CN114828964B - Kras g12c抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了下式化合物、其药学上可接受的盐以及使用这些化合物和盐用于治疗患者的癌症的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、A、B和Y如本文所述。

Description

KRAS G12C抑制剂
本发明涉及新的三环杂环化合物及其药学上可接受的盐、包含所述三环杂环化合物及其盐的药物组合物和使用所述化合物和盐来治疗癌症如肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胆管癌或食道癌的方法。
MAPK/ERK信号传导通路将细胞外刺激传递到细胞核，从而调节多种细胞响应，包括细胞增殖、分化和凋亡。KRas蛋白质是MAPK/ERK信号传导通路的启动子，作为负责诱导细胞分裂的开关发挥作用。KRas在其非活性状态下与鸟苷二磷酸(GDP)结合，有效地发送负信号来抑制细胞分裂。响应于细胞外信号，KRas被变构激活，允许GDP的核苷酸交换为鸟苷三磷酸(GTP)。在其GTP结合的活性状态下，KRas募集和激活生长因子诱导的信号传递所必需的蛋白质以及其它细胞信号传导受体。KRas-GTP募集的蛋白质的实例有c-Raf和PI3-激酶。KRas作为一种GTP酶将结合的GTP转换回GDP，从而将自身恢复到非活性状态，并再次传递信号以抑制细胞分裂。KRas获得功能性突变表现出GTP结合程度增加和将GTP转化为GDP的能力降低。结果是MAPK/ERK信号增加，其促进了癌细胞生长。KRas在密码子12处的错义突变是最常见的突变，显著降低GTP酶的活性。
在大约30％的人类癌症中已经鉴别出了致癌KRas突变，并且已经证明其激活多个下游信号传导通路。尽管KRas突变很普遍，但是它是一个困难的治疗靶标。(Cox,A.D.Drugging the Undruggable RAS:Mission Possible？Nat.Rev.Drug Disc.2014,13,828-851；Pylayeva-Gupta,y等人,RAS Oncogenes:Weaving a TumorogenicWeb.Nat.Rev.Cancer 2011,11,761-774)。
WO2015/054572和WO2016/164675公开了某些能够与KRas G12C结合的喹唑啉衍生物。WO2016/044772还公开了使用这类喹唑啉衍生物的方法。WO2020/0081282公开了KRasG12C抑制剂。WO2018/206539和WO2020/178282公开了某些能够与KRas G12CRAS蛋白质结合的杂芳基化合物。
仍然需要提供供选的小分子KRas抑制剂。特别地，需要提供可用于治疗癌症的更有效的、可口服递送的KRas抑制剂。更特别地，需要提供特异性抑制KRas GTP活性的小分子抑制剂。还需要提供在相同或降低的KRas抑制活性下表现出更大功效的小分子KRas抑制剂。此外，还希望提供表现出更好的药物动力学/药效学性质的KRas抑制剂。而且，需要提供更有效的KRas抑制剂，其表现出增加的功效以及减少的或最小化的不良或不希望的作用。本发明通过提供新的KRas抑制剂解决了这些需求中的一种或多种。
本发明提供了式I化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
A是-OCH2-、-N(R6)CH2-、-OCH2CH2-、-N(R6)CH2CH2-、-CH2OCH2-或-CH2N(R6)CH2-；
B是-CH2-或-C(O)-；
Y是-C(CN)-或-N-；
R1是-CN、-C(O)C≡CR8或下式的基团
R2是H、甲基或-CH2CN；
R3和R5各自独立地是H、卤素、-C0-3烷基-环丙基、-任选被R10取代1-3次的C1-6烷基、或-O-任选被R10取代1-3次的C1-6烷基；
R4是H、卤素、或-任选被R10取代1-3次的C1-6烷基；
R6是H或-任选被R10取代1-3次的C1-6烷基；
R7是H、卤素、-NR11R12、-CH2NR11R12、-任选被R10或R13取代1-3次的C1-6烷基、-C0-3烷基环丙基、或-O-任选被R10或R13取代1-3次的C1-6烷基；
R8是H、-任选被R10取代1-3次的C1-4烷基、或-任选被R10取代1-3次的C3-6环烷基；
R9是H、卤素、-CN、-C0-3烷基-C3-6环烷基、或-任选被R10取代1-3次的C1-6烷基；
R10在每次出现时独立地是卤素、氧、羟基、-C1-4烷基或-O-C1-4烷基；
R11和R12各自独立地是H、-C1-4烷基或-C1-4杂烷基，其中R11和R12可以组合形成杂环烷基；且
R13在每次出现时独立地是-N-C1-4烷基。
如本文所用的术语卤素指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。如本文所用的术语烷基指一至六个碳原子的饱和直链或支链一价烃基，例如“-C1-6烷基”。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、1-丙基、异丙基、丁基、戊基和己基。如本文所用的术语杂烷基指包含二至五个碳原子和至少一个杂原子的饱和直链或支链一价烃基，例如“-C1-4杂烷基”。如本文所用的术语环烷基指具有三至六个碳原子的饱和单价环状分子，例如“-C3-6环烷基”。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。如本文所用的术语环杂烷基指具有二至五个碳原子和至少一个杂原子的饱和单价环状分子，例如“-C 3-6环杂烷基”。环杂烷基的实例包括但不限于吡咯烷、哌啶、咪唑烷、吡唑烷和哌嗪。
在指示零的情况中，例如-C0-3烷基-C3-6环烷基，取代基团的烷基部分可以是不存在的；因此，如果式I的R9是没有先导烷基的环丙基，则取代基将由对R9所述的-C0-3烷基-环丙基取代基来描述(即，取代基是-C0-环丙基)。
关于R11和R12，当化学上允许形成杂环烷基时，这两个基团可以与它们所连接的氮结合。所述杂环烷基的实例包括但不限于哌啶、哌嗪和吗啉。
在一个实施方案中，本发明提供了式Ia化合物
其中R1、R2、R3、R4、R5、A、B和Y如上文所定义，或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2-、-N(R6)CH2-、-OCH2CH2-、-N(R6)CH2CH2-，或其药学上可接受的盐。在进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2-或-OCH2CH2-，或其药学上可接受的盐。在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2CH2-，或其药学上可接受的盐。
在进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中B是-C(O)-，或其药学上可接受的盐。
在进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中Y是-C(CN)-，或其药学上可接受的盐。
在进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中Y是-N-，或其药学上可接受的盐。
在进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R1是-CN、-C(O)C≡CR8，或其药学上可接受的盐。在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R1是下式的基团
或其药学上可接受的盐。
在进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R2是H或甲基，或其药学上可接受的盐。在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R2是H，或其药学上可接受的盐。
在进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R3是H、卤素、甲基、甲氧基、乙基、异丙基或环丙基，或其药学上可接受的盐。在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R3是卤素(优选F或Cl)，或其药学上可接受的盐。
在进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R4是H或卤素，或其药学上可接受的盐。在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R4是H或F，或其药学上可接受的盐
在进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R5是卤素(优选Cl)，或其药学上可接受的盐。
在进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R6是H或CH3，或其药学上可接受的盐。
在进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R9是H、F、Cl、-CH2F、-CF3或-CH2OH，或其药学上可接受的盐。在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R9是H，或其药学上可接受的盐。
在进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R7是H、-CHF2、-CH2F、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2N(CH3)2或-CH2-吗啉，或其药学上可接受的盐。在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R7是H，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R9是H，和R7是H、-CHF2、-CH2F、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2N(CH3)2、或-CH2-吗啉，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R9是H、F、Cl、-CH2F、-CF3或-CH2OH，和R7是H，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R7和R9均为H，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R1是-CN、-C(O)C≡CR8和R8是H、甲基、-CH2F或-CH2OH，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R1是下式的基团
且R7和R9均为H，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R1是下式的基团
且R7是叔丁基和R9是-CN，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2-、-N(R6)CH2-、-OCH2CH2-、-N(R6)CH2CH2-，且B是-C(O)-，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2-或-OCH2CH2-，且B是-C(O)-，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2CH2-和B是-C(O)-，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2-、-N(R6)CH2-、-OCH2CH2-、-N(R6)CH2CH2-，B是C(O)，和R2是H或-CH3，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2-或-OCH2CH2-，B是-C(O)-，和R2是H或甲基，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2CH2-，B是-C(O)-，和R2是H或甲基，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2-、-N(R6)CH2-、-OCH2CH2-、-N(R6)CH2CH2-，B是-C(O)-，和R2是H，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2-或-OCH2CH2-，B是-C(O)-，和R2是H，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2CH2-，B是-C(O)-，和R2是H，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2CH2-，和R2是H或甲基，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2CH2-，和R2是H，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中B是-C(O)-，和R2是H或甲基，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中B是-C(O)-，和R2是H，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R3和R5各自独立地选自H、卤素或甲基，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R3或R5是卤素，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R3和R5是卤素，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中R3和R5各自独立地选自F或Cl，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中Y是-C(CN)-，和R4是H或卤素(优选F或Cl)，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中Y是-N-，和R4是H或卤素(优选F或Cl)，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中Y是-C(CN)-，和R3和R5各自独立地选自甲基或卤素，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中Y是-C(CN)-，和R3和R5各自是卤素(优选F或Cl)，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中Y是-N-，R3和R5各自独立地选自甲基或卤素，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中Y是-N-，R3和R5各自是卤素(优选F或Cl)，或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2-、-OCH2CH2-、-N(R6)CH2CH2-、-CH2OCH2-或-CH2N(R6)CH2；B是-CH2-或-C(O)-；Y是-C(CN)-或-N-；R1是-CN、-C(O)C≡CR8或下式的基团
R2是H或甲基；R3和R5各自是H、F、Cl或甲基；R4是H或F；R6是H或甲基；R7是H、-CHF2、-CH2F、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2N(CH3)2、-CH2-吗啉或叔丁基；R8是甲基、-CH2F或-CH2OH；和R9是H、F、Cl、-CH2F、-CF3、-CH2OH或CN；或其药学上可接受的盐。
在还进一步的实施方案中，本发明提供了式I或Ia化合物，其中A是-OCH2-或-OCH2CH2-；B是-CH2-或-C(O)-；Y是-C(CN)-或-N-；R2、R7和R8各自是H；R4是H或卤素；R3和R5各自是卤素；或其药学上可接受的盐。
本发明还提供了式II化合物：
其中R是
X是Cl或F；
和m是1或2；
或其药学上可接受的盐。
本发明还提供了式IIa化合物：
其中R是
X是Cl或F；
和m是1或2；
或其药学上可接受的盐。
另一种描述式II化合物的方式是式Ib：
或其药学上可接受的盐，其中：
A是-OCH2-或-OCH2CH2-；
Y是-C(CN)-或-N-；
R3是Cl或F；
当Y是C(CN)时，R4是H或F；和
当Y是N时，R4是F。
另一种描述式IIa化合物的方式是式Ib，其中A是
本发明还提供了选自以下式III-VI中任一者的化合物：
或其药学上可接受的盐。
在另一形式中，本发明提供了式III化合物，其为
或其药学上可接受的盐。
在另一形式中，本发明提供了式IV化合物，其为
或其药学上可接受的盐。
在另一形式中，本发明提供了式V化合物，其为
或其药学上可接受的盐。
在另一形式中，本发明提供了式VI化合物，其为
或其药学上可接受的盐。
本发明还提供了药物组合物，其包含式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供了治疗癌症的方法，该方法包括给需要其的患者施用有效量的式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐。在多个实施方案中，癌症是肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胆管癌或食道癌。在优选的实施方案中，癌症是非小细胞肺癌、胰腺癌或结肠直肠癌。在还更优选的实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。
在另一种形式中，本发明包括治疗癌症的方法，该方法包括给需要其的患者施用有效量的式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的细胞。在另一实施方案中，癌症是非小细胞肺癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，癌症是结肠直肠癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在还另一种实施方案中，癌症是突变型胰腺癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，本发明包括治疗其它来源的载有KRas G12C突变体的癌症的方法。
本发明还提供了治疗患有具有KRAS G12C突变的癌症的患者的方法，该方法包括给需要其的患者施用有效量的式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明还提供了在需要其的患者中调节突变型KRas G12C酶的方法，该方法通过施用式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐来进行。优选地，该方法包括抑制人突变型KRas G12C酶。
本发明还提供了在需要其的患者中治疗癌症的方法，其中所述患者患有被确定为表达KRas G12C突变体蛋白质的癌症。该方法包括给患者施用有效量的式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐。一个或多个癌症细胞的G12C突变状态可以通过本领域已知的多种分析来确定。通常，获得一种或多种含有一个或多个癌症细胞的活组织检查，进行测序和/或聚合酶链反应(PCR)。还可以使用循环无细胞DNA，例如在晚期癌症中。用于确定突变状态(例如在一个或多个癌症细胞中或在循环无细胞DNA中的G12C突变状态)的测序和PCT技术的非限制性实例包括直接测序、下一代测序、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、多重PCR以及焦磷酸测序和多分析物谱(multi-analyte profiling)。
本发明还提供了用于疗法中的式I-VI任一者的化合物或药学上可接受的盐。化合物或其药学上可接受的盐可用于治疗癌症。优选地，癌症是肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胆管癌或食道癌。在优选的实施方案中，癌症是非小细胞肺癌、胰腺癌或结肠直肠癌。在还更优选的实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。在其它实施方案中，癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的癌症细胞。优选地，癌症选自：KRas G12C突变型非小细胞肺癌、KRas G12C突变型结肠直肠癌和KRas G12C突变型胰腺癌。在另一实施方案中，癌症是非小细胞肺癌，并且一个或多个细胞表达KRas G12C突变体蛋白质。在另一实施方案中，癌症是结肠直肠癌，并且一个或多个细胞表达KRas G12C突变体蛋白质。在另一实施方案中，癌症是胰腺癌，并且一个或多个细胞表达KRas G12C突变体蛋白质。在另一实施方案中，在施用化合物或其药学上可接受的盐之前，患者患有被确定具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞的癌症。
本发明还提供了式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物中的用途。优选地，癌症是肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胆管癌或食道癌。在优选的实施方案中，癌症是非小细胞肺癌、胰腺癌或结肠直肠癌。在还更优选的实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。在其它实施方案中，癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的癌症细胞。优选地，癌症选自KRas G12C突变型非小细胞肺癌、KRas G12C突变型结肠直肠癌和KRas G12C突变型胰腺癌。
本发明还提供了治疗癌症的方法，该方法包括给需要其的患者施用有效量的式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及如下的一种或多种：PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CD4/CDK6抑制剂或其药学上可接受的盐、EGFR抑制剂或其药学上可接受的盐、ERK抑制剂或其药学上可接受的盐铂药物和培美曲塞或其药学上可接受的盐，其中所述癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的细胞。本发明还提供了式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐，用于与如下的一种或多种同时、分别或依次组合用于治疗癌症：PD-1或PD-L1抑制剂、CD4/CDK6抑制剂或其药学上可接受的盐、EGFR抑制剂或其药学上可接受的盐、ERK抑制剂或其药学上可接受的盐、铂药物和培美曲塞或其药学上可接受的盐。本发明还提供了组合(产品)，包含式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及如下的一种或多种：PD-1或PD-L1抑制剂、CD4/CDK6抑制剂或其药学上可接受的盐、EGFR抑制剂或其药学上可接受的盐、ERK抑制剂或其药学上可接受的盐、铂药物和培美曲塞或其药学上可接受的盐，用于同时、分别或依次使用用于治疗癌症。
本发明还提供了治疗癌症的方法，该方法包括给需要其的患者施用有效量的式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及PD-1或PD-L1抑制剂，其中所述癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的细胞。本发明还提供了式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐，用于同时、分别或依次与PD-1或PD-L1抑制剂组合用于治疗癌症。本发明还提供了包含式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及PD-1或PD-L1抑制剂的组合(产品)，用于同时、分别或依次使用用于治疗癌症。在一个实施方案中，化合物是式I-VI化合物或其药学上可接受的盐。在另一实施方案中，PD-1或PD-L1抑制剂是帕博利珠单抗(pembrolizumab)。在另一实施方案中，PD-1或PD-L1抑制剂是纳武单抗(nivolumab)。在另一实施方案中，PD-1或PD-L1抑制剂是西米普利单抗(cimiplimab)。在另一实施方案中，PD-1或PD-L1抑制剂是信迪利单抗。在另一实施方案中，PD-1或PD-L1抑制剂是阿特朱单抗(atezolizumab)。在另一实施方案中，PD-1或PD-L1抑制剂是阿维鲁单抗(avelumab)。在另一实施方案中，PD-1或PD-L1抑制剂是德瓦鲁单抗(durvalumab)。在另一实施方案中，PD-1或PD-L1抑制剂是洛达利单抗(lodapilimab)。在另一实施方案中，癌症是非小细胞肺癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，癌症是结肠直肠癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，癌症是突变型胰腺癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，本发明包括治疗其它来源的载有KRas G12C突变体的癌症的方法。
本发明还提供了治疗癌症的方法，该方法包括给需要其的患者施用有效量的式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及CDK4/CDK6抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的细胞。本发明还提供了式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐，用于同时、分别或依次与CDK4/CDK6抑制剂或其药学上可接受的盐组合用于治疗癌症，其中所述癌症具有一个或多个表达突变型KRasG12C蛋白质的细胞。本发明还提供了组合(产品)，包含式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及CDK4/CDK6抑制剂或其药学上可接受的盐，用于同时、分别或依次使用用于治疗癌症，其中所述癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的细胞。在另一实施方案中，CDK4/CDK6抑制剂是阿贝西利(abemaciclib)。在另一实施方案中，CDK4/CDK6抑制剂是哌柏西利(palbociclib)。在另一实施方案中，CDK4/CDK6抑制剂是瑞博西林(ribociclib)。在另一实施方案中，癌症是非小细胞肺癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，癌症是结肠直肠癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，癌症是突变型胰腺癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，本发明包括治疗其它来源的载有KRas G12C突变体的癌症的方法。
本发明还提供了治疗癌症的方法，该方法包括给需要其的患者施用有效量的式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及EGFR抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的细胞。本发明还提供了式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐，用于同时、分别或依次与EGFR抑制剂或其药学上可接受的盐组合用于治疗癌症。本发明还提供了组合(产品)，包含式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及EGFR抑制剂或其药学上可接受的盐，用于同时、分别或依次使用用于治疗癌症。在一个实施方案中，化合物是式I-VI化合物或其药学上可接受的盐。在另一实施方案中，EGFR抑制剂是厄洛替尼(Erlotinib)。在另一实施方案中，EGFR抑制剂是阿法替尼(afatinib)。在另一实施方案中，EGFR抑制剂是吉非替尼(gefitinib)。在另一实施方案中，EGFR抑制剂是西妥昔单抗(cetuximab)。在另一实施方案中，癌症是非小细胞肺癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，癌症是结肠直肠癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，癌症是突变型胰腺癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，本发明包括治疗其它来源的载有KRas G12C突变体的癌症的方法。
本发明还提供了治疗癌症的方法，该方法包括给需要其的患者施用有效量的式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及ERK抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的细胞。本发明还提供了式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐，用于同时、分别或依次与ERK抑制剂或其药学上可接受的盐组合用于治疗癌症，其中所述癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的细胞。本发明还提供了组合(产品)，包含式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及ERK抑制剂或其药学上可接受的盐，用于同时、分别或依次使用用于治疗癌症。在一个实施方案中，化合物是式I-VI化合物或其药学上可接受的盐。在另一实施方案中，ERK抑制剂是LY3214996。在另一实施方案中，ERK抑制剂是LTT462。在另一实施方案中，ERK抑制剂是KO-947。在另一实施方案中，癌症是非小细胞肺癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRasG12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，癌症是结肠直肠癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，癌症是突变型胰腺癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，本发明包括治疗其它来源的载有KRas G12C突变体的癌症的方法。
本发明还提供了治疗癌症的方法，该方法包括给需要其的患者施用有效量的式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及铂药物，其中所述癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的细胞。本发明还提供了式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐，用于同时、分别或依次与铂药物或其药学上可接受的盐组合用于治疗癌症，其中所述癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的细胞。本发明还提供了组合(产品)，包含式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及铂药物，用于同时、分别或依次使用用于治疗癌症。在一个实施方案中，化合物是式I-VI化合物或其药学上可接受的盐。在另一实施方案中，铂药物是顺铂。在另一实施方案中，铂药物是卡铂。在另一实施方案中，铂药物是奥沙利铂。在另一实施方案中，癌症是非小细胞肺癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，癌症是结肠直肠癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，癌症是突变型胰腺癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，本发明包括治疗其它来源的载有KRas G12C突变体的癌症的方法。
本发明还提供了治疗癌症的方法，该方法包括给需要其的患者施用有效量的式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及培美曲塞，其中所述癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的细胞。本发明还提供了式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐，用于同时、分别或依次与培美曲塞组合用于治疗癌症，其中所述癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的细胞。本发明还提供了组合(产品)，包含式I-VI任一者的化合物或其药学上可接受的盐以及培美曲塞，用于同时、分别或依次使用用于治疗癌症，其中所述癌症具有一个或多个表达突变型KRas G12C蛋白质的细胞。在一个实施方案中，化合物是式I-VI化合物或其药学上可接受的盐。在另一实施方案中，癌症是非小细胞肺癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，癌症是结肠直肠癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，癌症是突变型胰腺癌，其中所述癌症具有一个或多个表达KRas G12C突变体蛋白质的细胞。在另一实施方案中，本发明包括治疗其它来源的载有KRas G12C突变体的癌症的方法。
如本文所用的术语“药学上可接受的盐”指被认为是临床和/或兽医学用途可接受的化合物的盐。药学上可接受的盐的实例以及制备它们的通常方法可以在“Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties,Selection and Use”,P.Stahl等人,第2次修订版,Wiley-VCH、2011和S.M.Berge等人,"Pharmaceutical Salts",Journal ofPharmaceutical Sciences,1977,66(1),1-19中找到。
本发明的药物组合物可以使用药学上可接受的添加剂来制备。如本文用于药物组合物的术语“药学上可接受的添加剂”指与组合物或制剂的其它添加剂相容并且对患者无害的一种或多种载体、稀释剂和赋形剂。药物组合物及其制备方法的实例在“Remington:Science and Practice of Pharmacy”,Loyd,V.等人编辑,第22版,Mack Publishing Co.,2012中找到。药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的非限制性实例包括：盐水、水、淀粉、糖、甘露醇和二氧化硅衍生物；粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；高岭土和膨润土；和聚乙二醇。
如本文所用的术语“有效量”指作为剂量的量，其可有效治疗病症或疾病、例如癌性病变或异常细胞生长和/或细胞分裂的进展。作为本领域技术人员的参与医师可以通过使用常规技术和通过观察在类似情况下获得的结果来容易地确定有效量。治疗的每天剂量通常在每天或每天两次约1mg至每天或每天两次1000mg之间的范围，更优选每天或每天两次100mg至每天或每天两次900mg。在确定化合物的有效量或剂量时考虑的因素包括：是否将施用化合物或其盐；其它药剂的共同施用，如果使用的话；待治疗患者的种属；患者的尺寸、年龄和一般健康；病症的受累程度或阶段和/或严重程度；个体患者的响应；施用方式；所施用制剂的生物利用度特征；选择的剂量方案；和其它伴随药物的使用。
治疗医师、兽医或其他医务人员将能够确定用于治疗有需要的患者的化合物有效量。优选的药物组合物可以配制成用于口服施用的片剂或胶囊剂、用于口服施用的溶液剂或可注射溶液。片剂、胶囊剂或溶液剂可以包括有效治疗需要治疗癌症的患者的量的本发明化合物。
如本文所用的术语“治疗”包括减缓、减少或逆转现有症状、病症、病状的进展或严重程度，其可以具体包括减缓癌性病变的生长或者异常细胞生长和/或细胞分裂的进展。
如本文所用的术语“患者”指需要治疗的哺乳动物。优选地，患者是需要治疗癌症、例如载有KRas G12C突变体的癌症的人。
某些缩写定义如下：“ACN”指乙腈；“AIBN”指偶氮二异丁腈；“Boc-Gly-OH”指N-(叔丁氧羰基)甘氨酸；“DCM”指二氯甲烷；“DIEA”指N,N-二异丙基乙胺；“DMAP”指4-二甲氨基吡啶；“DMEM”指Dulbecco改良的Eagle培养基；“DMF”指N,N-二甲基甲酰胺；“DMSO”指二甲亚砜；“DNA”指脱氧核糖核酸；“DPEPhosPdCl2”指二氯双(二苯膦基苯基)醚钯(II)；“DTT”指二硫苏糖醇；“EDTA”指乙二胺四乙酸；“EGTA”指乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸；“ELISA”指酶联免疫吸附试验；“ERK”指细胞外信号调节激酶；“EtOAC”指乙酸乙酯；“EtOH”指乙醇；“FBS”指胎牛血清；“GDP”指鸟苷二磷酸；“GTP”指鸟苷三磷酸；“HPLC”指高效液相色谱法；“HRP”指辣根过氧化物酶；“IPA”指异丙醇；“IPAm”指异丙胺；“LC-ES/MS”指液相色谱法-电喷雾质谱法联用；“LC-MS”指液相色谱法质谱法联用；“MAPK”指有丝分裂原活化蛋白激酶；“MeOH”指甲醇；“NaOMe”指甲醇钠；“NBS”指N-溴代琥珀酰亚胺；“NCS”指N-氯代琥珀酰亚胺；“NMP”指1-甲基吡咯烷-2-酮；“PCR”指聚合酶链反应；“RPMI”指Roswell ParkMemorial Institute；“SCX”指强阳离子交换；“TEA”指三乙胺；“TFA”指三氟乙酸；和“THF”指四氢呋喃。
单独的异构体、对映异构体、非对映异构体和阻转异构体可以在以下列出的化合物合成中的任意方便的点、通过选择性结晶技术或手性色谱法等方法分离或拆分(参见例如J.Jacques等人，“Enantiomers,Racemates,and Resolutions”,John Wiley and Sons,Inc.,1981，和E.L.Eliel和S.H.Wilen，“Stereochemistry of Organic Compounds”,Wiley-Interscience,1994)。本发明包括某些化合物，它们是阻转异构体并且可以以不同的构象或作为不同的旋转异构体存在。阻转异构体是以由于围绕单键的受限旋转而产生的不同构象存在的化合物。如果围绕单键旋转的能量势垒足够高并且相互转化的速率足够慢以允许各个旋转异构体彼此分离，则阻转异构体可以作为单独的化学物质分离出。本发明涵盖本文公开的或可以使用本文公开的化合物制备的所有异构体、对映异构体、非对映异构体和阻转异构体。
式I-VI任一者的化合物容易转化为药学上可接受的盐，并且可以分离为药学上可接受的盐。当添加药学上可接受的酸时可以发生盐形成，以形成酸加成盐。盐也可以在氮或氧脱保护(即除去保护基)的同时形成。盐形成的实例、反应和条件可以在如下文献中找到：Gould,P.L.,“Salt selection for basic drugs”,International Journal ofPharmaceutics,33:201-217(1986)；Bastin,R.J.等人,“Salt Selection andOptimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities”,OrganicProcess Research and Development,4:427-435(2000)；和Berge,S.M.等人,“PharmaceuticalSalts”,JournalofPharmaceuticalSciences,66:1-19,(1977)。
本发明的化合物或其盐可以通过多种方法制备，其中一些在下文的制备例和实施例中说明。每种所述路线的具体合成步骤可以以不同方式组合，或者与来自不同路线的步骤结合，以制备本发明的化合物或盐。以下制备例中各步骤的产物可以通过常规方法、包括萃取、蒸发、沉淀、色谱法、过滤、研制和结晶来回收。
流程1
流程1,步骤A描绘了采用NBS和AIBN在适宜的溶剂如CCl4中使化合物(1)溴化，得到化合物(2)。步骤B显示了采用氰化钾在适宜的溶剂体系、例如EtOH和水中回流使化合物(2)发生亲核取代，得到化合物(3)。步骤C显示了采用氢化钠在适宜的溶剂、例如DMF中使异硫氰酸乙氧羰基酯加成至化合物(3)，随后环化为化合物(4)。步骤D描绘了用NaOH水溶液在回流DMSO中使化合物(4)发生碱性脱保护，随后采用二碳酸二叔丁基酯用适宜的碱如DIEA和催化性DMAP在溶剂体系、例如THF和DMF中脱保护，得到化合物(5)。步骤E显示了化合物(5)的溴与联硼酸频那醇酯采用适宜的碱、例如乙酸钾和催化剂-配体系统、例如乙酸钯和1,1'-双(二异丙基膦基)二茂铁在适宜的溶剂、例如1,4-二噁烷中反应，得到化合物(6)。本领域技术人员将认可，多种催化剂-配体组合可用于进行该反应。
流程2
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流程2描绘了化合物(6)合成的供选路线。步骤A描绘了采用适当还原剂、例如硼氢化钠在适当溶剂、例如EtOH中使苯甲醛(7)还原，得到化合物(8)。步骤B显示了采用亚硫酰氯在适当溶剂、例如DCM中使化合物(8)氯化，得到化合物(9)。步骤C描绘了采用氰化钾在适当溶剂、例如DMSO中在化合物(9)上亲核取代，得到化合物(3)。步骤D显示了采用氢化钠在适宜溶剂、例如DMF中使异硫氰酸乙氧羰基酯加成至化合物(3)，随后采用L-脯氨酸和CuI环化，得到化合物(4)。步骤E描绘了用NaOH水溶液在回流DMSO中使化合物(4)进行碱性脱保护，随后采用二碳酸二叔丁基酯用适宜的碱、例如DIEA和催化性DMAP在溶剂如THF中重新保护，得到化合物(5)。步骤F显示了化合物(5)的溴与联硼酸频那醇酯采用适宜的碱、例如乙酸钾和催化剂-配体系统、例如乙酸钯和双(2-二苯膦基苯基)醚在适宜溶剂、例如1,4-二噁烷中反应，得到化合物(6)。本领域技术人员将认可，可以使用多种催化剂-配体组合以进行该反应。
流程3
流程3,步骤A描绘了用硼氢化钠在MeOH中使化合物(10)醛还原，随后采用甲烷磺酸酐用适宜的碱、例如DIEA在溶剂如THF中进行甲磺酰化，得到化合物(11)。用于将化合物(11)转化为化合物(12)的条件基本上与流程1,步骤B中类似。步骤C显示了采用叔丁醇钾在适宜溶剂、例如DMF中使异硫氰酸乙氧羰基酯加成至化合物(12)，随后环化为化合物(13)。用于将化合物(13)转化为化合物(14)的条件基本上与流程1,步骤D中类似。步骤E显示了化合物(14)的溴与双(新戊基乙二醇)二硼采用适宜的碱、例如乙酸钾和催化剂-配体系统、例如DPEPhosPdCl2在适宜溶剂、例如1,4-二噁烷中反应，得到化合物(15)。本领域技术人员将认可，可以使用多种催化剂-配体组合以进行该反应。
流程4
流程4,步骤A描绘了硫脲的形成：在保持冷的反应温度下使化合物(16)和5-氟-2-甲氧基苯胺反应，然后进行碱性脱保护，得到化合物(17)。步骤B显示了在溴加成后使化合物(17)在氯仿中环化，得到化合物(18)。步骤C描绘了化合物(18)的脱甲基化，其可以如下进行：在惰性气氛中、在保持冷的反应温度下添加BBr3，得到化合物(19)。步骤D显示了采用适宜的碱、例如TEA和催化性DMAP在溶剂体系、例如1,4-二噁烷中用二碳酸二叔丁基酯保护化合物(19)，得到化合物(20)。步骤E显示了用碱、例如吡啶、然后用三氟甲磺酸酐在溶剂、例如DCM处理化合物(20)以得到化合物(21)。步骤F描绘了采用适宜的碱、例如乙酸钾和催化剂、例如四(三苯基膦)钯(0)在适宜的溶剂、例如1,4-二噁烷中化合物(21)的三氟甲磺酸酯与联硼酸频那醇酯反应，得到化合物(22)。本领域技术人员将认可，可以使用多种催化剂-配体组合以进行该反应。
流程5
流程5描绘了化合物(22)的供选合成路径。步骤A描绘了硫脲形成，其中化合物(23)和2-溴-5-氟苯胺在溶剂、例如THF中反应，然后进行碱性脱保护，得到化合物(24)。步骤B显示了采用适当溴化剂、例如三溴吡啶鎓在溶剂、例如硫酸中使化合物(24)溴化和环化，得到化合物(25)。步骤C显示了采用适宜的碱、例如DMAP在溶剂体系、例如DCM中用二碳酸二叔丁基酯保护化合物(25)，得到化合物(26)。步骤D描绘了通过用氢化钠在溶剂、例如THF中在低的温度下处理、然后添加正丁基锂和硼酸三异丙基酯将化合物(26)转化为化合物(22)。
流程6
流程6,步骤A描绘了用NCS在适当溶剂、例如DMF中使化合物(27)氯化，得到化合物(28)。步骤B显示了将化合物(28)的苯胺氮转化为碘的Sandmeyer反应，其反应条件是本领域技术人员已知的，得到化合物(29)。步骤C显示了化合物(29)的酯向化合物(30)的酸的碱性水解。
流程7
流程7,步骤A-C以基本与流程6的步骤A-C中的方法类似的方式进行，得到化合物(32-34)。
流程8
流程8,步骤A以基本上与流程6步骤A的方法类似的方式进行，得到化合物(36)。步骤B显示了将化合物(36)的苯胺氮转化为溴的Sandmeyer反应，其反应条件是本领域技术人员已知的，得到化合物(37)。步骤C以基本上与流程6步骤C的方法类似的方式进行，得到化合物(38)。
流程9
流程9,步骤A以基本上与流程6步骤A的方法类似的方式进行，得到化合物(40)。步骤B以基本上与流程8步骤B的方法类似的方式进行，得到化合物(41)。
流程10
流程10,步骤A描绘了在适宜溶剂、例如DCM中用适宜的还原剂、例如三乙酰氧基硼氢化钠进行化合物(42)和苯甲醛之间的还原性胺化，得到化合物(43)。步骤B显示了采用丙基膦酸酐、用适宜的碱如TEA、在溶剂如DCM中进行的化合物(43)和boc-保护的氨基酸之间的酰胺偶联，得到化合物(44)。步骤C描绘了采用TFA、在溶剂如DCM中进行的化合物(44)的酸性脱保护和重排，得到化合物(45)。步骤D显示了采用还原剂如氢化铝锂、在溶剂如THF中进行的化合物(45)的全面酰胺还原，得到化合物(46)。步骤E描绘了采用二碳酸二叔丁基酯在碳酸氢钠水溶液进行化合物(46)的保护，得到化合物(47)。步骤F显示了通过氢化使化合物(47)脱保护，得到化合物(48)。
流程11
流程11显示了于-78℃采用亚硫酰氯和咪唑、在溶剂如DCM中使化合物(49)环化，然后用高碘酸钠和氯化钌(III)在CAN中处理，得到化合物(50-R)。采用相同的条件合成了对映异构体(50-S)。
流程12
在流程12,步骤A中，显示了用适宜的偶联剂如N,N’-二环己基碳二亚胺、在溶剂如DCM中进行的化合物(51)和苄基甘氨酸乙基酯之间的酰胺欧联。步骤B描绘了采用酸如TFA、在溶剂如DCM中使化合物(52)环化为化合物(53)。步骤C描绘了用还原剂如氢化铝锂在溶剂如THF中进行化合物(53)的全面酰胺还原和脱保护，得到化合物(54)。步骤D显示了采用适宜的催化剂如Pd(OH)2、在溶剂如MeOH中使化合物(54)氢化为化合物(55)。步骤E描绘了化合物(55)的二碳酸二叔丁基酯保护和随后用磷酸形成盐，得到化合物(56)。
流程13
在流程13中，化合物(57)表示来自流程6-9的苯甲酸以及可购买获得的苯甲酸。步骤A显示了采用HATU和适当的碱如DIEA、在溶剂如THF中进行的化合物(57)和化合物(58)之间的酰胺偶联，得到化合物(59)。或者，采用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪和适当的碱如4-甲基吗啉、在溶剂如THF中进行酰胺偶联。本领域技术人员将认可，有多种条件用于进行酰胺偶联。步骤B描绘了采用适当的碱如氢化钠、在溶剂如DMF中将化合物(59)分子内环化为化合物(60)。
流程14
流程14,步骤A以基本上与流程13步骤A的方法类似的方式进行，得到化合物(63)。步骤B由如下组成：以基本上与流程13步骤B的方法类似的方式进行化合物(63)的环化，然后用甲基碘进行甲基化。在此步骤后回收化合物(64)和(65)。
流程15
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流程15,步骤A描绘了通过用三氟乙酸铊(III)在TFA中处理、然后在一氧化碳气氛下添加氧化镁、氯化锂和MeOH以及催化剂如氯化钯(II)使化合物(66)环化，得到化合物(67)。步骤B显示了采用硝酸钾在浓硫酸中使化合物(67)硝化，得到化合物(68)。步骤C显示了采用Pt/C、在溶剂体系如DCM和TFA中使化合物(68)的硝基基团氢化，得到化合物(69)。步骤D显示了将化合物(69)的苯胺氮转化为氯的Sandmeyer反应，其反应条件是本领域技术人员已知的，得到化合物(70)。步骤E描绘了采用适宜的碱如NaOH水溶液在加热下使化合物(70)水解，得到化合物(71)。步骤F显示了采用适宜的碱如NaH、在溶剂体系如DMF和THF中用化合物(50-R)使化合物(71)烷基化，得到化合物(72)。步骤G描绘了采用HATU和适当的碱如DIEA、在溶剂如DMF中使化合物(72)中发生分子内酰胺偶联，得到化合物(73)。
流程16
流程16,步骤A以基本上与流程6步骤A的方法类似的方式进行，得到化合物(75)。步骤B显示了将化合物(75)的苯胺氮转化为碘的Sandmeyer反应，其反应条件是本领域技术人员已知的，得到化合物(76)。步骤C-E以基本上与流程15步骤E-G的方法类似的方式进行，得到化合物(77-79)。
流程17
流程17,步骤A描绘了用适当的氯化剂如NCS、在适当的溶剂如乙酸中、在加热下使化合物(80)氯化，得到化合物(81)。步骤B描绘了采用三苯膦和偶氮二甲酸二异丙基酯、在溶剂如THF中在化合物(81)和(82)之间进行的Mitsunobu反应，得到化合物(83)。步骤C显示了采用二异丙基胺和氯甲酸1-氯乙基酯、在适当的溶剂如DCM中使化合物(83)脱苄基化，得到化合物(84)。步骤D描绘了采用适当的碱如氢氧化锂、在溶剂体系如THF和水中在化合物(84)上进行酯的碱性水解，得到化合物(85)。步骤E描绘了采用丙基膦酸酐、用适宜的碱如TEA、在溶剂如DCM中使化合物(85)进行分子内酰胺偶联，得到化合物(86)。
流程18
流程18显示了采用适当的碱如碳酸铯、在溶剂如DMF中、在加热下化合物(37)和化合物(87)偶联和随后环化，得到化合物(88)。
流程19
流程19,步骤A显示了通过用适宜的碱如KOH、在溶剂体系如氘化EtOH在D2O中处理，将化合物(89)转化为化合物(90)。步骤B描绘了用镁在溶剂如THF中使化合物(90)进行Grignard反应，得到化合物(91)。步骤C显示了用13CO2、在溶剂如THF中使化合物(91)羧基化，得到化合物(92)。步骤D显示了使化合物(92)与草酰氯在溶剂如DCM中用催化性DMF进行反应，得到化合物(93)。
流程20
在流程20中，化合物(94)表示流程13-18中所述的三环核。在步骤A中，采用适宜的还原剂如硼烷二甲硫复合物、在THF中使化合物(94)中的酰胺还原，得到化合物(95)。化合物(94)和化合物(95)均可与硼酸酯进行Suzuki交叉偶联，如流程1-5中所述，采用适宜的催化剂如1,1’-双(二叔丁基膦基)二茂铁二氯化钯、用适宜的碱如磷酸三钾、在溶剂体系如1,4-二噁烷和水中、在加热下进行，得到化合物(96)。或者，该偶联可以采用适宜的催化剂如DPEPhosPdCl2、用碱如碳酸铯、在溶剂如甲苯中、在加热下进行。本领域技术人员将认可，有多种催化剂、碱和溶剂的组合可用于进行这种类型的转化。步骤C显示了用酸如TFA、在溶剂如DCM中使化合物(96)酸性脱保护，得到化合物(97)。步骤D显示了化合物(97)和配偶体之间的偶联，得到式I化合物。配偶体可以是酰氯、羧酸或溴化氰。在使用酰氯的情况中，在溶剂如DCM中使用适宜的碱如TEA或DIEA。还可以使用酰氯以及作为碱的碳酸钾在双相溶剂体系如EtOAc、THF和水中。在配偶体是羧酸的情况中，条件包括适宜的偶联试剂如丙基膦酸酐以及适宜的碱如DIEA、在溶剂如DMF中。如果配偶体是溴化氰，在溶剂如DCM中使用适宜的碱如NaOH水溶液。
制备例和实施例
以下制备例和实施例进一步说明了本发明并代表了本发明化合物的典型合成，但不应解释为以任何方式限制本发明的范围。试剂和起始材料是容易获得的，或者可以通过已知方法或通过采用本领域普通技术人员可以进行的各种修改来容易地合成。
化合物可以通过在Agilent HP1100液相色谱系统上进行的液相色谱法-电喷雾质谱法联用(LC-ES/MS)进行表征。电喷雾质谱测量(以正和/或负模式获得)在与HP1100 HPLC接口的Mass Selective Detector四极质谱仪上进行。LC-MS条件(低pH)：柱：NX C-18 2.1×50mm 3.0μm；梯度：3分钟内5-100％B，然后0.75分钟100％B；柱温：50℃+/-10℃；流速：1.2mL/min；溶剂A：含0.1％HCOOH的去离子水；溶剂B：含0.1％甲酸的ACN；波长214nm。供选的LC-MS条件(高pH)：柱：WATERSTM/>MS C-18柱2.1×50mm，3.5m；梯度：0.25分钟5％的溶剂A，3分钟从5％到100％的溶剂B和0.5分钟100％的溶剂B，或者3分钟10％到100％的溶剂B和0.75分钟100％的溶剂B；柱温：50℃+/-10℃；流速：1.2mL/min；溶剂A：10mM NH4HCO3 pH9；溶剂B：ACN；波长：214nm。
制备型反相色谱法在配备有Mass Selective Detector质谱仪和Leap自动进样器/级分收集器的Agilent 1200LC-ES/MS上进行。高pH方法在75X 30mm5μm粒径色谱柱和10X 20mm保护柱上运行。流速为85mL/min。洗脱液是在ACN中的10mM碳酸氢铵(pH10)溶液。
制备例1
1,3-二溴-2-(溴甲基)苯
将NBS(35.0g,195mmol)加入2,6-二溴甲苯(50.0g,194mmol)在四氯化碳(500mL)中的溶液中。混合物加热至80℃，加入AIBN(3.20g,19.1mmol)。将混合物回流16小时。此后，混合物冷却至环境温度并过滤。滤液用EtOAc稀释，用水、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤。有机物经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。所得残余物在高真空下干燥，得到标题化合物(67.5g,84％)。1H NMR(CDCl3)d 7.58(2H,d),7.04(1H,t),4.86(2H,s)。
制备例2
(2,6-二溴苯基)甲醇
将硼氢化钠(7.83g,207mmol)分三批以10分钟间隔加入2,6-二溴苯甲醛(148.7g,552.3mmol)在EtOH(1.4L)中的0℃搅拌溶液中。在最后加入后，将混合物搅拌30分钟，然后用饱和NH4Cl水溶液(600mL)小心淬灭。加入DCM(1.75L)和水(200mL)，分离各层。水层用DCM萃取额外一次。合并的有机物经硫酸钠干燥，经二氧化硅垫、用EtOAc(2×500mL)冲洗进行过滤。滤液真空浓缩，加入甲苯中，再次真空浓缩，得到标题化合物，为白色固体(148.7g,99％)。1H NMR(DMSO-d6)d 7.66(2H,d),7.17(1H,t),5.20(1H,t),4.74(2H,d)。
制备例3
1,3-二溴-2-(氯甲基)苯
向(2,6-二溴苯基)甲醇(199.3g,749.4mmol)在DCM(1.5L)中的用DMF(0.5mL)处理的0℃溶液中历经1小时滴加亚硫酰氯(160mL,2196mmol)。此后，使混合物温热至环境温度，然后加热至50℃过夜。除去加热，将反应物冷却至0℃，然后小心用水(500mL)淬灭。混合物用DCM稀释，分离各层。有机物用饱和氯化钠水溶液、水和再次用饱和氯化钠水溶液洗涤。有机物经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到标题产物，为白色固体(206.98g,95％)。1H NMR(DMSO-d6)d 7.75(2H,d),7.26(1H,t),4.95(2H,s)。
制备例4
2-(2,6-二溴苯基)乙腈
将1,3-二溴-2-(溴甲基)苯(57.0g,137mmol)和氰化钾(28.0g,417mmol)在EtOH(350mL)和水(90mL)中的混合物回流5小时。然后将混合物冷却至环境温度，真空浓缩。残余物溶于EtOAc中，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。水相用EtOAc萃取。合并的有机萃取物用水和饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。所得残余物经硅胶快速色谱法、用10-100％DCM/己烷洗脱纯化，得到标题化合物(34.5g,87％)。1H NMR(CDCl3)d 7.62(2H,d),7.12(1H,t),4.14(2H,s)。
供选的制备例4
将氰化钾(142.2g,2183.5mmol)加入1,3-二溴-2-(氯甲基)苯(206.98g,727.83mmol)在DMSO(600mL)中的溶液中，于环境温度搅拌2天。此后，将混合物倒入冰水中，搅拌2小时，此时形成白色沉淀物。将沉淀物过滤，用水洗涤三次，然后在真空烘箱中干燥。所得固体经硅胶柱色谱法、用10-70％DCM/己烷洗脱纯化，得到标题化合物，为白色固体(189.23g,94％)。1H NMR(DMSO-d6)d 7.78(2H,d),7.28(1H,t),4.22(2H,s)。
制备例5
N-(4-溴-3-氰基-苯并噻吩-2-基)氨甲酸乙基酯
将2-(2,6-二溴苯基)乙腈(20.0g,71.3mmol)在DMF(200mL)中的溶液冷却至0℃。分批加入氢化钠(60质量％,在石蜡油中)(2.85g,71.3mmol)。添加后，将混合物于0℃搅拌10分钟，然后于0-5℃滴加异硫氰酸乙氧羰基酯(8.60mL,71.4mmol)。添加后，混合物于环境温度搅拌1小时，然后于100℃加热4小时。此后，将溶剂真空蒸发。残余物在EtOAc和饱和碳酸氢钠溶液的混合物中搅拌。过滤收集所得沉淀物，用水洗涤，在真空烘箱中于60-65℃干燥过夜，得到标题化合物(10.5g,45％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)322.8/324.8[M-H]-。
供选的制备例5
将氢化钠(60质量％,在石蜡油中)(24.85g,621.3mmol)混悬于DMF(500mL)中，冷却至0℃。历经1小时向冷的混悬液中滴加2-(2,6-二溴苯基)乙腈(169.14g,615.19mmol)在DMF(600mL)中的溶液，以便温度不升高超过7℃。30分钟后，历经30分钟仍然于0℃加入异硫氰酸乙氧羰基酯(77.81mL,646.0mmol)。将混合物于0℃搅拌10分钟，然后移除冰浴并搅拌另外20分钟。此后，加入L-脯氨酸(14.16g,123.0mmol)和碘化亚铜(11.71g,61.49mmol)，将混合物加热至65℃达4.5小时。将混合物用0.5M EDTA水溶液(4L)处理，用EtOAc(1.6L)稀释，剧烈搅拌过夜。此后，将所得浑浊浆液过滤，收集的固体用水和EtOAc洗涤。将固体真空干燥1.5小时，然后在真空烘箱中干燥另外2小时，得到标题化合物，为白色固体(187.24g,77％)。1H NMR(DMSO-d6)d 11.76(1H,s),8.01(1H,d),7.65(1H,d),7.27(1H,t),4.90(2H,q),1.31(3H,t)。
制备例6
2-氨基-4-溴-苯并噻吩-3-甲腈
将5N NaOH(765mL,3825mmol)加入N-(4-溴-3-氰基-苯并噻吩-2-基)氨甲酸乙基酯(155g,476.6mmol)在DMSO(480mL)中的溶液中。将混合物加热至125℃过夜。此后，除去热，将反应物倒入冰水(4.2L)中，剧烈搅拌10分钟。形成沉淀物，将其过滤，用水洗涤，在真空烘箱中干燥2天，得到标题产物，为黄色固体(73.6g,61％)。1H NMR(DMSO-d6)d 7.96(2H,s),7.70(1H,d),7.46(1H,d),7.02(1H,t)。
制备例7
N-(4-溴-3-氰基-苯并噻吩-2-基)氨甲酸叔丁基酯
将2-氨基-4-溴-苯并噻吩-3-甲腈(20g,79.2mmol)、DIEA(21mL,120mmol)和DMAP(800mg,6.55mmol)在THF(270mL)和DMF(40mL)中的溶液用二碳酸二叔丁基酯(19.6g,87.1mmol)处理。混合物在氮气下于环境温度搅拌18小时。反应混合物用水、碳酸氢钠溶液和EtOAc稀释，然后搅拌10分钟。过滤收集所得沉淀物，用冷EtOAc洗涤，在真空烘箱中于60℃干燥过夜，得到标题化合物，为浅褐色固体(10.8g,38.6％)。滤液进一步用EtOAc萃取两次。合并的有机萃取物用水和饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。所得残余物经硅胶快速色谱法、用20-100％DCM/己烷洗脱纯化，得到另外的化合物(12.5g,45％)，得到总产量23.3g(83％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)351/353[M-H]-。
供选的制备例7
将DIEA(77mL,441mmol)和DMAP(2g,16mmol)加入2-氨基-4-溴-苯并噻吩-3-甲腈(74.5g,294mmol)在THF(2L)中的溶液中，然后加入二碳酸二叔丁基酯(73.1g,325mmol)。混合物于环境温度搅拌过夜。此后，混合物用水、EtOAc和饱和碳酸氢钠水溶液稀释，然后将其过滤，得到灰白色固体。将该固体用水和EtOAc洗涤，然后干燥过夜，得到标题产物(32g,31％)。然后分离滤液层，将水层用EtOAc萃取两次。合并的有机物用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。将所得残余物加入DCM(260mL)中，超声处理，进一步用己烷(275mL)稀释，超声处理，研磨，过滤，得到另外的标题产物(60.5g,58％)，合并产率为92.5g(89％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)351/353[M-H]-。
制备例8
N-[3-氰基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯并噻吩-2-基]氨甲酸叔丁基酯
将N-(4-溴-3-氰基-苯并噻吩-2-基)氨甲酸叔丁基酯(10.90g,30.7mmol)、联硼酸频那醇酯(23.50g,92.54mmol)和乙酸钾(9.05g,92.2mmol)在1,4-二噁烷(150mL)中的溶液于50℃用氮气喷30分钟。向烧瓶中加入1,1'-双(二异丙基膦基)二茂铁(2.25g,5.38mmol)和乙酸钯(0.700g,3.12mmol)，然后在氮气下于100℃加热。2小时后，将混合物冷却至环境温度，用EtOAc稀释，经硅藻土过滤，用EtOAc洗涤。滤液用硅胶(150g)处理，浓缩至干，然后装入短柱中。粗产物经硅胶快速色谱法、用0-50％DCM/己烷洗脱纯化，得到标题化合物(9.15g,67％)。ES/MS m/z:399.2(M-H)。
供选的制备例8
将1,4-二噁烷(500mL)加热至回流，同时用氮气喷1小时。然后将温度降低至80℃，同时继续喷氮气。在该温度下，加入N-(4-溴-3-氰基-苯并噻吩-2-基)氨甲酸叔丁基酯(32g,90.59mmol)、联硼酸频那醇酯(60g,236mmol)、乙酸钾(26.67g,271.8mmol)和最后加入乙酸钯(2.03g,9.04mmol)和双(2-二苯基膦基苯基)醚(8.54g,15.9mmol)。将混合物于100℃加热3小时。此后，除去热，将混合物用EtOAc稀释，经硅藻土过滤，真空浓缩。所得残余物溶于DCM中，用200g二氧化硅处理，真空浓缩。将该二氧化硅装入前置柱中，将该物质经硅胶色谱法、用10-95％DCM和预混95％DCM/EtOAc溶液洗脱纯化。基于相对纯度分离所得级分。将每个集合单独真空浓缩，在己烷中超声处理，研磨，过滤，用己烷冲洗。所得固体干燥过夜，然后合并，得到标题化合物(23.86g,65％)。1H NMR(DMSO-d6)d 11.32(1H,s),8.02(1H,d),7.59(1H,d),7.34(1H,t),1.53(9H,s),1.37(12H,s)。
制备例9
6-溴-2,3-二氟苯甲醇
将6-溴-2,3-二氟苯甲醛(20.0g,88.7mmol)溶于MeOH(250mL)中，分批加入硼氢化钠(6.70g,177mmol)。将放热反应物冷却至环境温度(～1小时)后，将反应混合物倒入饱和氯化铵溶液中，用DCM萃取三次。合并的有机萃取物用水和饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。残余物在高真空下干燥过夜，得到标题化合物，为白色固体(19.5g,97％)。1H NMR(CDCl3)d 7.37(1H,m),7.07(1H,m),4.88(2H,m),2.13(1H,m)。
制备例10
甲磺酸(6-溴-2,3-二氟苯基)甲基酯
将6-溴-2,3-二氟苯甲醇(19.5g,85.7mmol)溶于THF(200mL)中，加入DIEA(18.0mL,103mmol)。混合物冷却至0℃，然后用甲磺酸酐(17.1g,94.2mmol)处理。于环境温度搅拌18小时后，混合物用EtOAc:甲基叔丁基醚(1:1)稀释，用冷水洗涤。分离各层，水层用EtOAc:甲基叔丁基醚(1:1)萃取两次。合并的有机物用水和饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸镁和碳酸钾干燥，过滤，真空浓缩，得到标题化合物，为黄色油状物(26.0g,99+％)。1H NMR(CDCl3)d 7.44(1H,m),7.18(1H,m),5.43(2H,d),3.12(3H,s)。
制备例11
2-(6-溴-2,3-二氟-苯基)乙腈
将甲磺酸(6-溴-2,3-二氟苯基)甲基酯(26.0g,82.0mmol)和氰化钾(6.06g,90.3mmol)在EtOH(200mL)和水(40.0mL)中的混合物回流30分钟，然后冷却至环境温度。真空除去溶剂，将残余物混悬于DCM中。混合物用水、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤。有机物经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。粗产物经硅胶快速柱色谱法、用10-100％DCM/己烷洗脱纯化，得到标题化合物(17.9g,94％)。1H NMR(CDCl3)d 7.44(1H,m),7.15(1H,m),3.91(2H,d)。
制备例12
N-(4-溴-3-氰基-7-氟-苯并噻吩-2-基)氨甲酸乙基酯
将2-(6-溴-2,3-二氟-苯基)乙腈(17.9g,77.2mmol)在DMF(200mL)中的溶液在冰浴中冷却，然后用叔丁醇钾(9.30g,81.2mmol)分批处理。添加后，将混合物搅拌10分钟(反应物变为深红色)，滴加异硫氰酸乙氧羰基酯(9.80mL,81.4mmol)。反应混合物于环境温度搅拌1小时，然后于100℃加热30分钟。然后将混合物在冰浴中冷却10分钟，在搅拌下缓慢加入水(500mL)。过滤收集所得沉淀物，用水和己烷冲洗，风干。将固体进一步在真空烘箱中于60℃干燥过夜，得到标题化合物(24.5g,84％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)340.8/342.8[M-H]-。
制备例13
2-氨基-4-溴-7-氟-苯并噻吩-3-甲腈
将N-(4-溴-3-氰基-7-氟-苯并噻吩-2-基)氨甲酸乙基酯(24.5g,71.4mmol)、DMSO(100mL)和5N NaOH(80.0mL,400mmol)的混合物回流4小时。混合物冷却至环境温度，在剧烈搅拌下用冷水处理。过滤收集所得沉淀物，用水洗涤，在真空烘箱中于65℃干燥过夜，得到标题化合物(15.5g,80％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)268.8/270.8[M-H]-。
制备例14
N-(4-溴-3-氰基-7-氟-苯并噻吩-2-基)氨甲酸叔丁基酯
以基本与制备例7的方法类似的方式，由2-氨基-4-溴-7-氟-苯并噻吩-3-甲腈制得标题化合物。ES/MS m/z(79Br/81Br)314.8/316.8[M-t-Bu+H]+。
制备例15
N-[3-氰基-4-(5,5-二甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环己烷-2-基)-7-氟-苯并噻吩-2-基]氨甲酸叔丁基酯
在氮气下将N-(4-溴-3-氰基-7-氟-苯并噻吩-2-基)氨甲酸叔丁基酯(16.0g,41.4mmol)和双(新戊基乙二醇)二硼(37.0g,157mmol)溶于1,4-二噁烷(300mL)中。加入乙酸钾(12.2g,124mmol)，混合物于50℃用氮气喷1小时。加入DPEPhosPdCl2(3.0g,4.2mmol)，烧瓶于95℃加热1小时。然后将混合物冷却至环境温度，真空浓缩至～100mL，用己烷(200mL)稀释，搅拌10分钟，然后经硅藻土、用己烷和己烷:甲基叔丁基醚(1:1)冲洗过滤。将滤液浓缩，溶于最少DCM中，经二氧化硅胶垫、用EtOAc:己烷(1:1)冲洗过滤。滤液用饱和氯化铵溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤。有机物经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。残余物经硅胶快速柱色谱法、用5-50％(20％丙酮，在DCM中)/己烷洗脱纯化，得到标题化合物(13.0g,78％)。1H NMR(DMSO-d6)d 11.6(1H,s),7.61(1H,m),7.20(1H,m),3.78(4H,s),1.54(9H,s),1.03(6H,s)。
制备例16
(5-氟-2-甲氧基-苯基)硫脲
在氮气下将异硫氰酸苯甲酰基酯(110g,671mmol)和THF(875mL)合并，冷却至5℃。滴加5-氟-2-甲氧基苯胺(83.2mL,705mmol)，同时维持反应内温低于10℃。混合物温热至环境温度，搅拌30分钟。加入5N NaOH(161mL,805mmol)和水(200mL)，混合物于回流加热3.5小时。此后，加入水(500mL)和乙酸异丙基酯(800mL)，混合物冷却至环境温度。加入浓HCl水溶液调节pH至～9-10。分离各层。有机层经无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。将EtOAc(360mL)和己烷(840mL)加入残余物中，混合物回流5分钟。此后，混合物冷却至-20℃，放置过夜。过滤出所得固体，所收集的固体用冷己烷洗涤，得到标题化合物，为无色固体(118g,88％)。ES/MS m/z:201(M+H)。
制备例17
7-氟-4-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-胺氢溴酸盐
在氮气下将(5-氟-2-甲氧基-苯基)硫脲(118g,571mmol)和CHCl3(2L)的溶液冷却至5℃。滴加溴(30.1mL,582mmol)，同时维持反应内温低于7℃。将混合物于0℃搅拌30分钟，然后于回流加热2.25小时。此后，混合物冷却至-20℃，放置过夜。过滤出所得固体，用冷己烷洗涤，得到标题化合物，为黄色固体(141g,89％)。ES/MS m/z:199(M+H)。
制备例18
2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-醇氢溴酸盐
在氮气下于0℃经由套管将BBr3(150mL,1589mmol)加入DCM(1.5L)中。历经15分钟分批加入7-氟-4-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-胺氢溴酸盐(141g,506mmol)，使反应混合物缓慢温热至环境温度，搅拌过夜。混合物冷却至0℃，用MeOH小心萃取，同时维持内温低于10℃。在淬灭时，将气体输出充入冷5N NaOH中。过滤所得固体，用冷DCM洗涤，得到标题化合物，为无色固体(117g,87％)。ES/MS m/z:185(M+H)。
制备例19
(7-氟-4-羟基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨甲酸叔丁基酯
将在1,4-二噁烷(1.5L)中的2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-醇氢溴酸盐(117g,441mmol)冷却至10℃。加入TEA(129mL,926mmol)，同时维持反应内温低于15℃。加入DMAP(2.7g,22mmol)和二碳酸二叔丁基酯(228g,1014mmol)，反应混合物缓慢温热至环境温度，搅拌2天。混合物用水、EtOAc和饱和氯化钠水溶液稀释，分离各层。有机层真空浓缩。加入MeOH(900mL)和NaOMe(5M,在MeOH中,132mL)，混合物于环境温度搅拌过夜。加入另外的NaOMe(5M,在MeOH中,10mL)，混合物于环境温度搅拌3小时，然后真空浓缩。加入水和EtOAc，分离各层。有机层经无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩直至固体形成。加入己烷，将所得固体过滤和用己烷洗涤，得到标题化合物，为浅褐色固体(97.2g,78％)。ES/MS m/z:283(M-H)。
制备例20
三氟甲磺酸2-[(叔丁氧羰基)氨基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基酯
将(7-氟-4-羟基-1,3-苯并噻唑-2-基)氨甲酸叔丁基酯(116g,407mmol)、DCM(1.4L)和吡啶(66mL,814mmol)合并，在氮气下冷却至5℃。滴加三氟甲磺酸酐(83mL,488mmol)，同时维持反应内温低于10℃。混合物用水稀释，分离各层。有机层用10％柠檬酸水溶液洗涤。有机层经无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。所得残余物经正相色谱法、用B在A中的25-28％梯度(A:己烷,B:DCM在EtOAc中的25％溶液)洗脱纯化，得到标题化合物，为黄色固体(123g,73％)。ES/MS m/z:415(M-H)。
制备例21
N-[(2-溴-5-氟-苯基)氨基甲硫酰基]苯甲酰胺
将2-溴-5-氟苯胺(250g,1289.4mmol)在THF(400mL)中的溶液用顶置机械搅拌器搅拌。采用分液漏斗历经30分钟加入在THF(800mL)中的异硫氰酸苯甲酰基酯(130g,780.6mmol)。在加入期间使用水浴保持内温低于30℃。1.5小时后，将反应混合物等同地倒入三个含水(3L)的4升烧瓶中。所得固体经烧结玻璃漏斗真空过滤。将固体用去离子水(8L)冲洗，真空风干，得到标题化合物，为褐色固体(456g,99+％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)353/355[M-H]-。
制备例22
(2-溴-5-氟-苯基)硫脲
向N-[(2-溴-5-氟-苯基)氨基甲硫酰基]苯甲酰胺(1600g,4.53mol)、THF(6L)和MeOH(1.6L)的混悬液中加入5N NaOH水溶液(1L)。于环境温度搅拌18小时后，将反应混合物经硅藻土垫过滤以除去黑色颗粒。将垫子用THF/MeOH、然后100％MeOH冲洗。真空除去溶剂，获得褐色固体。向固体中加入冰水(4L)，在使用顶置搅拌器的情况下以100mL分批加入5NHCl(～300mL)以调节pH至7。加入另外的冰水，混合物搅拌～1小时。加入水(4L)，混悬液经大的烧结玻璃漏斗真空过滤。固体用去离子水冲洗，除去大部分水后，将固体用己烷(8L)冲洗和风干。固体放置在50℃真空烘箱中达24小时，得到标题化合物，为灰白色固体(1035g,92％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)249/251[M-H]-。
制备例23
4-溴-7-氟-1,3-苯并噻唑-2-胺
将冰/氯化钠浴冷却的硫酸(350mL)用顶置搅拌器搅拌。历经5分钟分批加入(2-溴-5-氟-苯基)硫脲(130.5g,523.9mmol)。10分钟后，内温达到～1℃。在氮气下，历经～15分钟的时间分8批加入三溴吡啶鎓(185g,549.53mmol)，同时保持内温低于5℃。产生的蒸汽穿过用冰冷却的NaOH阱。于～0℃达75分钟后，将反应物温热至环境温度。然后将反应物加热至内温为50℃，然后逐渐加热至59℃。1.5小时后，将反应物冷却至环境温度。反应混合物倒入含有冰的大烧瓶中。用18.9N NaOH(620mL)小心调节pH至～7。固体经烧结玻璃漏斗过滤，用去离子水冲洗直至滤液pH与去离子水的pH匹配。将固体风干，然后在～50℃真空烘箱中放置24小时，得到标题化合物，为褐色固体(129.3g,99+％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)247/249[M+H]+。
制备例24
N-(4-溴-7-氟-1,3-苯并噻唑-2-基)氨甲酸叔丁基酯
经由添加漏斗向4-溴-7-氟-1,3-苯并噻唑-2-胺(370.6g,1500mmol)和DMAP(36.6g,300mmol)在DCM(1500mL)中的搅拌混悬液逐批加入溶于DCM(150mL)中的二碳酸二叔丁基酯(388g,1724mmol)溶液，速度为控制气体产生的速度。将反应混合物于环境温度搅拌1小时，然后加入另外一批二碳酸二叔丁基酯(5.0g,23mmol)。反应混合物于环境温度搅拌30分钟，然后加入10％柠檬酸水溶液(800mL)，分离各层。水层用DCM萃取两次，合并的有机萃取物用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤一次。有机层真空浓缩，向残余物中加入DCM(200mL)和己烷(1800mL)。将所得浆液过滤，风干，保留所收集的固体。滤液真空浓缩，向残余物中加入MeOH(500mL)和甲醇钠(20mL,5N,在MeOH中,100mmol)。混合物于45℃真空浓缩。向残余物中加入MeOH(500mL)和5N NaOH(100mL,500mmol)。混合物于45℃真空浓缩。向残余物中加入水和DCM，分离各层。水层用DCM萃取一次。有机物经无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。向残余物中加入100mL DCM和900mL己烷，所得固体制浆，过滤,风干，与最初获得的固体合并，得到标题化合物，为灰白色固体(489.55g,94％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)290.8/292.8[M-t-Bu+H]+。
制备例25
[2-(叔丁氧羰基氨基)-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基]硼酸
将三氟甲磺酸2-[(叔丁氧羰基)氨基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基酯(20.0g,48.1mmol)、乙酸钾(14.2g,144mmol)、联硼酸频那醇酯(97.7g,385mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(5.55g,4.8mmol)和1,4-二噁烷(240mL)合并，充入氮气10分钟。混合物于80℃加热过夜，然后冷却至环境温度，用水和EtOAc稀释。分离各层。有机层经无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。加入丙酮(500mL)、水(500mL)和乙酸铵(112g,1443mmol)。然后加入NaIO4(309g,1443mmol)，同时保持反应内温介于18-23℃。混合物于环境温度剧烈搅拌过夜。此后，加入EtOAc。混合物搅拌30分钟，经硅藻土过滤，分离各层。有机层真空浓缩。水层用饱和氯化钠水溶液稀释，用EtOAc萃取两次。将这些有机萃取物与之前浓缩的有机层合并。合并的萃取物用水、饱和氯化钠水溶液、水和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。有机层经无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。残余物在己烷中用少量DCM制浆。所得固体过滤，用己烷洗涤，得到标题化合物，为褐色固体(13.4g,89％)。ES/MS m/z:313(M+H)。
供选的制备例25
于-17℃内温历经15分钟向氢化钠(60％,在石蜡油中)(34.6g,865mmol)在THF(2000mL)中的混悬液中加入N-(4-溴-7-氟-1,3-苯并噻唑-2-基)氨甲酸叔丁基酯(250.18g,720.6mmol)溶于THF(500mL)中的溶液，在添加过程中保持内温为-10℃至-15℃。添加后，混合物于-10℃至-15℃搅拌15分钟，此时气体产生停止。反应混合物冷却至内温为-65℃，然后历经30分钟经由添加漏斗滴加正丁基锂(350mL,2.5M己烷溶液,875mmol)，速度使得内温保持在-60℃至-65℃。添加后，反应混合物在该温度下搅拌20分钟，然后历经15分钟滴加硼酸三异丙基酯(416mL,1800mmol)，保持内温低于-60℃。历经5小时45分钟使反应混合物缓慢温热至内温为0℃，然后小心加入饱和氯化铵水溶液(400mL)以控制气体放出。向混合物中加入水(400mL)和EtOAc(400mL)，分离各层。向水层中加入足够的1N HCl水溶液以使pH为3-4，然后将水层用EtOAc萃取两次。合并的有机萃取物经无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。向残余物中加入n-己烷(500mL)，混合物于55℃真空浓缩。向残余物中加入另一份n-己烷(500mL)，混合物于55℃真空浓缩。向固体残余物中加入200mL DCM和1800mL己烷，将混合物制浆。固体过滤，用己烷洗涤，风干，得到标题化合物，为灰白色固体(217.2g,94％)。ES/MS m/z:313(M+H)。
制备例26
4-氨基-3,5-二氯-2-氟-苯甲酸甲基酯
将4-氨基-2-氟-苯甲酸甲基酯(27.0g,160mmol)和NCS(46.3g,336mmol)溶于DMF(300mL)中，于80℃加热。40分钟后，将反应混合物倒在冰水上，用EtOAc萃取两次。合并的有机萃取物用5N NaOH洗涤一次，用0.2N LiCl水溶液洗涤两次，经无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩，得到标题化合物(37.0g,97％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)238/240[M+H]+。
表1：以基本上类似于制备例26的方式合成的化合物
制备例29
3,5-二氯-2-氟-4-碘-苯甲酸
将碘化亚铜(10.0g,51.5mmol)、ACN(128mL)和亚硝酸叔丁基酯(13.6mL,103mmol)合并，混合物于50℃加热30分钟，然后向混合物中加入4-氨基-3,5-二氯-2-氟-苯甲酸甲基酯(6.11g,25.7mmol)。注意到气体放出。于50℃达1小时40分钟后，真空除去溶剂。加入水、EtOAc和1N HCl水溶液。水层用EtOAc萃取两次。合并的有机萃取物用亚硫酸氢钠水溶液洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。粗混合物经硅胶快速色谱法、用EtOAc在己烷中的3-5％溶液洗脱纯化。将最干净的级分合并，真空浓缩，得到甲基酯中间体(5.85g,65％)。
向3,5-二氯-2-氟-4-碘-苯甲酸甲基酯(5.85g,16.8mmol)中加入MeOH(170mL)和1N NaOH水溶液(17mL)。在历经40分钟于环境温度搅拌的过程中，物质完全溶解。真空除去MeOH。向残余物中加入EtOAc和1N HCl水溶液。水层用EtOAc萃取两次，合并的有机萃取物经无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩，得到标题化合物(5.56g,99％):1H NMR(CDCl3)d 8.063-8.08(d,1H,J＝6.34Hz)。
制备例30
5-氯-2-氟-4-碘-3-甲基-苯甲酸甲基酯
将在ACN(100mL)中的4-氨基-5-氯-2-氟-3-甲基-苯甲酸甲基酯(14.8g,68.0mmol)加入到碘化亚铜(15.7g,82.4mmol)、ACN(100mL)和亚硝酸叔丁基酯(12.3mL,103mmol)的搅拌混合物中。混合物在N2下于40℃加热18小时。混合物真空浓缩至原体积的一半，用EtOAc稀释和经硅藻土过滤两次。将收集的滤液真空浓缩。粗混合物经硅胶快速色谱法、用EtOAc的己烷溶液洗脱纯化。将最干净的级分合并，真空浓缩，得到标题化合物(22.46g,52.8％)。1H NMR(CDCl3)d 7.91(d,J＝6.6Hz,1H),3.95(s,3H),2.53(d,J＝3.1Hz,3H)。
制备例31
4-氨基-3-氯-2,5-二氟-苯甲酸甲基酯
于环境温度向4-氨基-2,5-二氟苯甲酸甲基酯(25g,127mmol)在DMF(100mL)中的溶液中加入NCS(19.9g,146mmol)，然后将混合物于45℃加热18小时。反应混合物倒入水(1.5L)和二乙醚(1.2L)的混合物中，分离各层。水层用二乙醚(1L)萃取。合并的有机萃取物用冷1N NaOH水溶液、水和饱和氯化钠水溶液洗涤。有机物经无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。残余物经硅胶快速柱色谱法、用10-30％(75％EtOAc，在DCM中)/己烷洗脱纯化，得到标题化合物(24.5g,87％)。ES/MS m/z:222.2(M+H)。
制备例32
4-溴-3-氯-2,5-二氟-苯甲酸甲基酯
将在ACN(100mL)中的4-氨基-3-氯-2,5-二氟-苯甲酸甲基酯(24.5g,111mmol)加入溴化铜(6.2g,28mmol)和亚硝酸叔丁基酯(20mL,168mmol)在ACN(100mL)中的冷混合物中。历经18小时将绿色混合物温热至环境温度。然后将反应混合物用ACN稀释，经硅藻土垫过滤，用DCM冲洗。滤液浓缩，用DCM稀释，再次经硅藻土过滤，用DCM冲洗。滤液用水、饱和氯化铵溶液(2X)、饱和氯化钠水溶液(2X)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。残余物经硅胶快速柱色谱法、用0-50％(10％EtOAc，在DCM中)/己烷洗脱纯化，得到标题化合物(23.5g,70％)。1H NMR(CDCl3)d 7.68(1H,m),3.99(3H,s)。
表2：以基本上类似于制备例32的方式合成的化合物
制备例34
4-溴-3-氯-2,5-二氟-苯甲酸
向4-溴-3-氯-2,5-二氟-苯甲酸甲基酯(10.8g,37.8mmol)在THF(100mL)中的溶液中加入MeOH(50mL)。将均匀溶液在冰浴中冷却，滴加2N NaOH(60mL,120mmol)。添加后，将混合物于环境温度搅拌30分钟。真空除去有机溶剂。将水相用冰冷却，用5N HCl(24mL)调节pH至～2.0。水相用EtOAc(3X)萃取。合并的有机萃取物用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。所得残余物在真空烘箱中于60℃干燥过夜，得到标题化合物(10.3g,99％)。1H NMR(DMSO-d6)d 7.81(dd,J＝6.0,8.6Hz,1H)。
表3：以基本上类似于制备例34的方式合成的化合物
制备例36
4-溴-3-氯-5-氟-2-羟基-苯甲酸甲基酯
向4-溴-5-氟-2-羟基-苯甲酸甲基酯(9g,34.3mmol)在乙酸(70mL)中的溶液中加入NCS(14g,104.8mmol)，混合物加热至55℃。18小时后，加入另外的NCS(5.5g,37.7mmol)，混合物于55℃搅拌24小时。然后将反应物冷却至环境温度，真空除去过量乙酸。残余物经硅胶快速柱色谱法、用100％DCM洗脱纯化，得到标题化合物，为固体(7.1g,73％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)281/283[M-H]-。
制备例37
(3aR)-1,1-二氧代-3a,4,6,7-四氢-3H-氧杂噻唑并[3,4-a]吡嗪-5-甲酸叔丁基酯
于0℃向咪唑(24.9g,362mmol)在DCM(181mL)中的混悬液中滴加亚硫酰氯(8.0mL,110mmol)。混合物于0℃搅拌5分钟，于环境温度搅拌1小时。混合物冷却至-78℃，历经45分钟滴加(3R)-3-(羟基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(8.00g,36.2mmol)在DCM(181mL)中的溶液。混合物温热至环境温度，搅拌2.5天。反应物用饱和氯化铵水溶液萃取，用水和DCM稀释。分离各层，水层再次用DCM萃取。合并的有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到琥珀色浆液。于0℃向浆液在乙腈(282mL)中的溶液中加入高碘酸钠(10.2g,47.6mmol)在水(92mL)中的溶液。加入氯化钌(III)(76mg,0.37mmol)。所得混悬液于0℃搅拌5分钟，于环境温度搅拌5小时。反应物用饱和氯化铵水溶液萃取，用水和EtOAc稀释。分离各层，水层再次用EtOAc萃取。合并的有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，经滤纸过滤，然后经二氧化硅凝胶短柱过滤。滤液真空浓缩。向残余物中加入DCM，混合物真空浓缩，在真空中放置过夜，得到标题化合物，为褐色固体(9.39g,93％)。1H NMR(CDCl3)d4.63(1H,dd),4.23(1H,t),4.23(1H,br s),4.07(1H,br s),3.64(1H,m),3.45(1H,d),3.13(1H,m),2.96(2H,td),1.47(9H,s)。
表4：以基本上类似于制备例37的方式合成的化合物
制备例39
5-溴-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮
向(3-溴-2-甲基苯基)甲醇(15.0g,73.1mmol)在TFA(75mL)中的混悬液中加入三氟乙酸铊(III)(41.8g 73.1mmol)。使用另外的TFA(25mL)将三氟乙酸铊(III)冲洗入反应容器中。混合物在氮气下于环境温度搅拌过夜，真空浓缩并真空干燥，得到浅褐色固体。将固体放置在氮气下，与氧化镁(6.01g,149mmol)、氯化锂(6.32g,149mmol)和MeOH(300mL)合并。加入氯化钯(II)(1.32g,7.38mmol)。将混合物用一氧化碳净化五次，放置在一氧化碳气氛下(气囊压力)。混合物于环境温度搅拌2小时，加入氯化钯(II)(262mg,1.46mmol)和氧化镁(1.18g,29.2mmol)。混合物用一氧化碳净化三次，放置在一氧化碳气氛下(气囊压力)。混合物于环境温度搅拌30分钟，加入氯化钯(II)(262mg,1.46mmol)和氧化镁(1.18g,29.2mmol)。混合物用一氧化碳净化四次，放置在一氧化碳气氛下(气囊压力)。混合物于环境温度搅拌1.5小时，加入氯化钯(II)(327mg,1.83mmol)和氧化镁(1.77g,43.9mmol)。混合物用一氧化碳净化，放置在一氧化碳气氛下(气囊压力)。混合物于环境温度搅拌1.5小时，经硅藻土过滤，用EtOAc穿过硅藻土洗涤。滤液真空浓缩，得到残余物。粗产物经硅胶快速色谱法、用0-30％EtOAc/己烷洗脱纯化。将含产物的级分真空浓缩，得到标题化合物，为白色固体(14.48g,70％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)227.0/229.0[M+H]+。
制备例40
5-溴-4-甲基-6-硝基-3H-异苯并呋喃-1-酮
将5-溴-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮(14.4g,50.7mmol,80％纯度)在浓硫酸(160mL)中的溶液冷却至-5℃，加入硝酸钾(9.62g,95.2mmol)。将混合物在氮气下搅2.5小时，在搅拌下加入冰(750g)。混合物用EtOAc萃取三次。合并的有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。粗物质经硅胶快速色谱法、用10-70％EtOAc/己烷洗脱纯化。将含产物的级分真空浓缩，得到标题化合物，为灰白色至黄/橙色固体(11.98g,87％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)289.0/291.0[M+H]+。
制备例41
6-氨基-5-溴-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮
向压力烧瓶中加入5-溴-4-甲基-6-硝基-3H-异苯并呋喃-1-酮(11.98g,44.04mmol)、DCM(1000mL)、TFA(300mL,4mol)和铂(5％在炭上,硫化,3.00g,0.769mmol)。将混合物充入氢气，加压至45PSI达1.25小时。反应混合物经硅藻土过滤，用DCM洗涤。滤液真空浓缩，得到残余物。将残余物真空干燥，通过硅胶快速色谱法、用10-60％EtOAc/DCM洗脱纯化。将含产物的级分真空浓缩，得到标题化合物，为桃色固体(9.86g,96％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)242.0/244.0[M+H]+。
制备例42
5-氨基-4,6-二氯-3H-异苯并呋喃-1-酮
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于环境温度向5-氨基-3H-异苯并呋喃-1-酮(10.44g,68.60mmol)在DMF(100mL)中的溶液中加入NCS(20.56g,150.9mmol)。混合物于50℃搅拌2.5小时，于环境温度搅拌过夜。将混合物倒入水(1L)中，用玻璃滤器过滤出沉淀物，用水洗涤两次，然后用二乙醚洗涤，经玻璃漏斗抽空气进行干燥。沉淀物加入EtOAc中，经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到标题化合物，为浅黄-橙色固体(14.27g,93％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)218.2/220.0[M+H]+。
制备例43
4,6-二氯-5-碘-3H-异苯并呋喃-1-酮
于-15℃向5-氨基-4,6-二氯-3H-异苯并呋喃-1-酮(8.00g,35.6mmol)在乙腈(237mL)中的混悬液中滴加浓硫酸(6.5mL,120mmol)。缓慢加入硝酸钠(4.96g,71.2mmol)在水(36mL)中的溶液。混合物于0℃搅拌30分钟。滴加碘化钾(23.6g,142mmol)在水(36mL)中的溶液。混合物于0℃搅拌15分钟，于环境温度搅拌30分钟。混合物用饱和亚硫酸钠水溶液稀释，在真空下部分浓缩以除去大部分。混合物用EtOAc稀释，分离各层。有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。粗物质经硅胶快速色谱法、用0-25％EtOAc/己烷洗脱纯化。将含不纯产物的级分真空浓缩，进一步通过硅胶快速色谱法、用100％DCM洗脱纯化。将由两次色谱纯化获得的含纯产物的级分合并，真空浓缩，在真空中放置过夜，得到标题化合物，为浅黄色固体(6.62g,51％)。1H NMR(CDCl3)d 7.89(1H,s),5.25(2H,s)。
制备例44
5-溴-6-氯-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮
在冷水浴中向氯化铜(5.85g,43.5mmol)在乙腈(150mL)中的混悬液中历经5分钟加入亚硝酸叔丁基酯(12.9mL,108mmol)。混合物搅拌10分钟，移除冷水浴。混合物在氮气下搅拌另外25分钟。滴加6-氨基-5-溴-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮(8.73g,36.1mmol)在乙腈(550mL)中的溶液，混合物在氮气下搅拌1.5小时。将混合物部分真空浓缩以减小体积至约275mL。混合物用饱和氯化钠水溶液(300mL)和1M HCl(500mL)稀释，用EtOAc萃取两次。合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次，用饱和氯化钠水溶液洗涤两次，经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。粗物质经硅胶快速色谱法、用5-30％EtOAc/DCM洗脱纯化。将含产物的级分真空浓缩，得到标题化合物，为浅黄色固体(9.03g,96％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)278.0/280.0[M+H]+。
制备例45
4-溴-5-氯-2-(羟基甲基)-3-甲基-苯甲酸钠
向具有搅拌棒的螺旋盖小瓶中加入5-溴-6-氯-4-甲基-3H-异苯并呋喃-1-酮(2.459g,8.557mmol)和1M NaOH(9.4mL,9.4mmol)。将小瓶盖上盖子，于100℃加热2小时。反应混合物冷却至环境温度，转移至1L烧瓶中。加入甲苯(100mL)，混合物真空浓缩，在真空中放置3天，得到标题化合物，为褐色固体(2.81g,99+％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)276.8/278.8[M-H]-。
表5：以基本上类似于制备例45的方式合成的化合物
制备例47
(3S)-4-[苄基-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)氨基]-3-(叔丁氧羰基氨基)-4-氧代-丁酸苄基酯
将Boc-L-天门冬氨酸4-苄基酯(114g,352.6mmol)加入反应容器中。加入DCM(950mL)和N,N’-二环己基碳二亚胺(74.5g,361mmol)，混合物冷却至10-20℃。滴加苄基甘氨酸乙基酯(68.2g,353mmol)，同时保持温度低于20℃。混合物于10-20℃搅拌17小时，然后过滤，真空浓缩。加入MTBE(230mL)，混合物搅拌0.5小时。混合物过滤，真空浓缩，得到标题化合物，为油状物(174.4g,99％)。
制备例48
2-[(2S)-4-苄基-3,6-二氧代-哌嗪-2-基]乙酸苄基酯
将(3S)-4-[苄基-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)氨基]-3-(叔丁氧羰基氨基)-4-氧代-丁酸苄基酯(174.4g,349.8mmol)与DCM(500mL)和TFA(230mL)一起加入反应容器中。混合物于15-20℃搅拌16小时，然后真空浓缩至干。残余物溶于异丙醇(500mL)中，加热至80℃达1小时。混合物真空浓缩，然后用水(230mL)稀释。混合物用15％NaOH水溶液中和至pH 8-9(使用109g的15％NaOH水溶液)。混合物过滤，用水(2×100mL)冲洗。固体于50-55℃真空干燥2天，得到标题化合物，为固体(95.9g,78％)。1H NMR(CDCl3)δ7.44–7.29(m,8H),7.32–7.23(m,2H),6.91(br s,1H),5.18(d,J＝12.1Hz,1H),5.14(d,J＝12.2Hz,1H),4.64(d,J＝14.5Hz,1H),4.54(d,J＝14.5Hz,1H),4.44(br d,J＝7.9Hz,1H),3.88(d,J＝17.7Hz,1H),3.82(d,J＝17.7Hz,1H),3.15(dd,J＝17.5,3.4Hz,1H),2.93(dd,J＝17.5,8.3Hz,1H)。
制备例49
2-[(2S)-4-苄基哌嗪-2-基]乙醇
将氢化铝锂(13g,342.5mmol)与THF(200mL)一起加入反应容器中。混合物冷却至-5-0℃。将2-[(2S)-4-苄基-3,6-二氧代-哌嗪-2-基]乙酸苄基酯(50g,141.9mmol)与THF(400mL)一起加入第二个容器中。向氢化铝锂溶液中加入2-[(2S)-4-苄基-3,6-二氧代-哌嗪-2-基]乙酸苄基酯溶液，同时保持温度在-5和0℃之间。反应混合物加热至60-65℃，搅拌2小时。混合物冷却至20-30℃，搅拌16小时。加入水(13g)，然后加入4％NaOH水溶液(52g)。混合物搅拌1小时，过滤，真空浓缩。加入乙酸异丙基酯(200mL)和2M HCl(150g)。分离各层，水层再次用乙酸异丙基酯(100mL)洗涤。水层用NaOH调节至pH 11-12，加入DCM(150mL)。分离各层，有机层用水(100mL)洗涤。分离各层，有机层真空浓缩，得到标题化合物，为固体(20.1g,64％)。
1H NMR(CDCl3)δ7.44–7.20(m,5H),3.81(t,J＝5.2Hz,2H),3.50(s,2H),3.08–
2.93(m,2H),2.93–2.82(m,1H),2.76(d,J＝11.5Hz,2H),2.02(td,J＝11.1,3.3Hz,1H),1.85(t,J＝10.4Hz,1H),1.67–1.52(m,2H)。
制备例50
2-[(2S)-哌嗪-2-基]乙醇
将2-[(2S)-4-苄基哌嗪-2-基]乙醇(20g,91mmol)加入充入H2的反应容器中。加入MeOH(200mL)，加入Pd(OH)2(2g)。将混合物充入H2，然后加压至45psi H2。混合物加热至50℃，搅拌44小时。反应混合物过滤，真空浓缩，得到标题化合物，为油状物(12.7g,99+％)。1HNMR(CDCl3)δ3.84–3.65(m,2H),3.44(s,1H),2.99–2.83(m,4H),2.78(td,J＝11.6,2.5Hz,1H),2.68(td,J＝11.4,2.8Hz,1H),2.54–2.42(m,1H),1.65–1.43(m,2H)。
制备例51
(3S)-3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯；磷酸
将2-[(2S)-哌嗪-2-基]乙醇(9.2g,70.4mmol)和MeOH(83mL)和水(9mL)一起加入反应容器中。混合物于15℃搅拌0.5小时。向第二个容器中加入二碳酸二叔丁基酯(15.4g,70.6mmol)以及MeOH(92mL)。历经0.5小时将二碳酸二叔丁基酯溶液加入2-[(2S)-哌嗪-2-基]乙醇溶液中，同时保持温度低于15℃。混合物于15℃搅拌2小时。在单独的容器中将磷酸(85％强度,8.11g,70.4mmol)和EtOH合并，历经30分钟将磷酸溶液加入反应混合物中。混合物于15℃搅拌20分钟，然后历经3小时冷却至-5℃。混合物于-5℃搅拌1小时，过滤，用EtOH洗涤，然后于50℃干燥4小时，得到标题化合物，为固体(5.82g,25％)。1H NMR(D2O)δ4.11–4.03(m,1H),4.00(br s,1H),3.75–3.62(m,2H),3.43–3.30(m,2H),3.30–3.18(m,1H),3.17–2.95(m,2H),1.86–1.78(m,2H),1.38(s,9H)。
制备例52
(3S)-3-(苄基氨基)四氢呋喃-2-酮
将L-高丝氨酸内酯盐酸盐(100g,726.93mmol,粉末状分子筛(178g)和苯甲醛(57mL,561.3mmol)在DCM(2500mL)中的混悬液在氮气下于35℃搅拌过夜。此后，除去热，混合物冷却至20℃。将三乙酰氧基硼氢化钠(208g,981.41mmol)加入混合物中，然后20分钟后使之温热至环境温度，搅拌2小时。此后，混合物冷却至-10℃，用饱和碳酸氢钠水溶液(400mL)小心萃取。用饱和碳酸氢钠水溶液和固体碳酸氢钠调节pH至8。混合物经硅藻土垫过滤，用DCM冲洗。分离各层，水层用DCM(1L)萃取另外一次。合并的有机物经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到标题化合物，为澄清油状物(87g,66.5％,81质量％)。ES/MS m/z：192.2(M+H)。对于分析工作，将标题化合物样品(1g)经硅胶快速色谱法、用10-50％EtOAc/DCM洗脱纯化，得到422mg纯化的标题化合物。采用/>IC,4.6x150mm,10％IPA(0.2％IPAm)/CO2,5mL/min,225nm分析该物质，显示出>98％e.e。
制备例53
N-[2-[苄基-[(3S)-2-氧代四氢呋喃-3-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酸叔丁基酯
将(3S)-3-(苄基氨基)四氢呋喃-2-酮(86g,364.27mmol,81质量％)、boc-Gly-OH(97g,553.71mmol)和TEA(103mL,739mmol)在DCM(700mL)中的混合物冷却至～5℃。历经1小时将丙基膦酸酐(50质量％,在EtOAc中)(430mL,737mmol)滴加至混合物中，同时保持内温～10℃。在加入时，使混合物温热至环境温度。7小时后，将混合物冷却至10℃，加入另外的boc-Gly-OH(3.1g,18mmol)、TEA(5mL,35.9mmol)和丙基膦酸酐(50质量％,在EtOAc中)(22mL,37.7mmol)。混合物温热至环境温度，搅拌过夜。此后，混合物冷却至8℃，加入另外的boc-Gly-OH(9.6g,55mmol)、TEA(10mL,71.7mmol)和丙基膦酸酐(50质量％,在EtOAc中)(42mL,71.9mmol)。混合物温热至环境温度，搅拌～7小时。此后，混合物倒在冰上，用饱和碳酸氢钠水溶液(1L)小心萃取。用固体碳酸氢钠调节pH至8，分离各层。水层用DCM再萃取两次。合并的有机物用饱和氯化钠水溶液(500mL)洗涤。有机层经硅藻土垫和硫酸钠过滤。有机物真空浓缩至1L体积，用饱和氯化钠水溶液洗涤两次。有机物经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩，得到标题化合物，未经进一步纯化进行使用(194g,53.5％,35质量％)。ES/MS m/z:249.0(M-t-Bu+H)
表6：以基本上类似于制备例53的方式合成的化合物
制备例56
(6S)-1-苄基-6-(2-羟基乙基)哌嗪-2,5-二酮
将TFA(100mL,1310mmol)加入N-[2-[苄基-[(3S)-2-氧代四氢呋喃-3-基]氨基]-2-氧代-乙基]氨甲酸叔丁基酯(194g,194.9mmol,35质量％)在DCM(500mL)中的混合物中。混合物于环境温度搅拌过夜。此后，加入另外的TFA(50mL,653mmol)，混合物于环境温度搅拌。2小时后，加入另外的TFA(50mL,653mmol)，混合物于环境温度搅拌过夜。此后，混合物真空浓缩。所得残余物用水(600mL)稀释，用二乙醚洗涤两次。用1N NaOH水溶液调节pH至7，再用5N NaOH水溶液调节至pH 12。加入MeOH(～10mL)，混合物于环境温度搅拌。以5分钟间隔将另外的5N NaOH水溶液加入混合物中以调节pH至12。总之，将混合物于pH 12搅拌35分钟。此后，用10％HCl水溶液调节pH至8，用DCM(5×1L)萃取。然后用10％HCl水溶液将水层pH调节至5，再次用DCM(1L)萃取。合并的有机物经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到标题化合物，为浅褐色固体(17g,33.4％)。水层用供选的25％IPA/氯仿和DCM进行另外的萃取，直至根据LC/MS从水层中除去标题产物。向合并的有机物中加入IPA(150mL)。有机物用饱和氯化钠水溶液洗涤两次，经硫酸钠和硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩，得到另外的标题化合物(17.2g,35.5％)，综合产率为34.2g(68.9％)。ES/MS m/z:249.0(M+H)
表7：以基本上类似于制备例56的方式合成的化合物
制备例59
2-[(2S)-1-苄基哌嗪-2-基]乙醇
向氢化铝锂在THF中的45℃2M溶液(131mL,262mmol)中滴加(6S)-1-苄基-6-(2-羟基乙基)哌嗪-2,5-二酮(34g,131.5mmol)在THF(200mL)中的溶液。添加后，混合物加热至60℃。～3.5小时后，加入另外的氢化铝锂在THF中的2M溶液(33mL,66mmol)，混合物于60℃搅拌。1小时后，加入另外的氢化铝锂在THF中的2M溶液(131mL,262mmol)，混合物于60℃搅拌过夜。此后，加入氢化铝锂在THF中的2M溶液(6mL,12mmol)，混合物于60℃搅拌。4小时后，氢化铝锂在THF中的2M溶液(6mL,12mmol)，混合物于60℃搅拌2小时。除去热，混合物冷却至10℃。滴加水(16mL)，然后滴加3.75M NaOH水溶液(16mL)，然后是THF(300mL)。加入水(48mL)，所得混合物于环境温度搅拌过夜。此后，混合物经硅藻土垫过滤，用EtOAc冲洗。滤液真空浓缩，得到标题化合物(28.8g,67.6％,68质量％)。ES/MS m/z:221.0(M+H)
表8：以基本上类似于制备例59的方式合成的化合物
制备例62
(3S)-4-苄基-3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯
于环境温度将碳酸氢钠(80g,952mmol)在水(500mL)中的溶液加入在1,4-二噁烷(500mL)中的2-[(2S)-1-苄基哌嗪-2-基]乙醇(28g,86.43mmol)中。加入二碳酸二叔丁基酯(26.6g,122mmol)，混合物于环境温度搅拌20分钟。此后，加入(400mL)、水(200mL)和EtOAc(1L)，分离各层。水层用EtOAc(1L)萃取一次。合并的有机物用水(250mL)和饱和氯化钠水溶液(250mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。所得油状物经硅胶快速色谱法、用10-70％EtOAc/己烷洗脱纯化，得到标题化合物(20.79g,74％)。ES/MS m/z:321.2(M+H)该物质采用IC,4.6x150mm,15％IPA(0.2％IPAm)/CO2,5mL/min,225nm进行分析，显示出96％e.e。
表9：以基本上类似于制备例62的方式合成的化合物
制备例65
(3S)-3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯
将在炭上的20％Pd(OH)2(24.39g,176.4mmol)加入充入氮气的容器中。向容器中加入EtOH(620mL)，然后加入(3S)-4-苄基-3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(61.93g,193.3mmol)和EtOH(620mL)。将容器密封，充入氮气，用氢气净化，在氢气下加压(60psi)。将容器于环境温度放置在Parr振摇器上15小时。此后，将反应混合物过滤，真空浓缩，得到标题化合物(42.74g,98％)。ES/MS m/z 231.0:(M+H)。
表10：以基本上类似于制备例65的方式合成的化合物
制备例68
(3S)-4-(3,5-二氯-2-氟-4-碘-苯甲酰基)-3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯
将3,5-二氯-2-氟-4-碘-苯甲酸(0.80g,2.4mmol)加入在THF(22mL)中的DIEA(2mL,11.5mmol)中，然后加入HATU(0.84g,2.2mmol)，搅拌1小时。然后加入(3S)-3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(0.50g,2.2mmol)，反应混合物回流过夜。此后，加入5N NaOH，反应物搅拌1小时。加入EtOAc和水。水层用EtOAc萃取两次。合并的有机萃取物经无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。粗混合物经硅胶快速色谱法、用EtOAc:己烷(30:70)洗脱纯化，得到标题化合物(0.858g,72％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)491/493[M-t-Bu+H]+。
表11：以基本上类似于制备例68的方式合成的化合物
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制备例85
(3S)-4-(4-溴-3-氯-2,5-二氟-苯甲酰基)-3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯
将4-溴-3-氯-2,5-二氟-苯甲酸(10.2g,37.6mmol)和4-甲基吗啉(7.50mL,68.0mmol)在THF(200mL)中的溶液在冰浴中冷却至0℃，用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(9.10g,50.8mmol)处理。混合物在冰浴中搅拌30分钟，然后经过分液漏斗滴加(3S)-3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(0.93M,在THF中,40.0mL,37.2mmol)。于0℃达1小时后，加入5N NaOH(35.0mL,180mmol)，混合物于环境温度搅拌30分钟。混合物用EtOAc稀释，用饱和碳酸氢钠溶液处理，搅拌15分钟。分离有机相，用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。残余物经硅胶快速柱色谱法、用0-90％(20％丙酮，在DCM中)/己烷洗脱纯化，得到标题化合物(16.0g,88％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)427/429[M-t-Bu+H]+。
表12：以基本上类似于制备例85的方式合成的化合物
制备例87
(3S)-4-(2-氨基-4-溴-5-氯-苯甲酰基)-3-[2-(对甲苯基磺酰氧基)乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯
向(3S)-4-(2-氨基-4-溴-5-氯-苯甲酰基)-3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(1g,2.16mmol)和TEA(1mL,7.14mmol)在DCM(25mL)中的0℃溶液中加入DMAP(45mg,0.36mmol)和对甲苯磺酰氯(469mg,2.39mmol)。反应混合物于0℃搅拌15分钟，然后温热至环境温度。3小时后加入另外的对甲苯磺酰氯(122mg,0.62mmol)。1小时后，反应物用DCM稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。有机物用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，真空浓缩。所得残余物经硅胶快速色谱法纯化，得到标题化合物(473mg,35％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)616.0/618.0[M+H]+。
制备例88
4-溴-2-[[(2R)-4-叔丁氧羰基哌嗪-2-基]甲氧基甲基]-5-氯-3-甲基-苯甲酸盐酸盐
向在250mL烧瓶中的4-溴-5-氯-2-(羟基甲基)-3-甲基-苯甲酸钠(2.05g,6.39mmol)中加入甲苯(50mL)，混合物真空浓缩。残余物溶于DMF(21mL)和THF(11mL)中，冷却至0℃。加入氢化钠(60质量％,在石蜡油中)(511mg,12.8mmol)。添加后，混合物于0℃搅拌10分钟。向在第二个烧瓶中的(3aR)-1,1-二氧代-3a,4,6,7-四氢-3H-氧杂噻唑并[3,4-a]吡嗪-5-甲酸叔丁基酯(1.96g,7.04mmol)中加入甲苯(20mL)，混合物真空浓缩。残余物溶于THF(11mL)中，于0℃滴加至第一个烧瓶的内容物中。混合物温热至环境温度，搅拌1.5小时。缓慢加入5M HCl(7mL)，混合物于环境温度搅拌5分钟，然后用饱和碳酸氢钠水溶液萃取。通过缓慢添加5M HCl使pH降低至pH 2，混合物用EtOAc稀释。分离各层，水层用EtOAc萃取三次。合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。残余物溶于THF(40mL)中，加入5MHCl(6mL)。混合物于环境温度搅拌20分钟。混合物用饱和氯化钠水溶液和EtOAc稀释，分离各层。有机层经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，在真空中放置2小时，得到标题化合物，为褐色固体(4.27g,73％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)477.2/479.2[M+H]+。
表13：以基本上类似于制备例88的方式合成的化合物
制备例91
(3S)-4-苄基-3-[2-(3-溴-2-氯-4-氟-6-甲氧基羰基-苯氧基)乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯
将4-溴-3-氯-5-氟-2-羟基-苯甲酸甲基酯(3.0g,11.0mmol)、三苯膦(4.19g,16.0mmol)和(3S)-4-苄基-3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(12mL,1.039M,在THF中)在THF(～50mL)中的溶液冷却至0℃达10分钟。滴加偶氮二甲酸二异丙基酯(3.1mL,16mmol)，混合物温热至环境温度。当醇起始物质被消耗后，加入冰，反应物用EtOAc稀释。混合物用饱和氯化钠水溶液洗涤两次，有机层经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩至琥珀色油状物。残余物经硅胶柱色谱法、用0-10％EtOAc/己烷洗脱纯化，得到标题化合物(6.2g,99+％)。通过硅胶柱色谱法、用25-50％(1:1EtOAc:DCM)/己烷洗脱获得分析样品～95％纯度，得到标题化合物，为无色油状物。ES/MS m/z(79Br/81Br)585/587[M+H]+。
制备例92
(3S)-3-[2-(3-溴-2-氯-4-氟-6-甲氧基羰基-苯氧基)乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯
向(3S)-4-苄基-3-[2-(3-溴-2-氯-4-氟-6-甲氧基羰基-苯氧基)乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(7.0g,11.35mmol)在DCM(75mL)中的溶液中加入N,N-二异丙基胺(5.94mL,34.1mmol)。将溶液在冰浴中冷却，滴加氯甲酸1-氯乙基酯(3.7mL,34mmol)。添加后，移除冰浴，反应物于环境温度搅拌18小时。于环境温度滴加另外的氯甲酸1-氯乙基酯(2mL,17mmol)和N,N-二异丙基胺(3mL,17mmol)，7小时后加入更多的氯甲酸1-氯乙基酯(0.60mL,5.67mmol)和N,N-二异丙基胺(1mL,5.67mmol)以消耗剩余的起始物质。反应混合物真空浓缩。向残余物中加入甲苯，混合物浓缩(重复2X)。所得半固体用MeOH(100mL)稀释，于环境温度搅拌直至产物形成完全。真空除去溶剂，得到琥珀色残余物。残余物经硅胶柱色谱法、用0-10％MeOH/DCM洗脱纯化，得到标题化合物，为固体(5.11g,91％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)495/497[M+H]+。
制备例93
4-溴-2-[2-[(2S)-4-叔丁氧羰基哌嗪-2-基]乙氧基]-3-氯-5-氟-苯甲酸
将(3S)-3-[2-(3-溴-2-氯-4-氟-6-甲氧基羰基-苯氧基)乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(5g,10.08mmol)在THF(100mL)和MeOH(12mL)中的溶液用冰浴冷却。加入氢氧化锂水溶液(6.5mL,6.25M)和去离子水(10mL)。移去冰浴，混合物于环境温度搅拌。3小时后，向反应混合物中加入冰，用10％柠檬酸(12mL)调节pH至5-6。加入饱和氯化钠水溶液(100mL)，混合物用EtOAc(400mL)稀释，分离各层。水层再次用EtOAc(300mL)萃取，合并的有机物经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到标题化合物，为固体(4.83g,98％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)481/483[M+H]+。
制备例94
(13aS)-8,10-二氯-9-碘-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-2-甲酸叔丁基酯
(苯并噁唑辛＝benzoxazocine)
将在DMF(100mL)中的(3S)-4-(3,5-二氯-2-氟-4-碘-苯甲酰基)-3-(2-羟基乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(4.438g,8.110mmol)冷却至0℃，然后向溶液中加入固体氢化钠(60质量％,在石蜡油中)(0.81g,20mmol)。于0℃达1小时后，将反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液淬灭。加入水和EtOAc。水层用EtOAc萃取两次。合并的有机萃取物用0.2M氯化锂水溶液洗涤两次，经无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。粗混合物经硅胶快速色谱法、用30-50％EtOAc/己烷洗脱纯化，得到标题化合物(3.394g,79％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)471/473[M-t-Bu+H]+。
表14：以基本上类似于制备例94的方式合成的化合物
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制备例113
(13aS)-9-溴-8-氯-11-甲基-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并二氮芳辛-2-甲酸叔丁基酯和(13aS)-9-溴-8-氯-6-氧代-3,4,11,12,13,13a-六氢-1H-吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并二氮芳辛-2-甲酸叔丁基酯
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将在DMF(15mL)中的(3S)-4-(2-氨基-4-溴-5-氯-苯甲酰基)-3-[2-(对甲苯基磺酰氧基)乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(473mg,0.767mmol)冷却至0℃，然后向溶液中加入固体氢化钠(60质量％,在石蜡油中)(49mg,1.225mmol)。反应混合物于0℃搅拌2小时，然后温热至环境温度，搅拌另外2小时。此后，反应混合物冷却至-78℃，加入甲基碘(50μL,0.803mmol)。30分钟后，将反应混合物温热至0℃，搅拌18小时，温热至环境温度。混合物冷却回0℃，加入另外的甲基碘(50μL,0.803mmol)。1小时后，没有观察到另外的甲基化，将反应混合物温热至环境温度，加入三乙胺(100μL,0.717mmol)。另外1小时后，反应混合物用水淬灭，用饱和NH4Cl水溶液和EtOAc稀释。分离各层，水层再用EtOAc萃取两次。合并的有机物用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，真空浓缩。所得固体用ACN研磨，真空干燥，未进行进一步纯化，得到标题化合物的混合物(3:2NH至NMe,345mg,99+％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)444.0/446.0[M+H]+和458.0/460.0[M+H]+。
制备例114
(13aR)-9-溴-8-氯-10-甲基-6-氧代-1,3,4,11,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][2,5]苯并噁唑辛-2-甲酸叔丁基酯
于0℃将4-溴-2-[[(2R)-4-叔丁氧羰基哌嗪-2-基]甲氧基甲基]-5-氯-3-甲基-苯甲酸盐酸盐(500mg,0.749mmol)和DIEA(0.39mL,2.2mmol)在DMF(3.7mL)中的溶液滴加至HATU(581mg,1.50mmol)在DMF(3.7mL)中的溶液中。混合物于0℃搅拌1小时，于环境温度搅拌30分钟。在单独的烧瓶中，于0℃将4-溴-2-[[(2R)-4-叔丁氧羰基哌嗪-2-基]甲氧基甲基]-5-氯-3-甲基-苯甲酸盐酸盐(2.62g,3.92mmol,77％纯度)和DIEA(2.1mL,12mmol)在DMF(20mL)中的溶液滴加至HATU(3.04g,7.84mmol)在DMF(20mL)中的溶液。混合物于0℃搅拌1小时，于环境温度搅拌30分钟。合并两个反应混合物，用EtOAc稀释，用0.5M HCl、水、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤。有机层经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。粗物质经硅胶快速色谱法、用0-65％EtOAc/己烷洗脱纯化。将纯级分真空浓缩。向残余物中加入DCM，混合物真空浓缩，在真空中放置3小时，得到标题化合物，为白色固体(1.95g,86％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)459/461[M+H]+。
表15：以基本上类似于制备例114的方式合成的化合物
制备例117
(13aS)-9-溴-10-氯-8-氟-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-2-甲酸叔丁基酯
向4-溴-2-[2-[(2S)-4-叔丁氧羰基哌嗪-2-基]乙氧基]-3-氯-5-氟-苯甲酸(4.8g,10mmol)在DCM(50mL)中的用冰浴冷却的溶液中加入TEA(2.8mL,20mmol)。滴加丙基膦酸酐(11mL,18.8mmol,50质量％,在EtOAc中)。在添加后，将混合物搅拌10分钟。加入DCM(250mL)和饱和氯化铵溶液(100mL)。移出水层，用DCM(100mL)萃取，合并的有机层用饱和氯化钠水溶液(100mL)洗涤，经硫酸钠干燥和过滤。滤液用活性炭(3.5g)处理，搅拌10分钟。混合物经硅藻土垫过滤，真空浓缩至油状物。加入氯仿，真空浓缩(重复2X)，得到标题化合物，为固体(4.64g,99％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)407/409[M-t-Bu+H]+。
制备例118
(3R,13aS)-9-溴-10-氯-8-氟-3-甲基-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-2-甲酸叔丁基酯
将4-溴-3-氯-2,5-二氟-苯甲酸甲基酯(1.00g,3.50mmol)和(2R,5S)-5-(2-羟基乙基)-2-甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(1.07g,4.38mmol)在DMF(17.5mL)中的溶液用冰浴冷却。加入碳酸铯(2.31g,7.01mmol)。反应物缓慢温热至环境温度过夜。18小时后，将反应物加热至80℃达24小时。冷却至室温后，加入半饱和氯化钠水溶液(50mL)，混合物用EtOAc(100mL)稀释，分离各层。水层再用EtOAc(50mL)萃取两次，合并的有机物用水(2×50mL)、饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，然后经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。粗物质经硅胶快速色谱法、用0-100％MTBE/己烷洗脱纯化，得到标题化合物，为固体(690mg,41％)。ES/MS m/z(79Br/81Br)476.0/478.0[M+H]+。
制备例119
(13aS)-8,10-二氯-9-碘-3,4,6,12,13,13a-六氢-1H-吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-2-甲酸叔丁基酯
将在THF中的1M硼烷二甲硫复合物(2mL,2mmol)加入(13aS)-8,10-二氯-9-碘-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-2-甲酸叔丁基酯(1.0g,1.9mmol)在THF(20mL)中的搅拌混合物中，加热至回流达18小时。此后，向混合物中加入另外的在THF中的1M硼烷二甲硫复合物(2mL,2mmol)，回流搅拌另外5小时。混合物冷却至环境温度，用MeOH小心淬灭，真空浓缩。残余物经硅胶快速柱色谱法、用30-70％EtOAc/己烷洗脱纯化，得到标题化合物(900mg,90％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)512.8/514.8[M+H]+-。
表16：以基本上类似于制备例119的方式合成的化合物
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制备例132
(13aS)-9-[2-(叔丁氧羰基氨基)-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基]-8,10-二氯-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-2-甲酸叔丁基酯
在具有搅拌棒的可用螺旋盖密封的试管中加入(13aS)-8,10-二氯-9-碘-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-2-甲酸叔丁基酯(750mg,1.423mmol)、[2-(叔丁氧羰基氨基)-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基]硼酸(650mg,2.083mmol)、三碱式磷酸钾(450mg,2.12mmol)和1,1’-双(二叔丁基膦基)二茂铁二氯化钯(100mg,0.15mmol)。加入之前混合并脱气的1,4-二噁烷(15mL)和水(5mL)，将混合物充入氮气20分钟。将试管盖上帽子，于80℃加热1小时。然后将反应混合物的内容物倒入水、饱和氯化钠水溶液和EtOAc中。分离各层，水层用EtOAc萃取一次。合并的有机萃取物经无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。粗物质经硅胶快速色谱法、用30-70％EtOAc/己烷洗脱纯化，得到标题化合物(724mg,76％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)667/669[M+H]+。45:55比例的阻转异构体(LC)。
表17：以基本上类似于制备例132的方式合成的化合物
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在一些情况中，使用K2CO3代替K3PO4。
制备例167
(13aS)-9-[2-(叔丁氧羰基氨基)-3-氰基-苯并噻吩-4-基]-10-氯-8-氟-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-2-甲酸叔丁基酯
向密闭烧瓶中加入甲苯(300mL)、(13aS)-9-溴-10-氯-8-氟-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-2-甲酸叔丁基酯(6.20g,11.0mmol)和N-[3-氰基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯并噻吩-2-基]氨甲酸叔丁基酯(6.20g,15.5mmol)。混合物用氮气喷30分钟，然后加入DPEPhosPdCl2(1.20g,1.68mmol)，然后加入碳酸铯(9.00g,27.6mmol)。将烧瓶密封，于105℃搅拌6小时。混合物冷却至环境温度，经硅藻土过滤，用EtOAc洗涤，滤液真空浓缩。残余物经硅胶快速柱色谱法、用0-30％丙酮/己烷洗脱纯化。预期的非对映异构体在不预期的非对映异构体之后洗脱出，得到标题化合物(主要,3.50g,49％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)657.0/659.0[M+H]+。
表18：以基本上类似于制备例167的方式合成的化合物
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制备例175
(13aS)-9-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-8,10-二氯-2,3,4,12,13,13a-六氢-1H-吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-6-酮
将(13aS)-9-[2-(叔丁氧羰基氨基)-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基]-8,10-二氯-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-2-甲酸叔丁基酯(724mg,1.084mmol)溶于DCM(4mL)和TFA(2mL,26.45mmol)中，于环境温度搅拌。6小时后，将混合物真空浓缩。将粗产物上样到SCX柱上，用MeOH洗涤，用NH3在MeOH中的7N溶液洗脱。滤液真空浓缩，得到标题化合物(500mg,98％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)467/469[M+H]+。
表19：以基本上类似于制备例175的方式合成的化合物
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制备例187
4-[(13aS)-10-氯-8-氟-6-氧代-2,3,4,12,13,13a-六氢-1H-吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-9-基]-2-氨基-苯并噻吩-3-甲腈
于0℃向(13aS)-9-[2-(叔丁氧羰基氨基)-3-氰基-苯并噻吩-4-基]-10-氯-8-氟-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-2-甲酸叔丁基酯(2.64g,4.02mmol)在DCM(10.0mL)中的混悬液滴加TFA(10mL)。混合物于环境温度搅拌1小时。将混合物真空浓缩，溶于EtOAc中，再次真空浓缩。重复该操作一次。所得残余物经硅胶快速柱色谱法首先用0-80％(MeOH在DCM中的10％溶液)/DCM、其次用0-100％[10％(NH3在MeOH中的7N溶液)在DCM中]/DCM洗脱纯化，得到标题化合物(1.58g,86％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)457.0/459.0[M+H]+。
表20：以基本上类似于制备例187的方式合成的化合物
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制备例219
4-[(13aS)-10-氯-2-(2-氰基乙酰基)-8-氟-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-9-基]-2-氨基-7-氟-苯并噻吩-3-甲腈
将氰基乙酸(138mg,1.61mmol)、1-羟基苯并三唑(222mg,1.61mmol)、DIEA(0.5mL,3mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(306mg,1.60mmol)加入4-[(13aS)-10-氯-8-氟-6-氧代-2,3,4,12,13,13a-六氢-1H-吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-9-基]-2-氨基-7-氟-苯并噻吩-3-甲腈(500mg,1.05mmol)在DCM(10mL)中的混悬液中。反应混合物于环境温度搅拌18小时，然后用DCM稀释，用饱和氯化铵水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤。有机物经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。残余物溶于DCM(5mL)和数滴MeOH中，然后加入己烷以沉淀出产物。将沉淀物过滤，得到标题化合物，为白色固体(410mg,72％)。ES/MSm/z(35Cl/37Cl)542.4/544.4[M+H]+。
制备例220
1-溴-1,2,2-三氘代-乙烯
于33℃将1,2-二溴乙烷-d4(25.0g,130.28mmol)滴加至氢氧化钾(15.19g,243.63mmol)在95％乙醇-OD(95mL)和D2O(5mL)中的溶液中。将混合物首先于60℃搅拌1.5小时，然后于63℃搅拌1.5小时，得到标题化合物，为无色油状物，将其在加热期间从反应物中连续蒸馏出，收集在用干冰-丙酮浴冷却的接受瓶中(7.3g,50％)。
制备例221
2,3,3-三氘代丙-2-烯酸–13C
将镁屑(1.67g,69.71mmol)、碘晶体和无水THF(20mL)放置在烧瓶中。同时制备了1-溴-1,2,2-三氘代-乙烯(7.3g,66.39mmol)在无水THF(30mL)中的溶液。将含有镁的混合物加热至50℃，加入一部分溴乙烯溶液(2mL)。混合物于50℃加热直至开始Grignard反应，混合物开始回流(65℃)。于55-65℃历经1.5小时滴加剩余的溴乙烯在THF中的溶液。所得混合物于65℃加热1.5小时以确保反应完全。将该新鲜制备的(1,2,2-三氘代乙烯基)溴化镁在THF中的溶液冷却至室温，立即使用。
于-65℃将二氧化碳-13C气体充入无水THF(50mL)达5分钟。滴加上述新鲜制备的(1,2,2-三氘代乙烯基)溴化镁在THF中的溶液(66.39mmol)，此时反应温度升至-20℃。混合物温热至-10℃，搅拌10分钟。将二氧化碳-13C气体充入混合物达另外2分钟。混合物温热至环境温度，搅拌10分钟。加入氢醌(10mg)，然后滴加6M硫酸(6.5mL)以淬灭反应，同时维持温度低于20℃。混合物用二乙基醚(400mL)稀释，加入硫酸钠(100g)。混合物于环境温度搅拌5分钟，过滤，于0-5℃真空浓缩，得到粗产物(7.5g)，为黄色油状物。粗产物经短途真空蒸馏纯化，得到标题化合物，为无色油状物(1.2g,24％)。
制备例222
2,3,3-三氘代丙-2-烯酰氯–13C
于0℃将草酰氯(0.24mL,2.85mmol)加入2,3,3-三氘代丙-2-烯酸–13C(0.181g,2.38mmol)和DMF(1滴)在无水DCM(10mL)中的溶液中，混合物于室温搅拌1小时。标题化合物作为溶液直接用于下一步骤。
制备例223
Kras探针
N-(2-{2-[2-({6-氯-8-氟-7-(3-羟基萘-1-基)-4-[4-(丙-2-烯酰基)哌嗪-1-基]喹唑啉-2-基}氨基)乙氧基]乙氧基}乙基)-5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰胺
步骤A：将4-(7-溴-2,6-二氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(0.51g,1.1mmol)和IPA(5mL)在微波小瓶中合并。加入DIPEA(0.55mL,3.3mmol)和5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]-N-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基]戊酰胺(0.48g,1.32mmol)，混合物在微波反应器中加热至120℃达6小时。此后，将混合物用饱和氯化铵水溶液和25％IPA在CHCl3中的溶液稀释，分离各层。有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。所得残余物经正相色谱法、用B在A中的50-100％梯度(A:己烷,B:MeOH在DCM中的10％溶液)洗脱纯化，得到4-{7-溴-6-氯-8-氟-2-[(2-{2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰基}氨基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基]喹唑啉-4-基}哌嗪-1-甲酸叔丁基酯，为黄色固体(0.68g,78％)。ES/MS m/z:819(M+H)。
步骤B：将4-{7-溴-6-氯-8-氟-2-[(2-{2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰基}氨基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基]喹唑啉-4-基}哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(0.30g,0.37mmol)、1,4-二噁烷(4mL)和水(0.75mL)合并。加入碳酸钾(0.24g,1.11mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)萘-2-醇(0.20g,0.74mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(0.085g,0.074mmol)，混合物在氮气下于85℃搅拌12小时。此后，混合物冷却至环境温度，过滤除去固体。滤液用饱和氯化铵水溶液和EtOAc稀释，分离各层。有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。所得残余物经正相色谱法、用B在A中的90-100％梯度(A:己烷,B:MeOH在DCM中的10％溶液)洗脱纯化，得到4-{6-氯-8-氟-7-(3-羟基萘-1-基)-2-[(2-{2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰基}氨基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基]喹唑啉-4-基}哌嗪-1-甲酸叔丁基酯，为黄色固体(0.31g,96％)。ES/MS m/z:881(M+H)。
步骤C：将4-{6-氯-8-氟-7-(3-羟基萘-1-基)-2-[(2-{2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰基}氨基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基]喹唑啉-4-基}哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(0.31g,0.35mmol)在MeOH(4mL)中的溶液冷却至0℃。加入HCl(3M在MeOH中,6mL,17.5mmol)，混合物于0℃搅拌30分钟，然后温热至环境温度。～18小时后，将反应混合物真空浓缩。残余物用DCM稀释，再次真空浓缩。所得残余物用己烷稀释，于环境温度搅拌2小时。所得固体过滤，在真空下干燥，得到N-{2-[2-(2-{[6-氯-8-氟-7-(3-羟基萘-1-基)-4-(哌嗪-1-基)喹唑啉-2-基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}-5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰胺盐酸盐。将盐酸盐(0.19g,0.23mmol)通过与在DCM中(2.5mL)的DIEA(0.16mL,0.92mmol)合并进行中和。混合物冷却至-78℃，加入丙烯酰氯(0.5M，在DCM中,0.4mL,0.21mmol)。30分钟后，将混合物温热至环境温度。1小时候，混合物用MeOH(1mL)稀释，真空浓缩。所得残余物经反相色谱法、用B在A中的35-60％梯度(A:10mM NH4HCO3水溶液，含5％MeOH；B:ACN)洗脱纯化，得到标题化合物，为白色固体(0.027g,14％)。ES/MS m/z:835(M+H)。
实施例1
(13aS)-9-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-8,10-二氯-2-丙-2-烯酰基-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-6-酮
将(13aS)-9-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-8,10-二氯-2,3,4,12,13,13a-六氢-1H-吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-6-酮(500mg,1.070mmol)溶于DCM(5mL)和TEA(0.75mL,5.4mmol)中。混合物冷却至-78℃，然后加入丙烯酰氯(0.085mL,1.0mmol)，将混合物于-78℃搅拌。5分钟后，于-78℃加入数滴异丙醇，然后将混合物真空浓缩，进行反相色谱法，得到两种阻转异构体的混合物。采用IC,4.6x150mm,40％EtOH/CO2,5mL/min,225nm分离阻转异构体混合物。第二个脱离柱子的化合物被鉴定为具有活性的阻转异构体(165mg,55％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)521/523[M+H]+(>98％e.e.)。具有较低活性的阻转异构体第一个脱离柱子(133mg,44％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)521/523[M+H]+(>98％e.e.)。
表21：以基本上类似于实施例1的方式合成的化合物
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在一些情况中，使用DIEA代替TEA。
实施例34
4-[(13aS)-10-氯-8-氟-6-氧代-2-丙-2-烯酰基-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-9-基]-2-氨基-苯并噻吩-3-甲腈
向4-[(13aS)-10-氯-8-氟-6-氧代-2,3,4,12,13,13a-六氢-1H-吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-9-基]-2-氨基-苯并噻吩-3-甲腈(1.58g,3.46mmol)在EtOAc(35mL)、THF(15mL)和水(40mL)中的混悬液中加入碳酸钾(1.90g,13.7mmol)。将混合物快速搅拌，冷却至0℃。通过滴液漏斗滴加在DCM中的丙烯酰氯(13.0mL,3.25mmol,0.25M)。在冰浴中搅拌10分钟后，将混合物用EtOAc稀释，倒入分液漏斗中。分离各层，将水层再次用EtOAc萃取。合并的有机萃取物用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。残余物经硅胶快速柱色谱法首先用0-100％(10％MeOH，在DCM中)/DCM和其次用0-100％[10％(7N NH3,在MeOH中)在DCM中]/DCM洗脱进行纯化，得到预期产物，为松散的固体。将固体超声30分钟，过滤，在高真空中干燥，得到标题化合物(1.60g,91％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)511.0/513.0[M+H]+。
表22：以基本上类似于实施例34的方式合成的化合物
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实施例46
向(4aR)-8-(2-氨基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-7,9-二氯-1,2,3,4,4a,5-六氢吡嗪并[2,1-c][1,4]苯并氧杂氮杂-11-酮(46mg,0.10mmol)、2-氟丙-2-烯酰酸(11mg,0.12mmol)、DIEA(53μL,0.30mmol)在DMF(1mL)中的于0℃冰浴中冷却的溶液中加入丙基膦酸酐在EtOAc中的50wt.％溶液(91μL,0.15mmol)。45分钟后，将反应混合物真空浓缩。粗混合物经反相色谱法、用B在A中的20-80％梯度(A:10mM NH4HCO3水溶液，含5％MeOH；B:ACN)洗脱纯化，得到标题化合物，为白色固体(25mg,47％)。ES/MS m/z:525(M+H)
表23：以基本上类似于实施例46的方式合成的化合物
/>
/>
实施例58
4-[(13aS)-10-氯-8-氟-2-(4-氟丁-2-炔酰基)-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-9-基]-2-氨基-7-氟-苯并噻吩-3-甲腈
将二乙氨基三氟化硫(0.03mL,0.2mmol)经注射器滴加至含有4-[(13aS)-10-氯-8-氟-2-(4-羟基丁-2-炔酰基)-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-9-基]-2-氨基-7-氟-苯并噻吩-3-甲腈(120mg,0.215mmol)在DCE(2mL)中的0℃溶液的密封小管中。将反应混合物搅拌30分钟，然后用水和25％IPA/氯仿溶液稀释。分离有机物，经无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。所得残余物经硅胶快速色谱法、用10％7M NH3在DCM/DCM中的0-100％溶液洗脱纯化，进一步经反相色谱法纯化，得到标题化合物，为白色固体(7mg,6％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)559.4/561.4[M+H]+。
表24：以基本上类似于实施例57的方式合成的化合物
实施例60
(13aS)-9-(2-氨基-3-氰基-7-氟-苯并噻吩-4-基)-10-氯-8-氟-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-2-甲腈
将溴化氰(3M，在DCM中,0.15mL,0.45mmol)加入含有在DCM(1mL)中的4-[(13aS)-10-氯-8-氟-6-氧代-2,3,4,12,13,13a-六氢-1H-吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-9-基]-2-氨基-7-氟-苯并噻吩-3-甲腈(100mg,0.211mmol)和1N NaOH(1mL)的烧瓶中。混合物于环境温度搅拌18小时，然后用水和25％IPA/氯仿溶液稀释。分离有机物，经无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。所得残余物进行反相色谱法，得到标题化合物，为白色固体(29mg,27％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)517.0/519.0[M+H]+。
实施例61
4-[(13aS)-10-氯-2-[(E)-2-氰基-4,4-二甲基-戊-2-烯酰基]-8-氟-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-9-基]-2-氨基-7-氟-苯并噻吩-3-甲腈
在20mL微波小瓶中加入44-[(13aS)-10-氯-2-(2-氰基乙酰基)-8-氟-6-氧代-1,3,4,12,13,13a-六氢吡嗪并[2,1-d][1,5]苯并噁唑辛-9-基]-2-氨基-7-氟-苯并噻吩-3-甲腈(0.410g,0.756mmol)、EtOH(8mL)、哌啶(0.15mL,1.5mmol)和三甲基乙醛(0.7mL,6mmol)，用垫片盖密封。将反应混合物在微波反应器中于120℃加热60分钟，于120℃加热另外90分钟，于100℃加热另外1小时，然后真空浓缩。将所得残余物经硅胶快速色谱法、用0-50％丙酮:DCM洗脱纯化，得到标题产物，为浅黄色固体(117mg,25％)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)610.6/612.6[M+H]+。
生物学分析
以下分析证明，实施例的化合物是KRas G12C抑制剂，在体外和/或体内抑制一些肿瘤的生长。
KRas G12C探针占用率TR-FRET测定
该分析的目的是测量抑制剂与探针竞争结合密码子12处的KRas G12C并共价修饰其的能力。该信号通过与KRas G12C结合的抗体铕标记的抗组氨酸Tag抗体LanthaScreen(Eu Anti-His抗体)上的铕和与KRas G12C结合的发荧光Tracer 647(Alexa FluorTM)之间通过链霉抗生物素和生物素化抑制剂的荧光时间分辨转移来产生(“KRas探针”,参见制备例223)。
抑制剂由在100％DMSO中的10mM储备液以剂量响应模式进行测试。Labycyte555用于稀释和转移每孔100nL至分析板，包含10个点、2.8倍系列稀释。制备两个分析板副本以测定抑制剂与KRas G12C一起孵育5和60分钟后的效力。将His-标签的KRasG12C(20nM)加到分析板的分析缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.5,0.01％TX-100和1mM DTT)中。孵育5或60分钟后，加入1μM KRas探针，使得共价调节游离KRas G12C 1小时。将其在含有Eu Anti-His抗体和链霉抗生物素包涂的示踪剂647(均来自Life Technologies)的缓冲液中4倍稀释，以获得KRas G12C(5nM)、Anti-His抗体(2nM)、KRas探针(300nM)和链霉抗生物素包涂的示踪剂647(500nM)。30分钟后，在EnvisionTM读板器上读取荧光信号(于340nM激发，示踪剂于665nM发射(em)，抗体于615nM发射)。最大对照孔没有抑制剂，最小对照孔没有抑制剂以及KRas G12C。信号比例(于665的em/于615的em)采用以下等式转化为抑制百分比：抑制％＝100–[(受试化合物信号–中位最小信号)/(中位最大信号–中位最小信号)x100]。IC50通过采用Genedata/>将每个抑制剂浓度的抑制百分比拟合为四参数非线性逻辑等式：y＝(A+((B-A)/(1+((C/x)^D))))，其中，y＝抑制％，A＝最小渐近线，B＝最大渐近线，C＝相对IC50或在两条渐进线的拟合范围内产生50％抑制的抑制剂浓度，且D＝Hill斜率。
在基本如上所述的该分析中评价了本发明范围内的化合物。通过与探针竞争结合密码子12处的KRas G12C并共价修饰其，在该分析中评价的本发明的实施例的化合物呈现出KRas G12C抑制剂活性。例如，在该分析中评价的实施例1的化合物在5和60分钟呈现出低于0.015μM的IC50，n＝4。
H358细胞磷酸-ERK
该分析的目的是人肺癌细胞H358(ATCC CRL-5807)中测量受试化合物抑制KRas下游效应子p-ERK1/2磷酸化的能力。简言之，UltraTM p-ERK 1/2(Thr202/Tyr204)分析是一种采用Alpha技术定量检测细胞裂解物中磷酸-ERK 1/2(在ERK1中Thr202/Tyr204磷酸化或在ERK2中Thr185/Tyr187磷酸化)的夹心免疫分析法(PerkinElmer Cat#ALSU-PERK-A50K)。
将H358细胞在96孔板(Costar#3596)中以40K个细胞/孔在含有10％FBS(GIBCOCat#:10082-147)的100μL培养基(RPMI 1640,GIBCO Cat#22400-071)中铺板，于37℃、5％CO2在潮湿托盘中孵育过夜。第二天早上，向细胞板中加入10μL系列稀释(3倍)的受试化合物(最高浓度50μM)和10μL对照(最大信号孔：5％DMSO，最小信号孔：2μM N-(3-{3-环丙基-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢吡啶并[4,3-D]嘧啶-1(2H)-基}苯基)乙酰胺(曲美替尼，阳性对照)，于37℃/5％CO2在潮湿托盘中孵育2小时。于环境温度制备含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的裂解缓冲液。通过在水槽中倒转并振摇细胞板、然后在纸巾上吸收除去培养基。将裂解缓冲液加入细胞板中(每孔50μL)，板于环境温度在摇床上孵育10分钟。对于p-ERK检测，将受体珠用缓冲液稀释成混悬混合物。使用STARlet液体处理器将5μL受体珠和2μL细胞裂解液作为单步骤尖头内稀释转移至384孔分析板。将分析板用箔密封，于环境温度孵育2小时。将供体珠用缓冲液稀释成混悬混合物。采用STARlet，将5μL供体珠加入分析板中，然后密封，用箔密封。将板在暗处于环境温度孵育2小时。然后采用发光程序在EnVisionTM读板器(Perkin Elmer)上读取分析板。
采用以下方程将信号转换为抑制百分比：抑制％＝100–[(受试化合物信号–中位最小信号)/(中位最大信号–中位最小信号)x100]。最大信号是不含抑制剂的对照孔。最小信号是含有足以完全抑制活性的参比抑制剂的对照孔。IC50通过采用Genedata将每个抑制剂浓度的抑制百分比拟合为四参数非线性逻辑等式：y＝(A+((B-A)/(1+((C/x)^D))))，其中，y＝抑制％，A＝最小渐近线，B＝最大渐近线，C＝相对IC50或在两条渐进线的拟合范围内产生50％抑制的抑制剂浓度，且D＝Hill斜率。
在基本如上所述的该分析中评价了本发明范围内的化合物。实施例的化合物呈现出抑制p-ERK1/2的磷酸化的能力。例如，实施例1的化合物在该分析中呈现出0.00178μM的相对IC50，n＝3。该数据显示，实施例的化合物在该细胞分析中呈现出KRas G12C抑制活性。
H358细胞活性RAS GTP酶ELISA
该分析的目的是测量受试化合物在人肺癌细胞H358(ATCC CRL-5807)中抑制组成型RAS GTP酶活性的能力。RAS GTP酶ELISA试剂盒(Active Motif Cat#52097)含有96-孔板，预涂有谷胱甘肽以捕获试剂盒供应的GST-Raf-RBD蛋白质。细胞提取物中的激活RAS(GTP-结合的)特异性结合Raf-RBD。采用识别人KRas的初级抗体检测结合的RAS。与HRP结合的次级抗体识别初级抗体，展开溶液提供了化学发光读数。
将H358细胞以80,000个细胞/孔接种于90μL无血清培养基(RPMI 1640,GIBCO)中，于37℃/5％CO2孵育过夜。第二天早上，向细胞板中加入10μL系列稀释(3倍)的受试化合物(500μM最高浓度)和10μL对照(最大信号孔：5％DMSO，最小信号孔：500μM 1-[4-[6-氯-8-氟-7-(3-羟基-1-萘基)喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮,WO2015054572，作为抑制剂)，于37℃/5％CO2孵育2小时。制备含有蛋白酶抑制剂混合物和GST-Raf-RBD的完全裂解/结合缓冲液，在冰上储存。在细胞板孵育完全之前一小时，将50μL GST-Raf-RBD在裂解/结合缓冲液中稀释，将缓冲液加入ELISA分析板中，将其在温和振摇下于4℃孵育1小时。2小时后，细胞用100μL冰冷的PBS洗涤，用100μL裂解/结合缓冲液裂解。细胞板于环境温度振摇10分钟。然后将细胞板于环境温度以1500rpm离心10分钟。在此期间，于环境温度制备1X洗涤缓冲液，然后用于洗涤(3x100μL)GST-Raf-RBD涂层的分析板。洗涤后，将50μL细胞裂解液加入GST-Raf-RBD包涂的分析板中，在温和振摇下于环境温度下孵育1小时。在此孵育期间，制备1X抗体结合缓冲液，放置在环境温度。将分析板用1X洗涤缓冲液洗涤3x100μL，然后加入50μL初级抗体(在1x抗体结合缓冲液中1:500稀释)。将板于环境温度孵育1小时。分析板用1X洗涤缓冲液洗涤3x100μL，然后加入50μL次级抗体(在1X抗体结合缓冲液中1:5000稀释)，于环境温度孵育1小时。分析板用1X洗涤缓冲液洗涤4x100μL，然后于环境温度加入50μL化学发光工作溶液。然后将分析板在EnVisionTM读板器(Perkin Elmer)上采用发光程序读数。
采用以下方程将信号转换为抑制百分比：抑制％＝100–[(受试化合物信号–中位最小信号)/(中位最大信号–中位最小信号)x100]。最大信号是不含抑制剂的对照孔。最小信号是含有足以完全抑制活性的参比抑制剂的对照孔。IC50通过采用Genedata将每个抑制剂浓度的抑制百分比拟合为四参数非线性逻辑等式：y＝(A+((B-A)/(1+((C/x)^D))))，其中，y＝抑制％，A＝最小渐近线，B＝最大渐近线，C＝相对IC50或在两条渐进线的拟合范围内产生50％抑制的抑制剂浓度，且D＝Hill斜率。
在基本如上所述的该分析中评价了本发明范围内的化合物。实施例的化合物呈现出抑制组成型RAS GTP酶活性的能力。例如，实施例1的化合物在该分析中呈现出0.00672μM的相对IC50，n＝4。该数据显示，实施例的化合物在该人肺癌细胞培养物中呈现出KRas-GTP抑制活性。
3D H358细胞增殖分析
该分析的目的是使用人肺癌细胞H358(ATCC CRL-5807)在3D增殖分析中评价受试化合物抑制。采用3D试剂(Promega G9683)检测反映细胞增殖的信号。细胞在补充有10％热灭活FBS和0.1mg/mL青霉素/链霉素的RPMI1640/>中生长。H358细胞在生长期进行培养，将5000个细胞/孔在黑色孔透明圆底96孔超低吸附表面平板(/>Cat 4520)中铺板，每孔80μL培养基。将细胞在湿度箱中于37℃孵育过夜。向板中加入20μL/孔系列稀释的受试化合物，然后将其孵育96小时。将板放置在环境温度，加入等体积的处于环境温度的/>3D试剂。将板于环境温度以750RPM振摇10分钟。于环境温度孵育1小时以稳定信号后，在EnVisionTM读板器上读取发光信号。采用以下方程将信号转化为抑制百分数：抑制％＝100–[(受试化合物信号–中位最小信号)/(中位最大信号–中位最小信号)x100]。最大信号是不含抑制剂的对照孔。最小信号是含有足以完全抑制细胞增殖的参比抑制剂(曲美替尼)的对照孔。IC50通过采用Genedata/>将每个抑制剂浓度的抑制百分比拟合为四参数非线性逻辑等式：y＝(A+((B-A)/(1+((C/x)^D))))，其中，y＝抑制％，A＝最小渐近线，B＝最大渐近线，C＝相对IC50或在两条渐进线的拟合范围内产生50％抑制的抑制剂浓度，且D＝Hill斜率。
在基本如上所述的该分析中评价了本发明范围内的化合物。例如，实施例1的化合物在该分析中呈现出0.0083μM的相对IC50。该数据显示，实施例1的化合物抑制H358人肺癌细胞的增殖。
细胞增殖分析
该分析的目的是评价KRas G12C突变型肿瘤系在用受试化合物处置后的生长。收集了一组具有KRas G12C或其它KRas突变的肿瘤细胞系(表25)。所有哦细胞系来自ATCC或指明的其它来源。
典型地，将细胞在补充有10％FBS(GIBCO,Invitrogen)的RPMI 1640或Dulbecco's改良的Eagle's培养基(DMEM,GIBCO)中培养。对于维持在上述生长培养基中的2D培养细胞(4x103个/孔)，在处置前一天在96孔组织培养板(Cat.3603)上铺板。将细胞用化合物处置96小时，然后采用/>Luminescent Cell Viability/>(Promega#G7572,用于2D)根据制造商的指示和采用EnVisionTM读板器分析存活。采用GraphPad Prism/>软件，将非线性回归和S型剂量-响应曲线用于计算半数最大抑制浓度(IC50)。
表25：实施例1、34-36在一组KRas G12C突变肿瘤细胞系中的体外抗增殖活性
数据表明，实施例1、34-36的化合物抑制了表26中列出的多种KRas G12C突变肿瘤细胞系的生长。
如表25中所概括的那样，实施例1、34-36的化合物在2D培养条件下、在大多数具有KRas G12C突变的肿瘤细胞中呈现出抗增殖活性。在具有KRas G12S突变的A549细胞中，实施例1、34-36的化合物显示出很少的活性，表明实施例1、34-36选择性地抑制具有KRasG12C突变的肿瘤细胞。
H358异种移植模型和胰腺癌MiaPaca-2异种移植模型中KRas G12C药效(PD)标记物的抑制
这些分析的目的是评价口服施用的化合物的体内靶标抑制。将人肺癌H358细胞或胰腺癌MiaPaca-2细胞植入裸小鼠异种移植肿瘤模型中。将H358或MiaPaca-2细胞(10x106个,在1:1混合物中,0.2mL总体积)通过皮下注射植入雌性裸小鼠(HarlanLaboratories)的后腿。每组共3-4只小鼠用于靶标接合和PD研究。当肿瘤尺寸达到约300mg时，口服施用(管饲)受试化合物或载体(20％/>25mM磷酸盐，pH2.0，0.2mL)开始治疗。
对于体内靶标抑制和PD分析，用研钵和研杵在干冰上研磨肿瘤，在每管含有一个另外的大珠子(MP1/4"陶瓷球状珠,目录号6540-412)的裂解基质D试管(MP目录号6913-500)中，将肿瘤碎片和Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂合剂(Thermo Scientific,目录号1861281)一起加入800μL裂解缓冲液中，所述裂解缓冲液含有1％TritonTMX-100、25mM Tris pH7.5、150mM磷酸钠、1mM EDTA和1mM EGTA。在冷却下将肿瘤碎片在设置为4的Thermo/>fast prep(FP120)中均化15分钟，总共2次。裂解物在4℃以14,000rpm旋转10分钟以澄清。采用BioRad/>蛋白质分析对裂解物上清液进行了蛋白质评估，将裂解物稀释在来自Ras GTP酶Chemi ELISA/>的完全裂解/结合缓冲液(Active Motif，目录号52097)中。如下进行活性KRas ELISA：将谷胱甘肽包涂的ELISA孔和稀释RAF1-GST一起在完全裂解/结合缓冲液中、在温和振动下于4℃孵育1小时。将孔用洗涤缓冲液洗涤3次，向各孔加入100μg裂解物，在温和振动下于环境温度孵育1小时。将孔另外洗涤3次，然后向各孔加入在抗体结合缓冲液中稀释的初级抗体。将板孵育1小时。将孔再洗涤3次，然后向各孔加入在抗体结合缓冲液中稀释的HRP缀合次级抗体。将板于环境温度孵育1小时。将ELISA孔洗涤4次，加入化学发光试剂，然后读取发光。对于pERK Meso ScaleDiscovery ELISA，使用25μg含0.1％SDS的蛋白质；用于pERK的Meso Scale DiscoveryWhole Cell Lysate Kit由Meso Scale Discovery提供。
在肺癌H358异种移植模型中的剂量依赖性体内靶标抑制和药效学效应
该分析的目的是在肺癌模型中评估剂量依赖性体内靶标抑制和药效学效应。在肺癌H358小鼠异种移植模型中以12.5至100mg/kg的剂量范围给予受试化合物。单次剂量后8小时收集肿瘤样品。制备肿瘤裂解液，如上所述测定pERK和活性KRas的抑制。表26提供了结果；实施例34的化合物在从12.5至100mg/kg的单次剂量处置后在8小时显示出pERK和活性KRas的剂量依赖性抑制。实施例35的化合物在从12.5至100mg/kg的单次剂量处置后也显示出对pERK和活性KRas的良好抑制。在这些剂量水平观察到82.2％-90.6％的pERK抑制和73.4％-94％的活性KRas抑制。
表26：H358异种移植小鼠模型中的pERK、pMEK和活性Kras的剂量依赖性抑制
肺癌H358异种移植小鼠模型中的时间依赖性体内靶标抑制和药效学效应
该分析的目的是在肺癌模型中评估时间依赖性靶标抑制和药效学效应。在时间过程实验中，实施例35和36的化合物也是以30mg/kg给予。单次剂量后，在给药后2、4、8、12和24小时收获肿瘤样品。制备肿瘤裂解液，如上所述测定pERK和活性KRas的抑制。表27提供了结果。实施例35的化合物在30mg/kg的单次剂量处置后呈现出pERK和活性KRas的时间依赖性抑制。在30mg/kg，在8小时观察到82.6％pERK抑制，在24小时pERK抑制降低至65.2％。对于活性KRas，在8小时处获得了80.2％抑制，在24小时活性KRas抑制降低至54.9％。实施例36的化合物在30mg/kg的单次剂量处置后也呈现出pERK和活性KRas的时间依赖性抑制。在30mg/kg，在8小时观察到82.6％pERK抑制，在24小时pERK抑制降低至48.8％。低于活性KRas，在8小时获得88.5％抑制，在24小时活性KRas抑制降低至43.2％。
表27.H358模型中pERK和活性KRas的时间依赖性抑制
在胰腺癌MiaPaca-2异种移植小鼠模型中的体内靶标抑制和药效学效应
该分析的目的是在胰腺癌模型中评估剂量和时间依赖性体内靶标抑制和药效学效应。在时间过程实验中，实施例35的化合物以5、10或30mg/kg给予。单次剂量后，在给药后2、4、8、12和24小时收获肿瘤样品。制备肿瘤裂解液，如上所述测定pERK和活性KRas的抑制。表28提供了结果。实施例35的化合物在5、10或30mg/kg的单次剂量处置后呈现出pERK和活性KRas的剂量和时间依赖性抑制。在5mg/kg，在4小时观察到63.8％的活性Ras抑制和50.9％的pERK抑制。在10mg/kg，在4小时观察到85.5％的活性Ras抑制和58.5％的pERK抑制。在30mg/kg，在4小时观察到90.9％的活性Ras抑制和58.7％的pERK抑制，在24小时维持了60.7％的活性Ras抑制。
表28.在MiaPaca-2模型中pERK和活性KRas的剂量和时间依赖性抑制
剂量(mg/kg) 处置时间(小时) 活性RAS的抑制％ pERK的抑制％
4 0 0
5 2 24.3 51
5 4 63.8 50.9
5 8 57 59
5 12 34.3 47.4
5 24 4.3 -30.2
10 2 67.8 68.5
10 4 85.5 58.5
10 8 78.9 57.6
10 12 44.7 49
10 24 22.8 -14.9
30 2 76 59.5
30 4 90.9 58.7
30 8 89 54.3
30 12 68.9 58.4
30 24 60.7 15.6
在肺癌H358异种移植小鼠模型中的抗肿瘤生长活性
该分析的目的是在肺癌H358小鼠异种移植模型中确定受试化合物(实施例34、35和36)的肿瘤活性。将H358肺肿瘤细胞(10x106个)通过皮下注射植入雌性裸小鼠(TaconicBiosciences)的后腿。每组共4只小鼠用于功效研究。当肿瘤尺寸达到约300mg时，口服施用(管饲)受试化合物或载体(20％25mM磷酸盐，pH2.0，0.2mL体积)开始治疗，每天一次或两次，共28天。随时间推移监测肿瘤生长和体重，以评价功效和毒性征兆。表29提供了综合结果。在100mg/kg每日一次给药方案中，实施例34的化合物观察到-6.28至-30.96％的肿瘤生长消退。在30mg/kg每日两次给药方案中，实施例35的化合物观察到-67.68至-72.14％的肿瘤消退。在30mg/kg每日两次给药方案中，实施例36的化合物实现了-68.96％的肿瘤进展。在这些化合物的整个研究中，没有观察到显著的动物体重损失。
表29：在肺癌H358异种移植小鼠模型中的抗肿瘤生长活性
处置 剂量(mg/kg) 给药方案 消退％(第12天) 消退％(第26天)
实施例35 30 PO,BID -72.14 -67.68
实施例36 30 PO,BID -68.96 NA
实施例34 100 PO,QD -30.96 -6.28
在其它肺癌模型以及结肠直肠癌、胰腺癌、膀胱癌和食道癌模型中的抗肿瘤生长活性
除了H358异种移植模型，实施例35的化合物还在肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、膀胱癌和食道癌的其它异种移植或患者来源的异种移植(PDX)模型中以不同剂量进行了测试。对于H1373、HCC44、MiaPaca-2、SW1463、KYSE-410和UM-UC-3的异种移植模型，通常将5至10x106个细胞在1:1基质胶混合物(0.2mL总体积)中通过皮下注射植入裸小鼠后腿。通常，每组共4只小鼠用于功效研究。当肿瘤尺寸达到约200-300mg时，通过口服施用(管饲)0.2mL体积的受试化合物或载体(20％Captisol,25mM磷酸盐,pH2.0)开始治疗。随时间推移监测肿瘤生长和体重，以评估功效和毒性征兆。对于EL3187 PDX模型，将含有肿瘤碎片的冷冻小瓶在水浴中于37℃解冻。将肿瘤碎片转移到50mL Falcon管中，向管中缓慢加入冰冷的DMEM培养基至总体积为35mL。然后，将肿瘤碎片以130xg于4℃离心2分钟，吸出上清液。重复此洗涤步骤两次，将肿瘤碎片重新混悬于10mL DMEM中，用于植入无胸腺裸-Foxn1nu小鼠(Envigo RMS,Inc.,Mount Comfort,Indiana)。一旦肿瘤体积达到800至1000mm3，处死动物，采用无菌技术收获肿瘤。将新鲜肿瘤切成10至15mm3的碎片，置于冷Gibco hibernate培养基中。用10g套管针将肿瘤碎片皮下植入动物体内。当肿瘤尺寸达到200至300mm3时，将动物随机分组用于化合物治疗。
表30总结了实施例35的化合物的抗肿瘤生长或消退活性。在表31列出的模型中，EL3187是患者来源的异种移植(PDX)模型，所有其它都是肿瘤异种移植模型。如表31中所示，实施例35的化合物在所有模型中都显示出剂量依赖性抗肿瘤活性，表明实施例35的化合物具有对抗具有KRasG12C突变的癌症的活性，包括肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、膀胱癌和食道癌。
表30：实施例35的化合物在肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、膀胱癌和食道癌异种移植或PDX模型中的抗肿瘤生长活性
实施例35的化合物与其它靶向疗法的体外组合功效
除了单一疗法，还评价了实施例35的化合物与其它靶向疗法的组合功效，所述其它靶向疗法例如有CDK4和CDK6抑制剂阿贝西利、EGFR小分子抑制剂厄洛替尼或阿法替尼、EGFR单克隆抗体西妥昔单抗和ERK抑制剂LY3214996。从ATCC获得了11种细胞系用于该研究，在ATCC推荐的条件下生长。所有细胞系都具有KRAS G12C突变，它们是六种肺癌细胞系(H358、H1373、H1792、H2030、H2122、SW1573和HCC44)、两种结肠直肠癌细胞系(SW837和SW1463)、一种胰腺癌细胞系(MiaPaca-2)和一种食道癌细胞系(KYSE410)。以4天生长分析进行增殖分析，采用Cell作为读数。简言之，将细胞在96-孔细胞培养板上铺板，使之于37℃粘附过夜。第二天，将细胞用作为单独治疗或组合治疗的化合物处理。首先，将受试化合物在DMSO中系列稀释，然后在培养基中用1％DMSO稀释为5X浓度，最后加入培养基的细胞中至1X。将细胞于37℃孵育另外4天。在孵育期结束时，将Cell/>试剂混合，加入孔中。10分钟后，通过Perkin Elmer Envision仪器读取发光。产生了针对单一疗法和组合疗法通过4-参数逻辑模型产生的绝对IC50值，继之以用于每个组合治疗和细胞系的组合指数。当一起添加时，基于每种化合物的总浓度调节组合IC50值。(实施例：对于化合物1和化合物2的1:1浓度比例，组合IC50增加了1/2)。组合指数(CI)测定了组合疗法的效力与预期相加效力(expected-if-additive potency)不同的程度，其基于相加作用的Loewe定义。/>
其中
·CA，y疗法CB，y是疗法A和B当组合给予时产生作用y的浓度，
·ICA，y和是ICB，y是A和B当单独给予时产生作用y的浓度。
在一些情况下，如果估计的IC50值用于CI计算，则计算的CI称为增强指数。组合或增强指数的生物学解释如下：如果组合或增强指数<0.5，则为协同；如果组合或增强指数为0.5至2之间，则为相加；如果组合或增强指数为>2，则为拮抗。
如表31所示，实施例35的化合物和阿贝西利的组合在抑制具有KRasG12C突变的肿瘤细胞方面具有相加或协同功效。在所测试的11种细胞系中，在5种细胞系中观察到相加作用，组合指数(CI)为0.5至1.2之间，在6种细胞系中观察到协同作用，CI为<0.5，表明实施例35的化合物和阿贝西利的组合可以给具有KRas G12C突变的癌症患者提供益处。
表31：实施例35的化合物和CDK4/CDK6抑制剂阿贝西利的体外组合
如表32所示，实施例35的化合物和EGFR小分子抑制剂厄洛替尼或阿法替尼的组合在抑制具有KRasG12C突变的肿瘤细胞方面具有相加或协同作用。对于厄洛替尼组合，在所测试的11种细胞系中，在5种细胞系中观察到相加作用，组合或增强指数为0.5至1.15之间，在6种细胞系中观察到协同作用，组合或增强指数为<0.5。对于阿法替尼组合，在所测试的9种细胞系中，在4种细胞系中观察到相加作用，CI为0.5至1.1之间，在5种细胞系中观察到协同作用，CI为<0.5。这些数据表明，实施例35的化合物和EGFR小分子抑制剂可给具有KRasG12C突变的癌症患者提供益处。
表32：实施例35的化合物和EGFR小分子抑制剂厄洛替尼或阿法替尼的体外组合
如表33所示，实施例35的化合物和EGFR抗体西妥昔单抗的组合在抑制具有KRasG12C突变的肿瘤细胞方面具有相加或协同功效。在所测试的11种细胞系中，5种细胞系具有相加作用，增强指数(CI)为0.5至1.06之间，6种细胞系具有协同作用，增强指数为<0.5，表明实施例35和西妥昔单抗的组合可以给具有KRas G12C突变的癌症患者提供益处。
表33：实施例35和EGFR抗体西妥昔单抗的体外组合
如表34所示，实施例35的化合物和ERK抗体LY3219446的组合在抑制具有KRasG12C突变的肿瘤细胞方面具有相加或协同功效。在所测试的10种细胞系中，在5种细胞系中观察到相加作用，CI为0.5至1.2之间，在5种细胞系中观察到协同作用，组合或增强指数为<0.5，表明实施例35和ERK抑制剂的组合可以给具有KRas G12C突变的癌症患者提供益处。
表34：实施例35的化合物和ERK抑制剂LY3214996的体外组合
实施例35的化合物与化学疗法的体外组合功效
实施例35的化合物还与化学疗法、包括培美曲塞、卡铂或顺铂组合体外用于三种肺癌细胞系H1792、H358和H2122。如表35所示，对于培美曲塞组合，基于CI观察到相加或协同作用。用卡铂和顺铂组合观察到类似的组合作用。
表35：实施例35的化合物和化学疗法的体外组合(组合指数)。
实施例35与其它靶向疗法的体内组合功效
实施例35的化合物与CDK4/CDK6抑制剂阿贝西利、EGFR小分子抑制剂厄洛替尼或阿法替尼、抗-EGFR单克隆抗体西妥昔单抗或ERK抑制剂LY3214996组合在PDX动物模型中进行了评价。使用了总共6种体内异种移植或PDX模型–四种肺模型(H358、H1373、LU99和EL3187 PDX)、一种结肠直肠模型(SW1463)和一种胰腺模型(MiaPaca-2)。表36是对所有这些体内组合研究结果的总结。
在所有6种模型中研究了实施例35的化合物与CDK4/6抑制剂阿贝西利的组合。在所有6种模型中，组合优于单独的实施例35的化合物或阿贝西利。在四种肺癌模型和一种胰腺癌模型中，观察到组合的协同作用和显著的肿瘤生长消退。在结肠直肠SW1463模型中，观察到比单独的实施例35的化合物或阿贝西利好的抗肿瘤活性。
在所有6种模型中进行了实施例35的化合物和EGFR小分子抑制剂厄洛替尼的组合。在所有6种模型中，组合优于单独的实施例35的化合物或厄洛替尼。在三种肺癌模型和一种胰腺癌模型中，观察到组合的协同作用和显著的肿瘤生长消退。在结肠直肠癌SW1463模型和肺癌LU99模型中，组合优于单独的实施例35的化合物或厄洛替尼。在肺癌H358异种移植模型中，相对于单独的化合物，实施例3的化合物和EGFR小分子抑制剂阿法替尼的组合观察到相加作用和更好的抗肿瘤活性。
在H358肺癌异种移植模型和SW1463结肠直肠癌异种移植模型中进行了实施例35和EGFR抗体西妥昔单抗的体内组合研究。在两种模型中，观察到组合的肿瘤生长消退和更好的组合功效。组合优于单独的实施例35化合物或西妥昔单抗。
在所有6种模型中研究了实施例35的化合物和ERK抑制剂(ERKi)LY3214996的组合。在所有6种模型中，观察到组合的协同或相加作用，组合优于单独的实施例35的化合物或ERK抑制剂。在三种肺癌模型(H358、H1373和EL3187)、一种胰腺癌模型和一种结肠直肠模型中，观察到显著的肿瘤生长消退。
表36.在肿瘤异种移植或PDX模型中实施例35的化合物与其它靶标疗法组合的体内抗肿瘤活性
*表示平均肿瘤体积大于载体对照组
与免疫疗法抗-PD-1或抗-PD-L1抗体的组合功效
使用小鼠同基因模型来评价KRas G12C抑制和免疫疗法组合的作用。在该模型中，通过小鼠结肠直肠肿瘤细胞系CT-26细胞系中的CRISPR敲入，将KRas G12D突变转化为KRasG12C突变。KRas G12C调入通过基因和功能表征来证实。工程化细胞系命名为CT-26-H4/KRas G12C。将这些细胞植入Balb/c小鼠，在肿瘤细胞植入后6天开始化合物处置。在该研究中，将实施例35的化合物与抗-PD-L1抗体(RMP1-14(BioXcell目录号BE0146))或抗-PD-1抗体(Holmgaard RB,et al.,J.Immunotherapy Cancer 2018；6(47):1-15)组合，剂量方案列在表37中。如表37所示，实施例35的化合物证明了显著的单独活性剂活性，在3周给药结束时的肿瘤生长抑制平均为89.4％，在30mg/kg没有完全响应。在给药结束时(第21天)或第59天，抗-小鼠PD-L1抗体178G7显示出36.1％肿瘤生长抑制，没有完全响应，抗-PD-1抗体RMP1-14显示出70.7％肿瘤生长抑制和10％(10个中有1个)完全响应。但是，实施例35的化合物与抗-PD-L1或抗-PD-1抗体的组合获得了显著更好的抗肿瘤活性。在3周给药结束时，实施例35的化合物与抗-PD-L1或抗-PD-1抗体的组合分别显示出-33.9％和-19.4％肿瘤消退和30％和40％完全响应。3周后，停止化合物处置，单一疗法组(除了抗-PD-1中的1只动物)中的所有肿瘤开始重新生长。但是，两个组合组中的很多肿瘤没有显示出重新生长的迹象。最后给药后38天(第59天)，组合组具有40％和60％完全响应，表明组合组中的很多肿瘤被清除。这些结果表明，用实施例35的化合物与抗-PD-L1或抗-PD-1抗体组合可以有利于具有KRas G12C突变的癌症患者。
表37：在CT-26-H4/KRasG12C同基因模型中实施例35的化合物与免疫疗法(抗-PD-1或抗-PD-L1抗体)组合的体内抗肿瘤活性
/>

Claims (28)

1.下式的化合物或其药学上可接受的盐，
其中：
A是-OCH2-、-OCH2CH2-、-N(R6)CH2CH2-、或-CH2OCH2-；
B是-CH2-或-C(O)-；
Y是-C(CN)-或-N-；
R1是-CN、-C(O)C≡CR8或下式的基团
R2是H或甲基；
R3和R5各自独立地是H、卤素、或-任选被R10取代1-3次的C1-6烷基；
R4是H或卤素；
R6是H或-任选被R10取代1-3次的C1-6烷基；
R7是H、卤素、-CH2NR11R12、或-任选被R10或R13取代1-3次的C1-6烷基；
R8是H、或-任选被R10取代1-3次的C1-4烷基；
R9是H、卤素、-CN、或-任选被R10取代1-3次的C1-6烷基；
R10在每次出现时独立地是卤素、＝O、羟基、-C1-4烷基或-O-C1-4烷基；
R11和R12各自独立地是H、-C1-4烷基或-C1-4杂烷基，其中R11和R12可以组合形成环杂烷基；且
R13在每次出现时独立地是其中一个H被C1-4烷基取代的、两个H被C1-4烷基取代的或者两个H被取代形成吗啉的-NH2-。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中A是-OCH2CH2-。
3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中B是-C(O)-。
4.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Y是-C(CN)-。
5.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Y是-N-。
6.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是下式基团
和其中R7是H、F、Cl、甲基、乙氧基、乙基、异丙基或环丙基。
7.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是下式基团
和其中R9是H、F、Cl、-CHF2、-CF3或-CH2OH。
8.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是-CN、-C(O)C≡CR8。
9.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2是H或甲基。
10.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3是H、F、Cl、甲基、甲氧基、或乙基。
11.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R4是H、F或Cl。
12.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R5是H、-CHF2、-CH2F、-CH2OH或-CH2OCH3。
13.根据权利要求1-12任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R13在每次出现时独立地是-NH-C1-4烷基。
14.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物具有下式：
其中：
A是-OCH2-或-OCH2CH2-；
Y是C(CN)或N；
R3是Cl或F；
当Y是C(CN)时，R4是H或F；且
当Y是N时，R4是F。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中A是
16.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物选自：
17.根据权利要求16所述的化合物，所述化合物为：
18.化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
19.药物组合物，其包含根据权利要求1-18任一项的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
20.根据权利要求1-18任一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗患者的癌症。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述癌症选自肺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胆管癌和结肠直肠癌。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌，和其中一个或多个细胞表达在密码子12处甘氨酸被半胱氨酸替换的Kirsten大鼠肉瘤突变体蛋白质。
23.根据权利要求21所述的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌，和其中一个或多个细胞表达在密码子12处甘氨酸被半胱氨酸替换的Kirsten大鼠肉瘤突变体蛋白质。
24.根据权利要求21所述的用途，其中所述癌症是胰腺癌，和其中一个或多个细胞表达在密码子12处甘氨酸被半胱氨酸替换的Kirsten大鼠肉瘤突变体蛋白质。
25.根据权利要求21所述的用途，其中所述患者在施用所述化合物或其药学上可接受的盐之前患有被确定具有一个或多个表达在密码子12处甘氨酸被半胱氨酸替换的Kirsten大鼠肉瘤突变体蛋白质的细胞的癌症。
26.根据权利要求20的用途，其中所述患者患有具有在密码子12处甘氨酸被半胱氨酸替换的Kirsten大鼠肉瘤突变的癌症。
27.根据权利要求19的药物组合物，还包含，程序性细胞死亡蛋白质1抑制剂或其药学上可接受的盐、程序性细胞死亡配体1抑制剂或其药学上可接受的盐、细胞周期蛋白依赖性激酶4/细胞周期蛋白依赖性激酶6抑制剂或其药学上可接受的盐、表皮生长因子受体抑制剂或其药学上可接受的盐、细胞外信号调节激酶抑制剂或其药学上可接受的盐、铂药物和培美曲塞或其药学上可接受的盐中的一种或多种。
28.药剂，包含根据权利要求1-18任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，用于与程序性细胞死亡蛋白质1或程序性细胞死亡配体1抑制剂或其药学上可接受的盐、细胞周期蛋白依赖性激酶4/细胞周期蛋白依赖性激酶6抑制剂或其药学上可接受的盐、表皮生长因子受体抑制剂或其药学上可接受的盐、细胞外信号调节激酶抑制剂或其药学上可接受的盐、铂药物和培美曲塞或其药学上可接受的盐中的一种或多种同时、分别或依次组合用于癌症治疗中。
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