自组装
将3.0 µL Apta溶液滴加到金盘电极表面，室温条件下避光自组装90分钟，取出后用TE缓冲液冲洗，记为Apta/Au微芯片电极。
其中TE缓冲液是用于冲洗未固定的适配体以及保护适配体结构不被破坏。
优选的，在上述一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建中，步骤（1）中所述TE缓冲液是由5 mL pH为8 浓度为1 mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）和1 mL pH为8 浓度为0.5 mol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)，用去离子水定容到500 mL，125℃高温灭菌得到。
（2）Apta与S.aureus的杂交
将8.0 µL 含有S.aureus的菌液直接滴涂在Apta/Au微芯片电极表面，室温下杂交反应30分钟后用TE缓冲液冲洗，即完成分子杂交反应，得到S.aureus-Apta/Au微芯片电极。
优选的，在上述一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建中，步骤（2）中所述S.aureus的培养由S.aureus菌种接种到灭活的亚碲酸盐肉汤培养基中，37 ℃恒温箱中培养6小时。再从中取出1 mL菌液，重复上述操作得到S.aureus样品。
（3）电化学检测
以K3[Fe(CN)6]为指示剂，取8.0 µL溶液滴加到步骤（2）得到的微芯片电极的电解池内，通过循环伏安法（CV）的峰电流降低或交流阻抗（EIS）的阻抗值升高可以实现对金黄色葡萄球菌的定性检测。
优选的，在上述一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建中，所述循环伏安法采用的起始电位为0.6 V，终止电位为-0.2 V，电位增量为0.004 V，静止时间为2 s。
优选的，在上述一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建中，所述循环伏安法采用的K3[Fe(CN)6]指示剂浓度为1 mmol/L。
优选的，在上述一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建中，所述交流阻抗法采用的低频率为0.1 Hz高频率为10000 Hz。
优选的，在上述一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建中，所述交流阻抗法采用的K3[Fe(CN)6]指示剂浓度为5 mmol/L。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建，本发明将三电极系统芯片化，与电化学工作站联用，检测金黄色葡萄球菌。将巯基修饰的适配体特征序列自组装固定到金盘电极表面，完成金黄色葡萄球菌适配体特征序列（Apta）的固定。制备的适配体传感器与目标金黄色葡萄球菌(S.aureus)发生特异性结合后，以K3[Fe(CN)6]为指示剂，通过电化学信号的变化如电流降低或阻抗升高可以实现对金黄色葡萄球菌的定性检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1 附图为本发明的芯片三电极系统示意图；
图2 附图为本发明不同修饰电极的循环伏安曲线；其中曲线a为Au芯片裸电极（工作电极为金电极（Φ=2 mm），辅助电极为金电极，参比电极为Ag/AgCl电极），曲线b为Apta/Au芯片电极系统（工作电极为金盘电极（Φ=2 mm），辅助电极为金片电极，参比电极为Ag/AgCl电极），曲线c为S.aureus-Apta/Au芯片电极系统（工作电极为金盘电极（Φ=2 mm），辅助电极为金片电极，参比电极为Ag/AgCl电极）；
图3 附图为本发明不同修饰电极的交流阻抗曲线；其中曲线a为Au芯片裸电极（工作电极为金电极（Φ=2 mm），辅助电极为金电极，参比电极为Ag/AgCl电极），曲线b为Apta/Au芯片电极系统（工作电极为金盘电极（Φ=2 mm），辅助电极为金片电极，参比电极为Ag/AgCl电极），曲线c为S.aureus-Apta/Au芯片电极系统（工作电极为金盘电极（Φ=2 mm），辅助电极为金片电极，参比电极为Ag/AgCl电极）；
在图1中：1为工作电极、2为辅助电极、3为参比电极、4为电解池。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
试剂：金黄色葡萄球菌适配体特征序列、金黄色葡萄球菌、铁氰化钾，氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、乙二胺四乙酸、氢氧化钠、亚碲酸盐肉汤培养基、去离子水。其中铁氰化钾和氯化钾的混合溶液作为检测时的指示剂，三羟甲基氨基甲烷、盐酸、乙二胺四乙酸用来配制TE缓冲液，氢氧化钠用来调节TE缓冲液pH，亚碲酸盐肉汤培养基用来增殖金黄色葡萄球菌。
仪器：CHI660E电化学工作站，高压灭菌锅，无菌接种台，芯片三电极系统(金盘工作电极1、金片辅助电极2和Ag/AgCl参比电极3)，其中三电极系统集成在表面镀有金膜的硅片基底上，工作电极1为金盘电极（Φ=2 mm），辅助电极2为金片电极，参比电极3为Ag/AgCl电极，芯片电极由电极夹固定，电极夹主要有固定芯片电极的电极槽以及连接芯片电极的引线针脚，引线针脚的末端为可伸缩针脚，硅片基底是边长为1 cm的正方形硅片基底，硅片基底设置有边长为0.4 cm的正方形电解池4。
基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建方法如下：
（1）将金原材料按设计的结构镀在硅片基底上，初步形成三电极系统；将芯片的三电极依次用硝酸(1+1)、乙醇(1+1)和蒸馏水超声清洗(5～8 min/次)，得到一个洁净的电极表面，待电极表面干燥后，在作为参比电极的金片基底上，每平方毫米完全涂覆0.5±0.1mg的Ag/AgCl浆料，自然晾干后，得到参比电极，并与金盘电极为工作电极，金片电极为辅助电极构成芯片三电极系统，其结构如图1所示；
（2）Apta在电极表面的自组装
TE缓冲液由5 mL pH为8 浓度为1 mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）和1 mL pH为8 浓度为0.5 mol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)，用去离子水定容到500 mL，125℃高温灭菌得到。用TE缓冲液稀释金黄色葡萄球菌适配体到5 mmol/L，将3.0 µL 适配体溶液滴加到金盘电极表面，室温条件下避光自组装90分钟，取出后用TE缓冲液冲洗，记为Apta/Au微芯片电极。
（3）Apta与S.aureus的杂交
S.aureus由S.aureus菌种接种到灭活的亚碲酸盐肉汤培养基中，37 ℃恒温箱中培养6小时。再从中取出1 mL菌液，重复上述操作得到S.aureus样品。取8.0 µL S.aureus溶液直接滴涂在Apta/Au微芯片电极表面，室温下杂交反应30分钟后用TE缓冲液冲洗，即完成分子杂交反应，得到S.aureus-Apta/Au微芯片电极。
实施例2
不同修饰电极的电化学行为
图2为Au芯片裸电极(a)， Apta/Au芯片电极(b)， S.aureus-Apta/Au芯片电极(c)在1.0 mmol/L K3[Fe (CN)6]和0.5 mol/L KCl混合溶液中的循环伏安图；曲线b的氧化还原峰电流低于曲线a的，说明金黄色葡萄球菌适配体成功自组装到金盘电极表面；曲线c的氧化还原峰电流明显低于曲线b的，说明金黄色葡萄球菌适配体成功捕捉到金黄色葡萄球菌，导致在电极表面的指示剂浓度降低，引起电流下降。
图3为Au芯片裸电极(a)， Apta/Au芯片电极(b)， S.aureus-Apta/Au芯片电极(c)在5.0 mmol/L K3[Fe (CN)6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中的交流阻抗图；曲线b的交流阻抗阻值大于曲线a的，说明金黄色葡萄球菌适配体成功自组装到金盘电极表面；曲线c的的交流阻抗阻值大于曲线b的，说明金黄色葡萄球菌适配体成功捕捉到金黄色葡萄球菌，阻碍界面电子迁移，导致阻值增大。
以上结果表明，制造的一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建，对金黄色葡萄球菌有特异识别的作用，可用于生物电化学分析应用。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建，其特征在于，包括硅片基底和由工作电极、辅助电极、参比电极组成的三电极系统；
所述硅片基底表面镀有金膜，所述三电极系统集成在所述硅片基底上，所述工作电极为金盘电极，所述辅助电极为金片电极，所述参比电极为Ag/AgCl电极。
2.根据权利要求1所述的一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建，其特征在于，所述硅片基底是边长为1 cm的正方形硅片基底，所述硅片基底设置有边长为0.4 cm的正方形电解池。
3.一种权利要求1-2任一项所述的基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建，其特征在于，包括以下步骤：
将金原材料镀在硅片基底上；
将芯片的三电极依次用浓硝酸、无水乙醇和蒸馏水超声清洗，得到洁净的电极表面；
待电极表面干燥后，在作为参比电极的基底上涂覆Ag/AgCl浆料，自然晾干后，得到Ag/AgCl为参比电极、金盘电极为工作电极，金片电极为辅助电极的电化学传感器。
4.根据权利要求3所述的一种基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建方法，其特征在于，所述超声清洗时间为5-8min/次，超声清洗1-3次。
5.一种权利要求1-2任一项所述的基于金盘电极的微型化电化学适配体检测平台的构建，其特征在于，包括以下步骤：
Apta在电极表面的自组装：将3.0 µL Apta溶液滴加到金盘电极表面，室温条件下避光自组装90分钟，取出后用TE缓冲液冲洗，记为Apta/Au微芯片电极；Apta与S.aureus的杂交：
将8.0 µL 含有S.aureus的溶液直接滴涂在Apta/Au微芯片电极表面，室温下杂交反应30分钟后用TE缓冲液冲洗，即完成分子杂交反应，得到S.aureus-Apta/Au微芯片电极；电化学检测：以K3[Fe(CN)6]溶液为指示剂，取8.0 µL溶液滴加到步骤（2）得到的微芯片电极的电解池内，通过循环伏安法（CV）的峰电流降低或交流阻抗（EIS）的阻抗值升高可以实现对金黄色葡萄球菌的定性检测。
6.根据权利要求5所述的一种基于芯片电极检测酶浓度的便携式掌上电化学传感器的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述Apta溶液浓度为5.0 mmol/L，采用的稀释液为TE缓冲液。
7.根据权利要求5所述的一种基于芯片电极检测酶浓度的便携式掌上电化学传感器的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述TE缓冲液配制方法为：取5 mL pH为8 浓度为1 mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）和1 mL pH为8 浓度为0.5 mol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)，用去离子水定容到500 mL，125℃高温灭菌，室温保存备用。
8.根据权利要求5所述的一种基于芯片电极检测酶浓度的便携式掌上电化学传感器的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述S.aureus的培养步骤为：S.aureus菌种接种到灭活的亚碲酸盐肉汤培养基中，37 ℃恒温箱中培养6小时，从中取出1 mL菌液，重复上述操作，得到含菌样品。
9.根据权利要求5所述的一种基于芯片电极检测酶浓度的便携式掌上电化学传感器的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述循环伏安法采用的起始电位为0.6 V，终止电位为-0.2 V，电位增量为0.004 V，静止时间为2 s，采用的K3[Fe(CN)6]指示剂浓度为1.0 mmol/L。
10.根据权利要求5所述的一种基于芯片电极检测酶浓度的便携式掌上电化学传感器的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述交流阻抗法采用的低频率为0.1 Hz高频率为10000 Hz， 采用的K3[Fe(CN)6]指示剂浓度为5 mmol/L。
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