CN115005102B - 一种苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，包括以下步骤：S1、将外植体接种到愈伤组织诱导培养基中，在25±2℃下黑暗或弱光培养，得到诱导培养的愈伤组织；S2、将愈伤组织接种到不定芽诱导培养基中，在25±2℃下光照培养，得到诱导出不定芽的苜蓿组织；S3、将苜蓿组织接种到壮苗培养基中，在25±2℃下光照培养，得到再生苗；S4、将再生苗转接至生根培养基中，在25±2℃下光照培养，得到诱导生根的无菌苗。本发明优化了苜蓿胚性愈伤组织诱导和再生苗壮苗培养基配方，使构建的苜蓿再生体系高效稳定，综合性能优越，不定芽的增殖会随着继代时间延长而增加，重复性较好。
Description
技术领域
本发明涉及苜蓿组织培养技术领域，具体涉及一种苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法。
背景技术
苜蓿(Medicago sativa L.)中含有丰富的碳水化合物、粗蛋白、维生素以及其他微量元素，因此，人们常将苜蓿作为一种重要的饲料作物用于动物饲养。同时，由于苜蓿芽富含膳食纤维，且糖分和热量较低，也被人们作为高纤维低热量的食物食用。但是由于苜蓿系同源四倍体以及具有自交不亲和性和人工杂交授粉困难等特点，在很大程度上限制了高品质、高抗逆性、高抗病性等苜蓿品种的获得，也使得苜蓿的种质资源受到限制。
近年来，人们采用植物组织培养技术对苜蓿进行品种改良、新品种繁殖、遗传转化、种质保存和抗性突变体的筛选等方面的研究。尽管已有许多苜蓿再生体系建立成功的案例，但是不同苜蓿基因型间再生体系建立难易存在差异。同时，诱导的丛生芽培养仍然存在很多问题。
我们对苜蓿近十五年来有关组织培养研究文献总结分析，发现进行苜蓿再生体系建立的主要外植体包括胚轴、子叶、叶片、子叶节、叶柄等，且外植体胚性愈伤组织诱导的最佳激素为2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸，1.0-2.0mg/L)、NAA(萘乙酸，0.05-1.0mg/L)、KT(激动素，0.2-2.0mg/L)和6-BA(6-苄氨基腺嘌呤，0.5-2.0mg/L)；丛生芽诱导的最佳激素为KT(0.4-3.0mg/L)、6-BA(0.2-2.0mg/L)和NAA(0.01-0.5mg/L)。但是现有的苜蓿组织培养方法仍然存在再生苗生长慢、再生苗玻璃化现象严重等问题。另外，我们根据已公布的国内外研究结果，将其配方应用到苜蓿品种中进行重复实验，发现重复性效果并不理想，且存在不定芽诱导率较低的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下。
一种苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，包括以下步骤：
S1、将外植体接种到愈伤组织诱导培养基中，在25±2℃下黑暗或弱光培养，得到诱导培养的愈伤组织；每升所述愈伤组织诱导培养基为：2,4-D 4～4.5mg、6-BA 0.2～0.4mg、NAA 0.2～0.4mg，其余为MS培养基；
S2、将S1得到的诱导培养的愈伤组织接种到不定芽诱导培养基中，在25±2℃下光照培养，得到诱导出不定芽的苜蓿组织；每升所述不定芽诱导培养基为：蔗糖38～42g，其余为MS培养基；
S3、将S2得到的诱导出不定芽的苜蓿组织接种到壮苗培养基中，在25±2℃下光照培养，得到再生苗；每升所述壮苗培养基为：NAA 0.7～0.9mg、6-BA 0.2mg、水解酪蛋白580～600mg、糖26～30g，其余为MS培养基；
S4、将S3得到的再生苗转接至生根培养基中，在25±2℃下光照培养，得到诱导生根的无菌苗；每升所述生根培养基为：NAA 0.5～0.7mg，其余为1/2MS培养基。
本发明中，S1的黑暗或弱光培养，弱光培养方式也可以诱导苜蓿叶片胚性愈伤组织的形成。
进一步，S1中，所述外植体为叶片切段；所述叶片切段是将预培养的无菌苗的叶片从叶片顶部以下1/3处切开得到。
进一步，S1中，所述黑暗或弱光培养的时间为60～90天；所述弱光培养的光照度<500lux。
进一步，S2～S4中，所述光照培养的时间为30～60天，每天光照16h，暗培养8h；所述光照培养的光照度2000lux。
进一步，S3中，所述再生苗为茎高2～4cm的再生苗。
进一步，S4中，当无菌苗诱导生根的根长为1.2～2cm时，将无菌苗移栽至营养基质中。
进一步，S1中，每升所述愈伤组织诱导培养基为：2,4-D 4mg、6-BA 0.4mg、NAA0.2mg，其余为MS培养基。
进一步，S2中，每升所述不定芽诱导培养基为：蔗糖40g，其余为MS培养基。
进一步，S3中，每升所述壮苗培养基为：NAA 0.9mg、6-BA 0.2mg、水解酪蛋白600mg、糖30g，其余为MS培养基；
进一步，S4中，每升所述生根培养基为：NAA 0.5mg，其余为1/2MS培养基。
本发明的有益效果：
1、本发明根据现有技术的方法做了重复性试验，发现前人报道有关6-BA和2.4-D、NAA组合配方，在本发明的苜蓿品种中不定芽诱导率较低。本发明经研究发现在含有不同浓度2,4-D配方中，均能诱导出愈伤组织，但是本发明的配方MS+4mg/L 2,4-D+0.4mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，在黑暗或者弱光(光照度<500lux)的培养条件下诱导出的胚性愈伤组织率最高，将其接种到不定芽诱导培养基MS+40g/L蔗糖中，“探戈”苜蓿叶片不定芽诱导率为58％左右。
2、本发明的方法诱导出的不定芽，芽较小，且增殖系数低，一般不定芽数随着培养天数的增加而不断增多，培养60天，每个愈伤出芽数均大于10。通过壮苗培养，可使50％的再生苗，株高伸长、叶片正常。壮苗配方MS+0.9mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+600mg/L水解酪蛋白+糖30g/L。
3、本发明的生根培养基的组分为1/2MS+0.5mg/L NAA，培养30天，生根率为79.17％以上，且生出的根系较细。
4、本发明选出基因型“探戈”苜蓿叶片作为外植体得到苜蓿不定芽，优化了苜蓿胚性愈伤组织诱导和再生苗壮苗培养基配方，使构建的苜蓿再生体系高效稳定，综合性能优越，不定芽的增殖会随着继代时间延长而增加，重复性较好，为苜蓿遗传转化及育种提供了新技术和方法。
附图说明
图1是本发明实施例中苜蓿叶片分离图。
图2是本发明实施例中叶片不定芽诱导图；其中，A是愈伤组织，B是诱导出不定芽。
图3是本发明实施例中叶片不定芽诱导和再生玻璃化苗图；其中，A是丛生芽，B是玻璃化苗。
图4本发明是实施例中苜蓿再生苗生根诱导图；其中，A是状苗，B是生根。
图5是本发明实施例中苜蓿再生苗驯化移栽图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的实施例中，选用基因型“探戈”苜蓿种子进行再生苗预培养，并以预培养的再生苗叶片作为外植体进行苜蓿再生体系的研究。
每1L MS培养基为：硝酸铵(NH4NO3)1.65g、硝酸钾(KNO3)1.9g、氯化钙(CaCl2·2H2O)0.44g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.37g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.17g、碘化钾(KI)0.83mg、硼酸(H3BO3)6.2mg、硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg、氯化钴(CoCl2)0.025mg、硫酸铁(FeSO4·7H2O)27.8mg、乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)37.3mg、肌醇100mg、甘氨酸2mg、盐酸硫胺素(VB1)0.4mg、盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg、烟酸0.5mg、蔗糖30g、琼脂7g。
下述各实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
实施例1
一种苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，包括以下步骤：
S1、苜蓿种子的预处理
选取成熟的“探戈”苜蓿种子用水冲洗30min；然后冲洗后的苜蓿种子用质量分数为75％的乙醇溶液浸泡30s；再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液消毒8min，用无菌水冲洗4次，每次3min；
将灭菌处理后的苜蓿种子接种到MS培养基中，在25±2℃下培养14天，得到株高为3.6cm带有8片真叶的无菌苗；
S2、愈伤组织培养
将培养14天后的无菌苗的叶片从叶片顶部以下1/3处切开得到外植体，然后将外植体接种到愈伤组织诱导培养基上(如图1A和图1B)，在25±2℃，黑暗或者弱光(光照度<500lux)条件下培养84天，愈伤组织诱导率为100％，少许愈伤上出现芽点(如图2A和图2B)；
其中，每升所述愈伤组织诱导培养基为：2,4-D 4mg、6-BA 0.4mg、NAA 0.2mg，其余为MS培养基；
S3、不定芽诱导
将S2培养得到的材料转接种于不定芽诱导培养基上，在25±2℃，光照度2000lux(白色日光灯)条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养50天，诱导出不定芽，并随着培养时间的延长不定芽数目逐渐增多(图3A和图3B)；其中，每升所述不定芽诱导培养基为：蔗糖40g，其余为MS培养基；
S4、壮苗培养
将S3得到的培养材料转接到壮苗培养基中培养；在25±2℃、光照度2000lux条件下，每天光照16h，暗培养8h，培养50天(如图4A)；其中，每升所述壮苗培养基为：NAA 0.9mg、6-BA 0.2mg、水解酪蛋白600mg、糖30g，其余为MS培养基；
S5、生根培养
将S4得到的茎高3cm的再生苗转接至生根培养基上诱导生根；在25±2℃、光照度2000lux条件下，每天光照16h，暗培养8h，培养30天(图4B)；其中，每升所述生根培养基为：NAA 0.5mg，其余为1/2MS培养基。
S6、移栽
待苜蓿再生苗诱导的根长长到1.8cm时，冲洗再生苗根系后，移栽至营养钵中，并覆盖塑料薄膜，放置培养室中培养。具体在25±2℃，光照度4000lux条件下光照培养，将营养钵放置培养室中培养，一周之内确保基质湿溶(每隔3天补50ml水)；1周后，即可去除覆盖材料(如图5)。
实施例2
一种苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，包括以下步骤：
S1、苜蓿种子的预处理
选取成熟的“探戈”苜蓿种子用水冲洗30min；然后冲洗后的苜蓿种子用质量分数为75％的乙醇溶液浸泡30s；再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液消毒8min，用无菌水冲洗4次，每次3min；
将灭菌处理后的苜蓿种子接种到MS培养基中，在25±2℃下培养14天，得到株高为3cm带有6片真叶的无菌苗；
S2、愈伤组织培养
将培养14天后的无菌苗的叶片从叶片顶部以下1/3处切开得到外植体，然后将外植体接种到愈伤组织诱导培养基上，在25±2℃，黑暗或者弱光(光照度<500lux)条件下培养60天，愈伤组织诱导率为100％，少许愈伤上出现芽点；
其中，每升所述愈伤组织诱导培养基为：2,4-D 4.3mg、6-BA 0.3mg、NAA0.3mg，其余为MS培养基；
S3、不定芽诱导
将S2培养得到的材料转接种于不定芽诱导培养基上，在25±2℃，光照度2000lux(白色日光灯)条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养30天，诱导出不定芽，并随着培养时间的延长不定芽数目逐渐增多；其中，每升所述不定芽诱导培养基为：蔗糖38g，其余为MS培养基；
S4、壮苗培养
将S3得到的培养材料转接到壮苗培养基中培养，在25±2℃、光照度2000lux条件下，每天光照16h，暗培养8h，培养50天；其中，每升所述壮苗培养基为：NAA 0.7mg、6-BA0.2mg、水解酪蛋白580mg、糖26g，其余为MS培养基；
S5、生根培养
将S4得到的茎高2cm的再生苗转接至生根培养基上诱导生根；在25±2℃、光照度2000lux条件下，每天光照16h，暗培养8h，培养30天。其中，每升所述生根培养基为：NAA0.7mg，其余为1/2MS培养基。
S6、移栽
待苜蓿再生苗诱导的根长长到1.2cm时，冲洗再生苗根系后，移栽至营养钵中，并覆盖塑料薄膜，放置培养室中培养。具体在25±2℃，光照度4000lux条件下光照培养，将营养钵放置培养室中培养，一周之内确保基质湿溶(每隔3天补50ml水)；1周后，即可去除覆盖材料。
实施例3
一种苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，包括以下步骤：
S1、苜蓿种子的预处理
选取成熟的“探戈”苜蓿种子用水冲洗30min；然后冲洗后的苜蓿种子用质量分数为75％的乙醇溶液浸泡30s；再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液消毒8min，用无菌水冲洗4次，每次3min；
将灭菌处理后的苜蓿种子接种到MS培养基中，在25±2℃下培养14天，得到株高为4cm带有9片真叶的无菌苗；
S2、愈伤组织培养
将培养14天后的无菌苗的叶片从叶片顶部以下1/3处切开得到外植体，然后将外植体接种到愈伤组织诱导培养基上，在25±2℃，黑暗或者弱光(光照度<500lux)条件下培养90天，愈伤组织诱导率为100％，少许愈伤上出现芽点；
其中，每升所述愈伤组织诱导培养基为：2,4-D 4.5mg、6-BA 0.4mg、NAA 0.4mg，其余为MS培养基；
S3、不定芽诱导
将S2培养得到的材料转接种于不定芽诱导培养基上，在25±2℃，光照度2000lux(白色日光灯)条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养60天，诱导出不定芽，并随着培养时间的延长不定芽数目逐渐增多；其中，每升所述不定芽诱导培养基为：蔗糖42g，其余为MS培养基；
S4、壮苗培养
将S3得到的培养材料转接到壮苗培养基中培养，在25±2℃、光照度2000lux条件下，每天光照16h，暗培养8h，培养50天；其中，每升所述壮苗培养基为：NAA 0.8mg、6-BA0.2mg、水解酪蛋白590mg、糖29g，其余为MS培养基；
S5、生根培养
将S4得到的茎高2-4cm的再生苗转接至生根培养基上诱导生根；在25±2℃、光照度2000lux条件下，每天光照16h，暗培养8h，培养30天；其中，每升所述生根培养基为：NAA0.6mg，其余为1/2MS培养基。
S6、移栽
待苜蓿再生苗诱导的根长长到2.0cm时，冲洗再生苗根系后，移栽至营养钵中，并覆盖塑料薄膜，放置培养室中培养。具体在25±2℃，光照度4000lux条件下光照培养，将营养钵放置培养室中培养，一周之内确保基质湿溶(每隔3天补50ml水)；1周后，即可去除覆盖材料。
本发明实施例1～3的方法基本相同，因此，下面仅以实施例1的方法进行条件筛选试验。
一、愈伤组织诱导培养基的筛选
根据实施例1的方法，对愈伤组织诱导培养基中不同浓度激素配比进行筛选试验。
暗培养：在25℃±2下，培养60天，统计愈伤组织诱导率，然后将各愈伤组织转接到不定芽诱导培养基中，光照度为2000lux；在25℃±2下，每天光照16h、暗培养8h，培养40天，统计丛生芽诱导率，结果见表1。
表1不同浓度激素配比对苜蓿叶片再生体系建立的影响
由表1可知，各培养基中愈伤组织诱导率均为100％，将各配方获得愈伤组织分别转接到不定芽诱导配方中，苜蓿叶片不定芽诱导率的极差R值大小顺序为6-BA>2,4-D>NAA；其最优水平为6-BA(0.4mg/L)，2，4-D(4.0mg/L)，NAA(0.2mg/L)，丛生芽诱导率最高为58％。
二、壮苗培养基的筛选
根据实施例1的方法，对壮苗培养基中不同浓度添加剂配比进行筛选试验。
将步骤不定芽诱导材料转接到壮苗培养基中培养，壮苗培养基见表2，在25℃±2、光照度2000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养30天，观察生长状态及其测量苗高(生长高度)，结果见表3-6。
表2附加不同浓度添加剂的培养基
表3不同浓度的水解酪蛋白对苜蓿再生苗生长的影响
由表3可知，当水解酪蛋白浓度为600mg/L时，苜蓿再生苗中达到0.84cm高度，且苗呈深绿色，伸展性佳，轻微玻璃化。
表4不同浓度的NAA对苜蓿再生苗生长的影响
由表4可知，当NAA浓度为0.7-0.9mg/L时，苜蓿再生苗，长高分别为0.69和1.27cm，且苗呈深绿色，伸展性佳，玻璃化轻微，有的甚至无玻璃化现象。
表5不同浓度的蛋白胨对苜蓿再生苗生长的影响
表6不同浓度的草莓汁对苜蓿再生苗生长的影响
由表5和表6可知，不同浓度的蛋白胨和草莓汁对苜蓿再生苗均无明显效果，叶片呈浅绿色、浅黄色和黄褐色等，且伸展性差和玻璃化现象明显。
三、生根培养基的筛选
根据实施例1的方法，对生根培养基中不同浓度添加剂配比进行筛选试验。
将壮苗培养的再生苗高为2-4cm的再生苗转接至生根培养基上诱导生根，在25℃±2、光照度2000lux条件下，每天光照16h、暗培养8h，培养30天，统计生根率，结果见表7。
表7不同浓度NAA对苜蓿再生苗的生根影响
由表7可知，当NAA浓度为0.5mg/L时，苜蓿再生苗的生根率为79.17％。
四、结论
本发明选出基因型“探戈”苜蓿叶片作为外植体得到苜蓿不定芽，优化了苜蓿胚性愈伤组织诱导和再生苗壮苗培养基配方，使构建的苜蓿再生体系高效稳定，综合性能优越，不定芽的增殖会随着继代时间延长而增加，重复性较好。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将外植体接种到愈伤组织诱导培养基中，在25±2℃下黑暗或弱光培养，得到诱导培养的愈伤组织；每升所述愈伤组织诱导培养基为：2,4-D 4mg、6-BA0.2～0.4mg、NAA0.2～0.4mg，其余为MS培养基；所述弱光培养的光照度<500lux；
S2、将S1得到的诱导培养的愈伤组织接种到不定芽诱导培养基中，在25±2℃下光照培养，得到诱导出不定芽的苜蓿组织；每升所述不定芽诱导培养基为：蔗糖38～42g，其余为MS培养基；
S3、将S2得到的诱导出不定芽的苜蓿组织接种到壮苗培养基中，在25±2℃下光照培养，得到再生苗；每升所述壮苗培养基为：NAA0.7～0.9mg、6-BA0.2mg、水解酪蛋白580～600mg、糖26～30g，其余为MS培养基；
S4、将S3得到的再生苗转接至生根培养基中，在25±2℃下光照培养，得到诱导生根的无菌苗；每升所述生根培养基为：NAA0.5～0.7mg，其余为1/2MS培养基。
2.根据权利要求1所述的苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，其特征在于，S1中，所述外植体为叶片切段；所述叶片切段是将预培养的无菌苗的叶片从叶片顶部以下1/3处切开得到。
3.根据权利要求1所述的苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，其特征在于，S1中，所述黑暗或弱光培养的时间为60～90天。
4.根据权利要求1所述的苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，其特征在于，S2～S4中，所述光照培养的时间为30～60天，每天光照16h，暗培养8h；所述光照培养的光照度2000lux。
5.根据权利要求1所述的苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，其特征在于，S3中，所述再生苗为茎高2～4cm的再生苗。
6.根据权利要求1所述的苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，其特征在于，S4中，当无菌苗诱导生根的根长为1.2～2cm时，将无菌苗移栽至营养基质中。
7.根据权利要求1所述的苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，其特征在于，S1中，每升所述愈伤组织诱导培养基为：2,4-D 4mg、6-BA0.4mg、NAA 0.2mg，其余为MS培养基。
8.根据权利要求1所述的苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，其特征在于，S2中，每升所述不定芽诱导培养基为：蔗糖40g，其余为MS培养基。
9.根据权利要求1所述的苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，其特征在于，S3中，每升所述壮苗培养基为：NAA0.9mg、6-BA0.2mg、水解酪蛋白600mg、糖30g，其余为MS培养基。
10.根据权利要求1所述的苜蓿叶片不定芽诱导及壮苗培养的方法，其特征在于，S4中，每升所述生根培养基为：NAA0.5mg，其余为1/2MS培养基。
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