CN114796238A - 一种抑制耐药癌症的雷公藤类组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抑制耐药癌症的雷公藤类组合物，所述组合物由雷公藤内酯醇和1β‑E‑桂皮酰氧基‑4a‑羟基‑5a,7β,11‑三乙酰氧基‑8β‑烟酰氧基‑二氢沉香呋喃、去甲基泽拉木醛、TriptobenzeneR、(3S,4S,5R,10S)‑3,19‑二羟基‑7‑氧化松香烷‑8,11,13‑三烯、TriptobenzeneB中任意一种或两种组成。本发明所述组合物具有比雷公藤内酯醇毒性低，抑制肿瘤耐药细胞增殖的药物效应增强的优点，与单一的雷公藤内酯醇相比，具有减毒增效的作用。

Description

一种抑制耐药癌症的雷公藤类组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种抑制耐药癌症的雷公藤类组合物及其制备方法和应用。
背景技术
雷公藤系卫矛科雷公藤属落叶蔓生灌木，别名有震龙根、蒸龙草、莽草、黄藤草、断肠草、山砒霜等，以根、叶、花及果入药，主产于浙江、安徽、江西、湖南、广东、广西、福建、台湾、云南等地，其活性成分十分复杂，其药理作用主要有免疫调节、抗肿瘤、改善微循环、抗炎、杀菌以及解热镇痛等；临床上可用于治疗麻风反应、类风湿性关节炎、肺结核及其他慢性疾病等。目前，已有雷公藤片，雷公藤多苷片，雷公藤糖浆、冲剂及合剂等多种制剂生产，可用于多种疾病的治疗。
虽然，近年来雷公藤的整体化学成分、尤其对雷公藤内酯醇类的毒效评价日益受到国内外学者的关注，但是由于雷公藤原植物、根、皮和叶中成分众多，许多成分在原植物里面含量极低，比如雷公藤内酯醇仅为0.012％(120mg/kg)，导致单一雷公藤类化合物的应用研究受到限制。目前已经从雷公藤中分离鉴定出380多种具有生物活性的化学成分，有部分活性分子可抑制肿瘤，比如雷公藤内酯醇，但是其药理毒性很大，比如口服能刺激胃粘膜，引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状，还可以引起肝脏损伤，出现皮肤色素沉着、皮疹和口腔溃疡，导致白细胞减少。故研发一种高效且低毒的雷公藤类组合物是现阶段需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抑制耐药癌症的雷公藤类组合物，该组合物具有高效、低毒的抑制耐药癌症的作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种抑制耐药癌症的雷公藤类组合物，包括如下化合物中的两种或两种以上：A：1-去乙酰基雷公藤硷乙(1-desacetylwilforgine)；B：(2S)-5,7-二羟基-2′-甲氧基-8-(3-甲基-2-丁烯基)-4′,5′-呋酮-黄烷酮(Tripteryol C)；C：Triptergulide D；D：(3S,5R,6S,7E)-3,5,6-三羟基-7-大柱烯-9-酮((3S,5R,6S,7E)-3,5,6trihydroxy-7-megastigmen-9-one)；E：1β-E-桂皮酰氧基-4a-羟基-5a,7β,11-三乙酰氧基-8β-烟酰氧基-二氢沉香呋喃(1β-(E-cinnamoyloxy)-4a-hydroxy-5a,7β,11-tria cet oxy-8β-nicotinoyloxy-dihydroagarofuran)；F：Tripterygiumine C；G：雷公藤内酯醇(triptolide，TP)；H：去甲基泽拉木醛(Demethylzeylasteral)；I：Triptobenzene R；J：(3S,4S,5R,10S)-3,19-二羟基-7-氧化松香烷-8,11,13-三烯((3S,4S,5R,10S)-3,19-dihydroxy-7-ox-oabieta-8,11,13-triene)；K：二十三酸(Tricosanoic acid)；L：Wilfordiol B((7R,8S)-8-O-4′-(3′,5′-二甲氧基-1′-羟甲基苯基)-愈创木酚基甘油)；M：(+)-(7R,8S,8′S R)9-苯甲酸基-5-甲氧基-落叶松脂醇((+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-5-me thoxy-lariciresinol)；N：Triptersinine O(1β，5a-二呋喃酰氧基-4a-羟基-7β，11-二乙酰氧基-8β烟酰氧基-二氢沉香呋喃)；O：Triptregeline J(2β-乙酰氧基-1a,9β-二苯甲酰氧基-4β-羟基-6β-(3-烟酰氧基)-β-二氢沉香呋喃)；P：Triptobenzene B；Q：Triptersinine E(1β-Z-桂皮酰氧基-4a-羟基-5a,7β,11-三乙酰氧基-8β-烟酰氧基-二氢沉香呋喃)；R：Triptersinine Z3(5α,11-双乙酸基-1β-反式肉桂酰-4α,7β,8β-三羟基二氢沉香呋喃)。
优选的，所述组合物为G和其他化合物的组合物，所述其他化合物为E、H、I、J、P中的任意一种或多种。
优选的，所述G和一种化合物组合时，G和另外一种化合物的体积比为1:4～4:3。
优选的，所述G和一种化合物组合时，G和另外两种化合物的体积比为1:1:1～4:3:4。
优选的，所述G或E或I或J的作用浓度分别为0.5～7μg/ml。
优选的，所述H或P的作用浓度分别为10～45μg/ml。
本发明提供了所述的雷公藤组合物的制备方法，包括如下步骤：采用高效液相分离雷公藤悬浮细胞提取液分析样品和雷公藤悬浮细胞培养液分析样品混合液中的化合物，将得到的所述化合物组合。
优选的，所述高效液相分离的条件为：色谱柱为Hypersil ODS2-C18250mm，柱温为室温，吸收波长为210nm、219nm、230nm，进样量为20μl，流动相为乙腈和超纯水，洗脱条件如下：
Figure BDA0003572732240000031
本发明还提供所述的组合物在制备抑制耐药癌症药物中的应用。
优选的，所述癌症包括肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病中任意一种或多种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用雷公藤细胞培养获得的雷公藤细胞分离液以及培养液，采用高效液相分离出18种活性成分，分离步骤简便易操作，可重复性高。
本发明首次筛选出新的5种化合物组合物与雷公藤内酯醇相比，具有比雷公藤内酯醇毒性降低，抑制肿瘤耐药细胞增殖的药物效应增强的优点，与单一的雷公藤内酯醇相比，具有减毒增效的实质性进步。
附图说明
图1 18种化合物对H460/DDP细胞作用后48h后的药物抑制增殖作用。
图2 5种化合物对A549和H1299细胞作用48h后的药物抑制增殖作用(a～e为作用于A549DDP细胞；f～j为作用于H1299DDP细胞)。
图3 TP和优选化合物联合对A549/DDP细胞作用48h后的抑制细胞增殖的作用。
图4 TP与活性化合物联合用药作用于A549/DDP细胞48h后活性物剂量效应曲线。
图5 TP和活性分子组合物对H1299/DDP细胞作用48h后的抑制增殖作用。
图6 TP与活性化合物联合用药作用于H1299/DDP细胞48h后剂量效应曲线。
图7 TP和活性分子及联合对H460/DDP细胞作用48h后的抑制细胞增殖的作用。
图8 TP与活性分子联合作用于H460/DDP细胞48h后药物剂量效应曲线。
图9 TP和活性分子及联对16HBE细胞作用48h的细胞毒性作用。
注：图3、图5、图7、图9中a为化合物E、b为化合物H、c为化合物I、d为化合物J、e为化合物P；图4、图6、图8中a为TP与活性物剂量效应曲线、b为TP与活性物中值效应、c为TP与活性物组合剂量效应、d为TP与活性物组合中值效应、e为TP与活性物Fa-CI图。
具体实施方式
本发明提供了一种抑制耐药癌症的雷公藤类组合物，包括如下化合物中的两种或两种以上：A：1-去乙酰基雷公藤硷乙(1-desacetylwilforgine)；B：(2S)-5,7-二羟基-2′-甲氧基-8-(3-甲基-2-丁烯基)-4′,5′-呋酮-黄烷酮(Tripteryol C)；C：Triptergulide D；D：(3S,5R,6S,7E)-3,5,6-三羟基-7-大柱烯-9-酮((3S,5R,6S,7E)-3,5,6trihydroxy-7-megastigmen-9-one)；E：1β-E-桂皮酰氧基-4a-羟基-5a,7β,11-三乙酰氧基-8β-烟酰氧基-二氢沉香呋喃(1β-(E-cinnamoyloxy)-4a-hydroxy-5a,7β,11-tria cet oxy-8β-nicotinoyloxy-dihydroagarofuran)；F：Tripterygiumine C；G：雷公藤内酯醇(triptolide,TP)；H：去甲基泽拉木醛(Demethylzeylasteral)；I：Triptobenzene R；J：(3S,4S,5R,10S)-3,19-二羟基-7-氧化松香烷-8,11,13-三烯((3S,4S,5R,10S)-3,19-dihydroxy-7-ox-oabieta-8,11,13-triene)；K：二十三酸(Tricosanoic acid)；L：Wilfordiol B((7R,8S)-8-O-4′-(3′,5′-二甲氧基-1′-羟甲基苯基)-愈创木酚基甘油)；M：(+)-(7R,8S,8′S R)9-苯甲酸基-5-甲氧基-落叶松脂醇((+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-5-me thoxy-lariciresinol)；N：Triptersinine O(1β，5a-二呋喃酰氧基-4a-羟基-7β，11-二乙酰氧基-8β烟酰氧基-二氢沉香呋喃)；O：Triptregeline J(2β-乙酰氧基-1a,9β-二苯甲酰氧基-4β-羟基-6β-(3-烟酰氧基)-β-二氢沉香呋喃)；P：Triptobenzene B；Q：Triptersinine E(1β-Z-桂皮酰氧基-4a-羟基-5a,7β,11-三乙酰氧基-8β-烟酰氧基-二氢沉香呋喃)；R：Triptersinine Z3(5α,11-双乙酸基-1β-反式肉桂酰-4α,7β,8β-三羟基二氢沉香呋喃)。
在本发明中，所述各化合物的结构式为：
Figure BDA0003572732240000051
在本发明中，所述组合物为G和其他化合物的组合物，所述其他化合物为E、H、I、J、P中的任意一种或多种。本发明中所述G和一种化合物组合时，G和另外一种化合物的体积比为1:4～4:3，体积比更优选为1:1；所述G和一种化合物组合时，G和另外两种化合物的体积比为1:1:1～4:3:4，体积比更优选为1:1:1。
在本发明中，所述G或E或I或J的作用浓度分别为0.5～7μg/ml。在本发明中，所述G的作用浓度优选为2.5～5μg/ml，E的作用浓度优选为1～2μg/ml，所述I的作用浓度优选为0.9～1.8μg/ml，所述J的作用浓度优选为2～4μg/ml。
在本发明中，所述H或P的作用浓度分别为10～45μg/ml。本发明中所述H的作用浓度优选为11～22μg/ml，所述P的作用浓度优选为20～40μg/ml。
本发明提供所述雷公藤组合物的制备方法，包括如下步骤：采用高效液相分离雷公藤悬浮细胞提取液分析样品和雷公藤悬浮细胞培养液分析样品混合液中的化合物，将得到的所述化合物组合。。
在本发明中，所述雷公藤悬浮细胞提取液分析样品的具体制备方法为：将雷公藤悬浮细胞烘干后，用20mL的乙酸乙酯进行索氏回流提取，提取3次，合并提取液，使用旋转蒸发仪，回收溶剂，残渣蒸干后用1ml的甲醇溶解后，将500ul甲醇溶解液和硅胶粉末3g混合拌样，上样，硅胶填料量为20g。先用200mL石油醚淋洗液淋洗，弃去淋洗液。然后依次用200mL的不同比例的石油醚：乙酸乙酯洗脱液(9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10)进行洗脱，收集10个馏分洗脱液。使用旋转蒸发仪，回收溶剂，残渣蒸干后加1ml的色谱纯甲醇溶解配成100ug/mL的溶液，过0.22μm微孔滤膜，即得悬浮细胞提取液分析样品。。
在本发明中，所述雷公藤培养液分析样品的制备方法为：采用真空抽滤方法分离培养液；将分离后培养液与等体积石油醚充分混合，重复萃取三次，直至石油醚层无颜色；用1/2体积的乙酸乙酯对培养液进行萃取，萃取3次，合并萃取液，使用旋转蒸发仪，回收溶剂，过0.22μm微孔滤膜，即得雷公藤培养液分析样品。
在本发明中，将所述悬浮细胞提取液分析样品和所述雷公藤培养液分析样品合并得混合液，即为本发明组合物分离样品液。
在本发明中，所述高效液相分离的条件优选为：色谱柱为Hypersil ODS2-C18250mm，柱温为室温，吸收波长为230nm，进样量为20μl，流动相为乙腈和超纯水，洗脱条件如表1所示：
表1产物分离HPLC梯度洗脱条件
Figure BDA0003572732240000071
本发明中由表1所示的洗脱条件，分离所述组合物分离样品液后得到的18种化合物种类如下所示：A：1-去乙酰基雷公藤硷乙(1-desacetylwilforgine)；B：(2S)-5,7-二羟基-2′-甲氧基-8-(3-甲基-2-丁烯基)-4′,5′-呋酮-黄烷酮(Tripteryol C)；C：Triptergulide D；D：(3S,5R,6S,7E)-3,5,6-三羟基-7-大柱烯-9-酮((3S,5R,6S,7E)-3,5,6trihydroxy-7-me gastigmen-9-one)；E：1β-E-桂皮酰氧基-4a-羟基-5a,7β,11-三乙酰氧基-8β-烟酰氧基-二氢沉香呋喃(1β-(E-cinnamoyloxy)-4a-hydroxy-5a,7β,11-tria cetoxy-8β-nicotinoyloxy-dihydroagarofuran)；F：Tripterygiumine C；G：雷公藤内酯醇(triptolide)；H：去甲基泽拉木醛(Demethylzeylasteral)；I：Triptobenzene R；J：(3S,4S,5R,10S)-3,19-二羟基-7-氧化松香烷-8,11,13-三烯((3S,4S,5R,10S)-3,19-dihydroxy-7-ox-oabieta-8,11,13-triene)；K：二十三酸(Tricosanoic acid)；L：Wilfordiol B((7R,8S)-8-O-4′-(3′,5′-二甲氧基-1′-羟甲基苯基)-愈创木酚基甘油)；M：(+)-(7R,8S,8′S R)9-苯甲酸基-5-甲氧基-落叶松脂醇((+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-5-me thoxy-lariciresinol)；N：Triptersinine O(1β，5a-二呋喃酰氧基-4a-羟基-7β，11-二乙酰氧基-8β烟酰氧基-二氢沉香呋喃)；O：Triptregeline J(2β-乙酰氧基-1a,9β-二苯甲酰氧基-4β-羟基-6β-(3-烟酰氧基)-β-二氢沉香呋喃)；P：Triptobenzene B；Q：Triptersinine E(1β-Z-桂皮酰氧基-4a-羟基-5a,7β,11-三乙酰氧基-8β-烟酰氧基-二氢沉香呋喃)；R：Triptersinine Z3(5α,11-双乙酸基-1β-反式肉桂酰-4α,7β,8β-三羟基二氢沉香呋喃)。
在本发明中，从所述18种化合物中进一步采用高效液相分离优选化合物。本发明中所述高相液相分离条件优选为：色谱柱为Hypersil ODS2-C18250mm，柱温为室温，吸收波长为230nm，进样量为20μl，流动相为乙腈和超纯水，洗脱条件如表2所示：
表2产物分离HPLC梯度洗脱条件
Figure BDA0003572732240000081
本发明中由表2所示的洗脱条件分离18种化合物得到的优选化合物种类如下所示：A：1-去乙酰基雷公藤硷乙(1-desacetylwilforgine)；B：(2S)-5,7-二羟基-2′-甲氧基-8-(3-甲基-2-丁烯基)-4′,5′-呋酮-黄烷酮(Tripteryol C)；C：Triptergulide D；D：(3S,5R,6S,7E)-3,5,6-三羟基-7-大柱烯-9-酮(3S,5R,6S,7E)-3,5,6trihydroxy-7-megastigmen-9-one；F：Tripterygiumine C；G：雷公藤内酯醇(triptolide)；H：去甲基泽拉木醛(Demethylzeylasteral)；I：Triptobenzene R；M：(+)-(7R,8S,8′SR)9-苯甲酸基-5-甲氧基-落叶松脂醇(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-5-methoxy-l a riciresinol；N：Triptersinine O(1β，5a-二呋喃酰氧基-4a-羟基-7β，11-二乙酰氧基-8β烟酰氧基-二氢沉香呋喃)；P：Triptobenzene B；R：Triptersinine Z3(5α,11-双乙酸基-1β-反式肉桂酰-4α,7β,8β-三羟基二氢沉香呋喃)。
本发明还提供所述雷公藤类组合物在制备抑制耐药癌症药物中的应用。本发明中所述癌症包括肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病中的任意一种或多种；所述药物包括栓剂、片剂、丸剂、颗粒剂、膜剂、微囊剂、滴丸剂、气雾剂、酒剂、糖浆剂、口服液、注射液或注射粉针剂中的任意一种或多种。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1化合物对顺铂耐药细胞A549/DDP的联合抑制效应
1、细胞模型建立
以非小细胞肺癌细胞A549和H1299、人大细胞肺癌细胞H460的顺铂耐药细胞，即为A549/DDP和H1299/DDP和H460/DDP，以及正常人肺支气管上皮细胞16HBE为培养细胞，细胞均用PRMI-1640完全培养基进行培养，培养温度为37℃、CO2浓度为5％，培养到一定的数量，即可建立三种细胞模型。
2、化合物对细胞增殖的抑制率测定
分别取步骤1得到的对数生长期的三种细胞，以5×104个/mL的密度种于96孔板中。每孔加入90μL细胞，设置完全培养基作为空白对照组、DMSO阴性对照、TP阳性对照和加不同浓度化合物的实验组。每组设置3个复孔，于二氧化碳培养箱进行培养24h。分别向每孔加入体积为10ul的药物，使终浓度为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml。培养24h、48h、72h后分别向每孔加入10μl的MTT溶液，孵育4h后将每孔的培养基吸出，加入为100μl的DMSO，放置于酶标仪内震荡5min，使得结晶溶解。在放入酶标仪检测，设置检测波长为OD＝490nm和参比波长OD＝630nm测量每孔的吸光值。
相对细胞存活率或抑制率公式如下：
相对细胞存活率(％)＝((药物实验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值))×100％。
相对细胞抑制率(％)＝(1-相对细胞存活率)×100％。
联合指数(CI)的计算公式如下：
Figure BDA0003572732240000091
公式中(Dx)1、(Dx)2、(Dx)3代表单独使用药物剂量，而(D)1、(D)2、(D)3代表联合用药中各自药物所贡献的抑制率。联合用药软件CompuSyn进行建模评估，判断两药是否有相互协同增效作用，当联合用药指数CI<1时为协同作用；CI>1为拮抗作用；CI＝1时为叠加作用。
IC50的计算方式如下：用SPSS软件计算：进入SPSS数据编辑器后，激活变量表(Variable view)定义变量，在变量名(name)下输入：“剂量/浓度”、“抑制率”、“总值”选择参数Analysis regressionprobit，调出“Probit analysis”对话框，将“剂量/浓度”选入“Covariates”栏中，“抑制率”选入“Response frequency”栏中，“总值”选入“Totalobserved”栏中，在“Transform”栏中，选择“Log base 10”，在‘Mode l’栏中选择“Probit”概率单位模型，在“Options”栏中选择“calculate from Data”，显示各效应概率水平的剂量值，即为IC50值。
3、化合物抑制肿瘤耐药细胞的增殖结果分析
如图1所示，本发明8种化合物表现出了不同的药物效应。其中E、H、I、J、P这五个化合物的抑制细胞增殖活性最强，化合物E的IC50为1.98μg/ml，而化合物I的IC50为1.893μg/ml，与阳性药物雷公藤内酯醇的IC50值(1.97μg/ml)相当；而化合物H、J和P的相对较弱，其IC50值分别为22.31μg/ml、4.32μg/ml、39.20μg/ml。
如图2所示，E、J、P对A549细胞增殖抑制活性作用较为显著，其IC50分别为5.03μg/ml、6.92μg/ml、6.72μg/ml；而化合物I对H1299细胞最为敏感，其IC50为8.61μg/ml。
从图1～图2试验结果中，分析优选E、H、I、J、P这5种化合物，确认其与雷公藤内酯醇存在协同配伍增效的药物效应。选用药物作用最敏感的A549DDP细胞的IC50值为协同剂量，TP为7.83μg/ml，5个活性化合物E、H、I、J、P的IC50分别为2μg/ml、22μg/ml、1.8μg/ml、4μg/ml和40μg/ml。
3、分析5种化合物对A549/DDP细胞联合用药效应
选取TP的IC50值为7.83μg/ml浓度剂量的一半，也就是4μg/ml为其药物浓度，而5个活性化合物E、H、I、J、P的IC50进行减半计算，选取的浓度分别为1μg/ml、11μg/ml、0.9μg/ml、2μg/ml和20μg/ml，联合用药时，TP分别与化合物EH、I、J、P中的任意一种或任意两种均按等体积比配伍。分析结果见图3所示，对于A549/DDP来说，与对照组相比，五种化合物都有显著的增殖抑制活性。其中，化合物I对细胞的抑制效应优于TP，而其余4个化合物与TP抗肿瘤效应相近。与单用TP组相比，两药联合作用后其增殖抑制效果显著提升，与单独用药组相比，其细胞的抑制率分别提升了2.01、1.54、1.81、1.58、1.34倍，表现出了与TP联合用药显著的增效效应。
进一步地应用联合用药软件CompuSyn进行建模评估，判断两药是否有相互协同增效作用，当联合用药指数CI<1时为协同作用；CI>1为拮抗作用；CI＝1时为叠加作用。
对于A549/DDP细胞，如表3与图4所示，5个化合物联合指数范围在0.7206-0.9982之间，根据其联合抗肿瘤活性的药物效应，其强弱效应分别为；化合物H>化合物I>化合物J>化合物E>化合物P，其中化合物J与TP联用用药后，细胞抑制效果最为显著，其抑制率比TP单独用药提高了1.32倍。根据CI值越小其协同作用越强的原则，发现化合物H剂量为22μg/ml、化合物J剂量为2μg/ml时，与5μg/ml的TP联合作用其协同效果最佳。
表3化合物与TP单独和联合作用于A549/DDP细胞的联合指数(CI)(n＝3)
Figure BDA0003572732240000111
Figure BDA0003572732240000121
实施例2五种化合物对顺铂耐药细胞H1229/DDP的联合抑制效应
实验设计和五种化合物，以及对顺铂耐药细胞H1229/DDP的抑制效应的测定方法同实施例1。
从图5可知，与对照组相比，五种化合物对H1299/DDP细胞都有显著的抑制增殖活性，其中化合物P抑制活性要强于TP，其IC50为12.80μg/ml，发现两药联合作用后其增殖抑制效果有了显著提升，与单独用药组相比，其细胞抑制率提高了2.08、3.24、3.19、2.36、2.06倍，表现出了显著与TP联合用药的增效效应。
对于H1299/DDP细胞来说，见表4和图6所示，在TP浓度剂量为2.5μg/ml时，5种化合物联合用药指数由大到小依次为：化合物P>化合物E>化合物I>化合物J>化合物H，对应IC50浓度剂量为12.0μg/ml、0.84μg/ml、0.9μg/ml、1.84μg/ml、8.58μg/ml；当TP浓度剂量为5μg/ml时，除了化合物I药剂量为1.8μg/ml的联合用药指数为1.1503>1，其余化合物的均表现为协同作用，效应强弱依次为化合物E>化合物J>化合物H>化合物P>化合物I，对应IC50剂量为1.0μg/ml、0.9μg/ml、4.0μg/ml、11.0μg/ml、20.0μg/ml。其中，化合物E与化合物H与TP联用用药后其抑制率达到91.13％和83.50％，与TP单独用药相比，其药物效应提升了2.15、2.12倍，表现出了显著的药物协同增效作用。
CI值越小，说明其协同效果好。由以上实验结果发现，在H1299/DDP细胞模型中，选择TP作用浓度为5μg/ml，分别与浓度为1μg/ml化合物E、11μg/ml的化合物H、浓度为4μg/ml的化合物联合用药，对应的CI值均小于0.6，说明该三种药物呈现出良好的协同效应。
表4化合物与TP单独和联合作用H1299/DDP细胞48h后联合指数(CI)(n＝3)
Figure BDA0003572732240000122
Figure BDA0003572732240000131
实施例3五种化合物对顺铂耐药细胞H460/DDP的联合抑制效应
实验设计和五种化合物组合物对顺铂耐药细胞H460/DDP的抑制效应测定方法同实施例1。
从图7可知，与对照组相比，五种化合物对H460/DDP细胞都有显著的抑制增殖活性，其中化合物E、J对细胞的抑制活性要强于TP，其IC50分别为0.58μg/ml、0.61μg/ml，而且发现两药联合作用后其增殖抑制效果显著提升，与单独用药组相比，其对细胞抑制率分别提升了1.23、1.72、1.45、1.33、1.53倍，表现出与TP联合用药的增效效应。
对于H460/DDP细胞来说，如图8与表5所示，根据联合用药指数大小，在TP给药剂量为2.5μg/ml时，5种化合物联合用药指数由大到小依次为：化合物I>化合物E>化合物H>化合物J>化合物P，其与TP联用药后抑制率分别为：91.82％、94.05％、99.56％、86.80％，与TP单独用药相比提高了1.52、1.56、1.65、1.44倍，协同效果显著，其抗肿瘤活性明显提高。
化合物J与化合物P与TP联合用药后，作用于H460/DDP细胞，其CI值均小于0.35，通过建模发现，化合物P浓度在剂量为40μg/ml时与TP联合用药CI值达到0.1961，据此说明该浓度剂量下与TP联用协同作用较为突出。
表5化合物与TP单独和联合作用H460/DDP细胞48h后联合指数(CI)(n＝3)
Figure BDA0003572732240000132
Figure BDA0003572732240000141
实施例4各种组合物对正常16HBE的减毒效应
实验设计和五种化合物组合物对顺铂耐药细胞H460/DDP的抑制效应测定方法同实施例1。
从图9可知，与对照组相比，TP与五种化合物分别联合联合后，其相对细胞存活率分别为75.09％、79.44％、78.83％、78.86％、73.69％，与TP单用相比，其对细胞的毒性分别减低了1.16、1.24、1.21、1.22和1.14倍，这在一定程度上降低了TP单用对正常细胞的毒性，安全性有所提升，联合用药后也表现出一定的配伍减毒效应。
综合实施例1～4测定分析结果可知，对于A549/DDP细胞，优选化合物H剂量为22μg/ml、化合物J剂量为2μg/ml时，与5μg/ml的雷公藤内酯醇，以1:1:1体积比组成组合物为最优组合；对于H1299/DDP细胞，雷公藤内酯醇为5μg/ml，分别与浓度为1μg/ml化合物E、11μg/ml的化合物H、浓度为4μg/ml的J化合物，以1:1:1体积比组成组合物为最优组合；对于H460/DDP细胞，化合物P浓度剂量为40μg/ml时与5μg/ml雷公藤内酯醇，以1:1体积比组成组合物为最优组合。最终选择TP/H/J、TP/E/H、TP/P中的任意一种作为配伍组合物。
实施例5三种配伍组合物对不同肿瘤耐药细胞的抑制作用
分别选用SGC7901/DDP MXC336人胃癌顺铂耐药株、HL-60/FU人白血病氟尿嘧啶耐药株、PANC-1/GEM人胰腺癌细胞吉西他滨耐药株和MCF7/LMXC804人乳腺癌耐奥沙利铂细胞株为细胞模型，药物选用三种组合物TP/H/J、TP/E/H药物配比剂量分别为1:1:1～4:4:4，TP/P药物配比剂量为1:1～4:4，实验方法和计算方法按照实施例1进行，计算各组的IC50见表6所示，通过比较看到，各组合物对四种耐药细胞都有很好的抑制作用，其中对人胃癌顺铂耐药细胞较为敏感，药物的抑制作用最强，而TP/H/J、TP/E/H药物最佳配伍体积比均为1:1:1，TP/P药物最佳配伍体积比为1:1，上述限定三种组合物以及用量比例的配伍药物效应最强，最有效，
表6三种组合物对不同耐药细胞的抑制作用
Figure BDA0003572732240000151
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抑制耐药癌症的雷公藤类组合物，其特征在于，包括如下化合物中的任意两种或两种以上：
A：1-去乙酰基雷公藤硷乙；
B：(2S)-5,7-二羟基-2′-甲氧基-8-(3-甲基-2-丁烯基)-4′,5′-呋酮-黄烷酮；
C：Triptergulide D；
D：(3S,5R,6S,7E)-3,5,6-三羟基-7-大柱烯-9-酮；
E：1β-E-桂皮酰氧基-4a-羟基-5a,7β,11-三乙酰氧基-8β-烟酰氧基-二氢沉香呋喃；
F：Tripterygiumine C；
G：雷公藤内酯醇；
H：去甲基泽拉木醛；
I：Triptobenzene R；
J：(3S,4S,5R,10S)-3,19-二羟基-7-氧化松香烷-8,11,13-三烯；
K：二十三酸；
L：Wilfordiol B；
M：(+)-(7R,8S,8′S R)9-苯甲酸基-5-甲氧基-落叶松脂醇；
N：Triptersinine O；
O：Triptregeline J；
P：Triptobenzene B；
Q：Triptersinine E；
R：Triptersinine Z3。
2.如权利要求1所述的雷公藤类组合物，其特征在于，所述组合物为G和其他化合物的组合物，所述其他化合物为E、H、I、J、P中的任意一种或多种。
3.如权利要求2所述的雷公藤类组合物，其特征在于，所述G和一种化合物组合时，G和另外一种化合物的体积比为1:4～4:3。
4.如权利要求2所述的雷公藤类组合物，其特征在于，所述G和一种化合物组合时，G和另外两种化合物的体积比为1:1:1～4:3:4。
5.如权利要求1～4任意一项所述的雷公藤类组合物，其特征在于，所述G或E或I或J的作用浓度分别为0.5～7μg/ml。
6.如权利要求1～4任意一项所述的雷公藤类组合物，其特征在于，所述H或P的作用浓度分别为10～45μg/ml。
7.如权利要求1～6任意一项所述的雷公藤组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：采用高效液相分离雷公藤悬浮细胞提取液分析样品和雷公藤悬浮细胞培养液分析样品混合液中的化合物，将得到的所述化合物组合。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述高效液相分离的条件为：色谱柱为Hypersil ODS2-C18 250 mm，柱温为室温，吸收波长为210nm、219nm、230nm，进样量为20μl，流动相为乙腈和超纯水，洗脱条件为：
Figure FDA0003572732230000021
9.如权利要求1～6任意一项所述的组合物在制备抑制耐药癌症药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症包括肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病中任意一种或多种。
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