CN114793904B - 一种小麦花药的诱导培养基和培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦花药的诱导培养基和培养方法，涉及植物组织培养领域。该诱导培养基包括：无水氯化钙、硝酸钾、七水硫酸镁、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、五水硫酸铜、六水氯化钴、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸钠、甘氨酸、VB1、VB6、烟酸、生物素、亮氨酸、2，4‑D、KT、水解乳蛋白、麦芽糖、琼脂、PAA、谷胱甘肽、阿拉伯半乳糖和PSK。本发明提供的小麦花药的诱导培养基可以克服基因型限制，提高愈伤组织的诱导率和绿苗率。

Description

一种小麦花药的诱导培养基和培养方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，特别是涉及一种小麦花药的诱导培养基和培养方法。

背景技术

新品种选育是持续提高小麦单产最经济有效的途径。近100年来，常规杂交育种一直是最主要的小麦育种方法，然而该方法存在育种周期长、育种效率较低(约为百万分之一)的缺点。单倍体育种作为一种快速高效的育种方法，可以缩短育种时间提高选择效率，其产生的加倍单倍体(DH)植株也是进行遗传转化和进行构建分子标记群体的良好材料。花药培养技术是小麦单倍体育种技术中最成熟的技术之一。我国自20世纪70年代开始进行花药培养研究，目前已成功实现了单倍体育种与常规杂交育种以及远缘杂交育种、转基因技术相结合，并逐步发展成一套较为完善的育种技术体系。但目前的花药培养技术仍然存在基因型限制、诱导率低、群体小、白化苗多的问题，不能满足小麦育种的实际需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦花药的诱导培养基和培养方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的小麦花药的诱导培养基可以克服基因型限制，提高愈伤组织的诱导率和分化率，降低白化苗率。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种小麦花药的诱导培养培养基，每1000mL所述诱导培养基包括：无水氯化钙150mg、硝酸钾1400mg、七水硫酸镁150mg、硝酸铵300mg、磷酸二氢钾400mg、硫酸锰8.5mg、硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.83mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg、硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg、甘氨酸1mg、VB10.5mg、VB60.25mg、烟酸0.25mg、生物素1mg、亮氨酸1mg、2，4-D 2mg、KT 0.5mg、水解乳蛋白500mg、麦芽糖90g、琼脂3.7g、PAA 1mg、谷胱甘肽1mg、阿拉伯半乳糖10mg和PSK 0.085mg。

本发明还提供一种小麦花药的培养方法，包括以下步骤：

(1)将处于单核中-晚期的小麦幼穗，经CuSO₄溶液浸泡处理，得到浸泡后的幼穗；

(2)从浸泡后的幼穗中剥出花药，之后接种上述的诱导培养基中，诱导培养出花药愈伤组织；

(3)所述花药愈伤组织接种于分化培养基，分化培养得到再生苗；

(4)所述再生苗接种于生根培养基，生根培养得到小麦的再生植株。

进一步地，在步骤(2)中，所述诱导培养的条件为：在27℃±1温度下暗培养20-50天。

进一步地，在步骤(3)中，所述分化培养的条件为：在25℃温度下，每天光照12-14小时。

进一步地，在步骤(2)中，所述生根培养的条件为：在25℃温度下，每天光照12-14小时。

进一步地，步骤(1)的具体操作包括：将处于单核中-晚期的小麦幼穗，放入浓度为500mg/L的CuSO₄溶液中4℃浸泡2天。

进一步地，所述培养方法还包括：将所述再生植株进行春化处理后，再在进行壮苗，最后经染色体加倍后移栽至大田。

进一步地，将壮苗后的再生植株的分蘖节在0.75-1％的秋水仙碱与1.5％二甲基亚砜混合液中浸泡4-5小时，浸泡温度为25℃。

本发明公开了以下技术效果：

我们搜集国内主要遗传育种材料进行小麦花药培养基因型筛选，改良预处理条件、进一步改进和优化培养基，其目的是提高愈伤组织的诱导率和绿苗的分化率。其中，培养基是花药培养的物质基础，直接关系到培养物的生长和分化。培养基各成分的合适用量，以及它们之间的组合关系，可导致花培效率的大幅度提高。因此，继续筛选和优化基本培养基，提高培养基选用的针对性，是提高小麦花药培养效率的有效举措。

在多年的小麦花药培养的摸索和实践中，我们尝试在培养基中加入具有提高生物抗氧化功能、促进生长、提高生物对不良环境影响抵抗功能的谷胱甘肽；一种新型的植物肽类生长调节物质-植物磺肽素(PSK)，它可以促进细胞的生长和增殖；通过影响植物细胞的胚性状态而影响植物的体细胞胚胎发生的阿拉伯半乳糖(AGPs)。这些物质具有抗氧化和促进小麦花药向胚性愈伤组织转化的功能，从而进一步影响植株离体再生。我们通过调节这几种激素之间的合适用量，最终摸索出了一种能够克服基因型限制，提高愈伤组织诱导率和分化率的诱导培养基配方，并对小麦花药培养条件进一步优化，形成了一套高效的小麦花药培养方法，将该方法与常规育种、远缘杂交等技术相结合，最终实现小麦双单倍体产业化、规模化和商业化，为小麦育种提供更好的技术支撑。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为小麦幼穗预处理图；

图2为实施例1中不同基因型小麦花药进行诱导培养，其中，A为济麦22，B为冀麦325；

图3为实施例2中济麦22的花药愈伤组织分化培养；

图4为实施例2中济麦22的再生苗的生根培养。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

分别对济麦22和冀麦325两种基因型的小麦花药进行诱导培养，分别得到济麦22和冀麦325的花药愈伤组织。

诱导培养的方法如下：

(1)4月下旬的清晨6点至8点取样，取材后镜检，选取单核中-晚期的小麦幼穗放入浓度为500mg/L的CuSO₄水溶液中4℃处理2天，处理过程的图片见图1。

(2)配制诱导培养基，配制方法如下：无水氯化钙150mg、硝酸钾1400mg、七水硫酸镁150mg、硝酸铵300mg、磷酸二氢钾400mg、硫酸锰8.5mg、硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.83mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg、硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg、甘氨酸1mg、VB10.5mg、VB60.25mg、烟酸0.25mg、生物素1mg、亮氨酸1mg、2，4-D2mg、KT(激动素)0.5mg、水解乳蛋白500mg和麦芽糖90g，加水定容至1000mL，调节pH至5.8，再加入琼脂3.7g，之后采用121℃高压灭菌20分钟，待灭菌后的培养基温度降至65℃左右时加入过滤灭菌后的PAA(苯乙酸)1mg/L、谷胱甘肽1mg/L、阿拉伯半乳糖10mg/L、PSK(植物磺化激动素)0.085mg/L。

(3)将经过预处理的小麦幼穗放入超净工作台，用2％次氯酸钠溶液浸泡15min，然后用无菌水冲洗3次；

(4)在超净台上将花药从幼穗中剥出后接种于配制好的诱导培养基中。

(5)将接种好花药的培养皿用封口膜密封好放入27℃±1条件下的培养室进行暗培养，培养时间为50天，培养过程图片见图2。

对比例1

同实施例1，区别在于，步骤(2)的诱导培养基中不添加谷胱甘肽、阿拉伯半乳糖和PSK。

本发明选用了两种不同基因型的小麦花药进行培养，其中济麦22为不易诱导愈伤的顽固基因型，冀麦325为易诱导愈伤的基因型。实施例1和对比例1的诱导率统计结果如表1。

表1实施例1与对比例1对小麦花药愈伤组织诱导率的比较

由表1可以发现，实施例1的小麦花药愈伤诱导率与对比例1的小麦花药愈伤诱导率存在显著性差异，实施例1的诱导培养基对济麦22(不易诱导愈伤的顽固基因型)的诱导率达到了9.4％，对冀麦325(易诱导愈伤的基因型)的诱导率也有了显著提高，因此能够说明本发明的诱导培养基能够克服基因型的限制，显著提高诱导率。我们将采用本发明诱导培养出的花药愈伤组织，进一步分化培养成生长旺盛的花培幼苗。

实施例2

分别对实施例1得到的济麦22和冀麦325的花药愈伤组织进行分化、生根培养，方法如下：

(1)将生长到1-2mm的花药愈伤组织接种于分化培养基上，进行分化培养(培养过程图片见图3)，培养条件为：在25℃条件下的培养室中，每天光照12小时(12-14可达相同效果)进行分化培养。

分化培养基配制方法如下：硝酸钾1900mg、硝酸铵1650mg、磷酸二氢钾170mg、无水氯化钙440mg、七水硫酸镁370mg、碘化钾0.83mg、四水硫酸锰22.3mg、硼酸6.2mg、七水硫酸锌8.6mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、二水钼酸钠0.25mg、硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg、甘氨酸2mg、VB10.4mg、VB60.5mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg、维生素C100mg、KT 1.0mg、NAA0.5mg、水解乳蛋白500mg和蔗糖30g，加水定容至1000mL，调节pH至5.8，再加入植物凝胶(Phytagel)2.7g/L，121℃高压灭菌20分钟。

(2)将步骤(1)分化得到的再生苗长到2-4cm时进行生根培养(培养过程图片见图4)，得到小麦的再生植株；培养条件为：在25℃条件下每天光照12小时(12-14可达相同效果)进行生根培养。

生根培养基配制方法如下：硝酸钾1900mg、硝酸铵1650mg、磷酸二氢钾170mg、无水氯化钙440mg、七水硫酸镁370mg、碘化钾0.83mg、四水硫酸锰22.3mg、硼酸6.2mg、七水硫酸锌8.6mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、二水钼酸钠0.25mg、硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg、甘氨酸2mg、VB10.4mg、VB60.5mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg、维生素C100mg、KT 0.5mg、NAA0.5mg、多效唑3.0mg、水解乳蛋白500mg和蔗糖30g，加水定容至1000mL，调节pH至5.8，再加入植物凝胶(Phytagel)2.7g/L，121℃高压灭菌20分钟。

(3)将再生植株的不定根长到2-4cm时，将再生植株放入2-4℃冰箱中进行春化处理30天；

(4)将春化后的再生植株拿到室外进行壮苗锻炼15天；

(5)将壮苗后的再生植株染色体加倍后移栽至大田，得到大田苗；

染色体加倍方法为：将壮苗后的再生植株放入0.75wt％(最高可达1wt％)的秋水仙碱与1.5wt％二甲基亚砜的混合液中，在25℃条件下浸泡分蘖节4-5小时得到加倍纯合个体。

对比例2

同实施例2，区别在于，诱导培养基中不添加谷胱甘肽、阿拉伯半乳糖和PSK。(进一步说明本发明的诱导培养基除了具有提高愈伤组织诱导率的作用外还能提高绿苗分化率。)

实施例2和对比例2分别对济麦22和冀麦325诱导的花药愈伤组织进行了分化、生根培养，对其绿苗分化率进行比较，结果如表2。

表2实施例2与对比例2对绿苗分化率的比较

由表2可以发现，实施例2的培养基与对比例2的培养基在绿苗分化率上存在显著性差异，利用对比例2的培养基诱导的济麦22愈伤组织不具有分化再生能力，实施例2的培养基诱导的济麦22愈伤组织分化出了7株再生苗；实施例2的培养基在冀麦325的绿苗率上较对比例2的培养基也有了显著提高，因此能够说明本发明的诱导培养基能够克服基因型的限制，显著提高绿苗分化率。

实验例1

为说明本发明小麦花药诱导方法中所采用的500mg/L CuSO₄4℃低温预处理小麦幼穗对花药愈伤组织诱导率的影响，我们设置了不同预处理时间对济麦22和冀麦325两种基因型的小麦品种进行研究，结果如表3。

表3500mg/L CuSO₄4℃低温预处理时间对花药愈伤组织诱导率的影响

由表3结果发现，对500mg/L CuSO₄4℃低温预处理不同的时间，两个品种得到了一致的结果。对于幼穗不进行低温预处理直接诱导培养(即低温处理0天)的诱导率最低，低温处理48h的小麦愈伤诱导率最高分别为8.0％和34.2％。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种小麦花药诱导培养基在提高小麦花药愈伤组织诱导率中的应用，其特征在于，所述诱导培养基的配制方法包括：无水氯化钙150mg、硝酸钾1400mg、七水硫酸镁150mg、硝酸铵300mg、磷酸二氢钾400mg、硫酸锰8.5mg、硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.83mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg、硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg、甘氨酸1mg、VB1 0.5mg、VB6 0.25mg、烟酸0.25mg、生物素1mg、亮氨酸1mg、2，4-D 2mg、激动素0.5mg、水解乳蛋白500mg和麦芽糖90g，加水定容至1000mL，调节pH至5.8，再加入琼脂3.7g，灭菌后再加入苯乙酸1mg/L、谷胱甘肽1mg/L、阿拉伯半乳糖10mg/L和植物磺化激动素0.085mg/L，即得所述诱导培养基；

所述小麦为济麦22。

2.一种小麦花药的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将处于单核中-晚期的小麦幼穗，经CuSO₄溶液浸泡处理，得到浸泡后的幼穗；

（2）从浸泡后的幼穗中剥出花药，之后接种于诱导培养基中，诱导培养出花药愈伤组织；

（3）所述花药愈伤组织接种于分化培养基，分化培养得到再生苗；

（4）所述再生苗接种于生根培养基，生根培养得到小麦的再生植株；

步骤（1）的具体操作包括：将处于单核中-晚期的小麦幼穗，放入浓度为500mg/L的CuSO₄溶液中4℃浸泡2天；

所述诱导培养基的配制方法包括：无水氯化钙150mg、硝酸钾1400mg、七水硫酸镁150mg、硝酸铵300mg、磷酸二氢钾400mg、硫酸锰8.5mg、硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、碘化钾0.83mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg、硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg、甘氨酸1mg、VB1 0.5mg、VB6 0.25mg、烟酸0.25mg、生物素1mg、亮氨酸1mg、2，4-D2mg、激动素0.5mg、水解乳蛋白500mg和麦芽糖90g，加水定容至1000mL，调节pH至5.8，再加入琼脂3.7g，灭菌后再加入苯乙酸1mg/L、谷胱甘肽1mg/L、阿拉伯半乳糖10mg/L和植物磺化激动素0.085mg/L，即得所述诱导培养基；

所述分化培养基的配制方法包括：硝酸钾1900mg、硝酸铵1650mg、磷酸二氢钾170mg、无水氯化钙440mg、七水硫酸镁370mg、碘化钾0.83mg、四水硫酸锰22.3mg、硼酸6.2mg、七水硫酸锌8.6mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、二水钼酸钠0.25mg、硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg、甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg、维生素C 100mg、激动素1.0mg、NAA 0.5mg、水解乳蛋白500mg和蔗糖30g，加水定容至1000mL，调节pH至5.8，再加入植物凝胶2.7g/L，灭菌后得到所述分化培养基；

所述生根培养基的配制方法包括：硝酸钾1900mg、硝酸铵1650mg、磷酸二氢钾170mg、无水氯化钙440mg、七水硫酸镁370mg、碘化钾0.83mg、四水硫酸锰22.3mg、硼酸6.2mg、七水硫酸锌8.6mg、六水氯化钴0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、二水钼酸钠0.25mg、硫酸亚铁27.85mg、乙二胺四乙酸钠37.25mg、甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、烟酸0.5mg、肌醇100mg、维生素C 100mg、激动素0.5mg、NAA 0.5mg、多效唑3.0mg、水解乳蛋白500mg和蔗糖30g，加水定容至1000mL，调节pH至5.8，再加入植物凝胶2.7g/L，灭菌后得到所述生根培养基；

所述小麦为济麦22。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述诱导培养的条件为：在27℃±1温度下暗培养20-50天。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述分化培养的条件为：在25℃温度下，每天光照12-14小时。

5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述生根培养的条件为：在25℃温度下，每天光照12-14小时。

6.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法还包括：将所述再生植株进行春化处理后，再进行壮苗，最后经染色体加倍后移栽至大田。

7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述染色体加倍的方法包括：将壮苗后的再生植株的分蘖节在0.75-1％的秋水仙碱与1.5％二甲基亚砜混合液中浸泡4-5小时，浸泡温度为25℃。

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