CN105918123B - 一种生态修复用保定苜蓿的组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生态修复用保定苜蓿的组织培养方法，包括如下步骤：1)愈伤组织的诱导：将外植体接种到愈伤诱导培养基中，培养至形成愈伤组织；2)愈伤组织的分化：将所述愈伤组织接种到前期分化培养基中，至出现体胚；再将所述体胚接种到后期分化培养基中，至分化出芽；3)生根培养：将所述芽接种到生根培养基中进行生根培养，得苜蓿幼苗。本发明所述的方法，通过对外植体和培养基的优化选择，进一步结合适宜的培养条件和操作方法，可实现保定苜蓿的高效再生。

Description

一种生态修复用保定苜蓿的组织培养方法
技术领域
本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种生态修复用保定苜蓿(Medicagosativa L.cv.Baoding)的组织培养的方法。
背景技术
紫花苜蓿是一种重要的牧草，由于其具有营养价值高、产量高、能产生许多优良植物蛋白等优点，深受牛羊的喜爱，被誉为“牧草之王”。在美国，紫花苜蓿已经成为了第四大种植作物，是主要的畜牧饲料来源。保定苜蓿是紫花苜蓿中一个重要的品种，在国内，常被作为一个优选种植品种。
目前关于保定苜蓿的离体组织培养尚未见报道，研究主要集中紫花苜蓿其他品种，在其他品种的研究已经有用胚轴，叶片，子叶等外植体来诱导愈伤，利用离体组织来诱导愈伤进而使植株再生是一种普遍方法，但也存在愈伤生长慢，芽分化率低，不同外植体的再生率因品种差异而不同，不同的品种的组培特性也不一样，例如危晓薇等(危晓薇蔡丽娟李仁敬，紫花苜蓿组织培养及其再生植株，新疆农业科学，1991,10(3):73-74)利用新疆和田大叶紫花苜蓿无菌子叶和下胚轴为外植体进行离体培养，以SH为基本培养基分别添加0.5mg-3mg/LNAA和0.1mg/LKT的植物生长调节剂，外植体愈伤的诱导和芽的分化都使用这种培养基。研究结果发现，子叶的愈伤诱导率为52.3％，分化率为25％；下胚轴愈伤诱导率为100％，分化率为25.9％。
此外，徐博等(徐博，任伟，王英哲等，紫花苜蓿子叶的高频离体再生体系的建立与优化，湖北农业科学，2015,20(10)：5160-5161)以东北地区不同的紫花苜蓿(公农1号、公农2号、公农5号、龙牧801和龙牧803)的子叶为外植体进行离体培养，并进行培养基配方优化，研究发现MS+2mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT为愈伤最佳诱导培养基，UM+1.2mg/L KT为最佳分化培养基，不同基因型的愈伤诱导率存在显著差异，其中公农5号表现最佳。
此外，侯永霞等(侯永霞，王俊杰等，野生黄花苜蓿组织培养及再生体系研究，草地学报，2012,3(5)：523-528)以呼伦贝尔草原野生黄花苜蓿无菌苗的子叶和下胚轴为外植体进行离体培养，研究发现，MS+1.5mg/L 2,4-D+0.4mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂为愈伤诱导培养基，子叶和下胚轴愈伤诱导率均可达到100％；MS+0.5mg/L KT+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+7g/L琼脂为胚性愈伤形成培养基，胚性愈伤形成率为81.5％；MS+0.25mg/L KT+0.05mg/L NAA+20g/L蔗糖+7g/L琼脂为分化培养基，芽的分化率为36.5％；
此外，王庆东等(王庆东，刘青青等，紫花苜蓿NFF2高效组织培养再生体系的建立,郑州牧业工程高等专科学校学报，2013,4(11)：23-25)以NFF2无菌苗叶柄为外植体进行离体培养，研究发现，以SH+1.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L为愈伤诱导培养基，愈伤诱导率为91％；以MSO为基础培养基，添加一定的浓度的KT，结果发现MSO培养基为最佳的分化培养基，分化率为77％。
此外，耿小丽等(耿小丽，魏臻武等，苜蓿花药培养及倍性鉴定，草原与草坪，2008,5(5)：1-5)以紫花苜蓿品种阿尔岗金与Salado杂交的F1代的花药为外植进行离体培养，研究发现，NB+0.5mg/L2,4-D+0.3mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+3.0mg/L KT为最佳愈伤诱导培养基，愈伤诱导率为45.8％；MS+0.2mg/L NAA+3.0mg/L 6-BA为最佳的分化培养基，芽的分化率为62％。
此外，王新等(王新，贾永锋，紫花苜蓿对土壤重金属富集及污染修复的潜力，土壤通报，2009,4(8)：933-935)开展了在重金属复合污染条件下苜蓿田间小区试验研究，分析了重金属复合污染对紫花苜蓿生长的影响及植株体中重金属吸收特征及紫花苜蓿对重金属污染土壤修复的能力，结果发现，当土壤重金属浓度含量低剂量时，紫花苜蓿的生长不受重金属的胁迫影响，反而苜蓿的湿重比对照增加了14.18％，株高增加了6.25％，高剂量处理时，苜蓿湿重比对照减少5.97％，株高降低了8.75％，苜蓿对重金属吸收系数大小依次为Cd>Zn>Cu>Pb。
综上所述，在紫花苜蓿其他品种离体组织培养研究已经比较成熟，但存在技术难题：
(1)外植体的选择，不同的外植体的选择对紫花苜蓿离体组织培养影响非常大，其中包括不同发育阶段的外植体和不同组织器官都将影响离体再生，目前在紫花苜蓿其他品种，已经有研究表明用子叶，下胚轴，叶片，花药做为外植体成功了实现了离体再生，但在保定苜蓿上这个应用越来越广的品种上，尚未见相关组培再生技术的报道。
(2)愈伤的诱导和分化培养基的配方，由于不同的品种的组培特性存在很大差异，因此在愈伤诱导和分化培养基配方上也存在很大的差异。
发明内容
针对现有技术中没有保定苜蓿组织培养方法的缺陷，本发明围绕外植体选择和培养基配方的选择两大难题，提供一种保定苜蓿的组织培养方法，包括如下步骤：
1)愈伤组织的诱导：将外植体接种到愈伤诱导培养基中，培养至形成愈伤组织；
所述愈伤诱导培养基为添加了2～4mg/L 2,4-D、0.1～0.3mg/L6-BA、25～35g/L蔗糖和2～6g/L植物凝胶的MS培养基；
2)愈伤组织的分化：
将所述愈伤组织接种到前期分化培养基中，培养至出现体胚；再将所述体胚接种到后期分化培养基中，至分化出芽；
所述前期分化培养基为添加了0.2～0.6mg/L 6-BA、25～35g/L蔗糖和2～6g/L植物凝胶的MS培养基；
所述后期分化培养基为添加了10～20g/L蔗糖和2～6g/L植物凝胶的1/2MS培养基；
3)生根培养：将所述芽接种到生根培养基中进行生根培养，得苜蓿幼苗；
所述生根培养基为添加了0.5～1.5mg/L NAA、10～20g/L蔗糖和5～9g/L琼脂的1/2MS培养基。
本发明中，所述外植体为发芽4～6天的苜蓿幼苗的子叶。4～6天的子叶是保定苜蓿组培特性最好的外植体，其愈伤诱导能力强，增殖速度快，褐化率低，而使用老的叶片，组培特性低，愈伤诱导能力低，增殖速度缓慢。
本发明中，所述愈伤诱导培养基、前期分化培养基、后期分化培养基和生根培养基的pH均为5.7～5.8。、pH太低，基础培养基会软化，会导致愈伤水渍话，不利于愈伤的分化，pH过高，会影响愈伤对营养物质的吸收。
本发明中，所述愈伤组织诱导过程中的培养条件为温度24～26℃，光照30～50μE/m2/s，16h光照培养，8h黑暗培养；光照30～50μE/m2/s正适合保定苜蓿愈伤组织诱导，16h光照培养，有利于愈伤的增殖，同时会促进体胚的形成。
本发明中，所述愈伤组织分化过程中的培养条件为温度24～26℃，光照40～50μE/m2/s，16h光照培养，8h黑暗培养。此条件为愈伤分化的最适合条件，控温稳定有益于提高愈伤分化率，光照充足能促进更多的体胚发生。温度过低，会限制愈伤的分化速度，从而延长生长周期。
本发明中，所述生根培养过程中的培养条件为温度24～26℃，光照40～50μE/m2/s，16h光照培养，8h黑暗培养。恒温培养对愈伤分化生根有促进作用，光照为40～50μE/m2/s适合保定苜蓿的生长，16h光照有益于保证保定苜蓿进行足够的光合作用，产生更多的生物量。
本发明中，所述愈伤的诱导过程中，每2周继代一次。
本发明中，在后期分化培养过程中，所述芽生长至8～10cm。
优选的，本发明所述的方法包括如下步骤：
1)外植体的选择：选择发芽4～6天的苜蓿幼苗的子叶作为外植体；
2)愈伤组织的诱导：将所述外植体接种到愈伤诱导培养基中，培养至形成愈伤组织；
所述愈伤诱导培养基为添加了3mg/L 2,4-D、0.2mg/L 6-BA、25～35g/L蔗糖和2～6g/L植物凝胶的MS培养基；
3)愈伤组织的分化：
将所述愈伤组织接种到前期分化培养基中，至出现体胚；再将所述体胚接种到后期分化培养基中，至分化出芽；
所述前期分化培养基为添加了0.4mg/L 6-BA、25～35g/L蔗糖和2～6g/L植物凝胶的MS培养基；
所述后期分化培养基为添加了14～16g/L蔗糖和2～6g/L植物凝胶的1/2MS培养基；
4)生根培养：将所述芽接种到生根培养基中进行生根培养，得苜蓿幼苗；
生根培养基为添加了1.0mg/L NAA、10～20g/L蔗糖和5～9g/L琼脂的1/2MS培养基；
所述愈伤诱导培养基、前期分化培养基、后期分化培养基和生根培养基的pH均为5.8。
进一步的优选，本发明所述的方法包括如下步骤：
1)外植体的选择：选择发芽5天的苜蓿幼苗的子叶作为外植体；
2)愈伤组织的诱导：将所述外植体接种到愈伤诱导培养基中，培养至形成愈伤组织；
所述愈伤诱导培养基为添加了3mg/L 2,4-D、0.2mg/L 6-BA、30g/L蔗糖和4g/L植物凝胶的MS培养基；
3)愈伤组织的分化：
将所述愈伤组织接种到前期分化培养基中，至出现体胚；再将所述体胚接种到后期分化培养基中，至分化出芽；
所述前期分化培养基为添加了0.4mg/L 6-BA、30g/L蔗糖和4g/L植物凝胶的MS培养基；
所述后期分化培养基为添加了15g/L蔗糖和4g/L植物凝胶的1/2MS培养基；
4)生根培养：将所述芽接种到生根培养基中进行生根培养，得苜蓿幼苗；
生根培养基为添加了1.0mg/L NAA、15g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基；
所述愈伤诱导培养基、前期分化培养基、后期分化培养基和生根培养基的pH均为5.8。
本发明所述的方法具有如下有益效果：
1)通过选择活性高，低毒，组培特性好的外植体，为建立保定苜蓿的组培体系和遗传转化体系奠定了基础。
2)本套组培技术方法，确定了保定苜蓿的一个高效的愈伤诱导及分化培养基的配方，与同类型的紫花苜蓿品种相比，提高了愈伤诱导率和体胚发生率，降低了褐化率。
3)进一步的，通过优化相关的培养条件和操作手段，取得了高效再生的效果，而且本发明所述的方法培养周期短，繁殖速度快。
附图说明
图1为外植体的获取过程示意图，其中A：种子灭菌后放入到含有滤纸的培养皿中进行发芽，B：5天后获得的发芽幼苗；
图2为保定苜蓿组织培养的效果图，其中A:将切割的子叶放入愈伤诱导培养基上；B：诱导2周后形成的初期愈伤组织；C：诱导4周后形成的愈伤组织；D：放入前期分化培养基上培养2周的愈伤组织，体胚开始出现；E：放入后期分化培养基上培养2周后，体胚发生分化出芽；F：3周后，将芽取下来继续放入后期分化培养中继续培养，让芽长长；G：4周后将苗放入生根培养基上进行生根培养。
具体实施方式
实施例中涉及的的MS培养基的具体组成为：
MS培养基：大量元素：NH4NO3(1650mg/L)，KNO3(1900mg/L)，CaCl2·2H2O(440mg/L)，MgSO4·7H2O(370mg/L)，KH2PO4(170mg/L)，Na2EDTA(37.30mg/L),FeSO4·7H2O(27.8mg/L)；微量元素：H3BO3(6.2mg/L)MnSO4·4H2O(22.3mg/L),ZnSO4·7H2O(8.6mg/L),KI(0.83mg/L),Na2MoO4·2H2O(0.25mg/L),CuSO4·5H2O(0.025mg/L),CoCl2·6H2O(0.025mg/L)；有机物：肌醇(100mg/L)烟酸(0.5mg/L),维生素B6(0.5mg/L)，盐酸硫胺(0.1mg/L)，甘氨酸(2.0mg/L)
实施例中涉及的的1/2MS培养基的具体组成为：
1/2MS培养基：大量元素：NH4NO3(825mg/L)，KNO3(950mg/L)，CaCl2·2H2O(220mg/L)，MgSO4·7H2O(185mg/L)，KH2PO4(85mg/L)，Na2EDTA(18.65mg/L),FeSO4·7H2O(13,9mg/L)；微量元素：H3BO3(3.1mg/L)MnSO4·4H2O(11.15mg/L),ZnSO4·7H2O(4.3mg/L),KI(0.415mg/L),Na2MoO4·2H2O(0.125mg/L),CuSO4·5H2O(0.0125mg/L),CoC l2·6H2O(0.0125mg/L)；有机物：肌醇(50mg/L),烟酸(0.25mg/L),维生素B6(0.25mg/L)，盐酸硫胺(0.05mg/L)，甘氨酸(1.0mg/L)。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例涉及一种保定苜蓿的组织培养方法，包括如下步骤：
1)外植体的准备
从冰箱中取出保存的保定苜蓿种子，用70％的酒精侵泡1min,蒸馏水清洗3次，再放入40％次氯酸钠(有效率为10％)中，加入0.1mL吐温，放到转子上灭菌40min,放到超净工作台上，将次氯酸钠倒掉，用无菌水清洗6次，将种子放入含有几片滤纸的盘子中，稍微吹干，再将种子均匀播撒在含有滤纸并湿润培养皿中(图1.A)，将培养皿用医用胶带封住，放入组培室进行培养，光照为40μE/m2/s，温度为25℃。
培养5天后有1.5cm长的子叶产生(图1.B)，每颗种子产生两片子叶，在超净操作台中，用灭菌手术刀，将每片子叶切成两半，放到含有一点无菌水中的培养皿中。
2)愈伤组织的诱导
将切好的子叶放入愈伤诱导培养基：MS+3mg/L 2,4-D+0.2mg/L6-BA+30g/L蔗糖+4g/L植物凝胶，pH＝5.8(如图2.A)，放在25℃，光照为40μE/m2/s光照培养箱中培养，培养过程中16h光照，8h黑暗，每隔2周继代一次(继代培养基与愈伤诱导培养基一样)，2周后，有初期的愈伤组织形成(如图2.B)，4周后，愈伤组织进一步增殖(如图2.C)。
3)愈伤组织的分化
前期分化：挑选出足够健康的愈伤放入到前期分化培养基：MS+0.4mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+4g/L植物凝胶，pH＝5.8中培养，培养2周后，体胚开始出现(如图2.D)。
后期分化：将体胚转移到后期分化培养基:1/2MS+15g/L蔗糖+4g/L植物凝胶，pH＝5.8中培养，2周后，体胚发生分化出芽(如图2.E)，体胚分化出芽3周后将芽继续转移到后期分化培养基中继续培养，让芽长长至约8～10cm(如图2.F)。
在前期和后期分化培养过程中，均在25℃，光照为40μE/m2/s光照培养箱中培养，16h光照，8h黑暗。
4)生根培养：4周后，将上部发育良好的苗转移到生根培养基：1/2MS+1mg/L NAA+15g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8中进行生根培养(如果2.G)。
采用本套组培技术方法，保定苜蓿的愈伤诱导率为92.5％，体胚发生率为87.3％，生根率为60.4％，将150颗外植体放入愈伤诱导培养基中，最终获得400棵再生植物，褐化率为8.32％，从将外植体放入到愈伤诱导培养基中到最后获得再生植株，总周期为3个月16天。
实施例2
本实施例涉及一种保定苜蓿的组织培养方法，与实施例1相比，区别为：
取培养4天后的苜蓿幼苗子叶；
愈伤诱导培养基：MS+2mg/L 2,4-D+0.3mg/L 6-BA+35g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH＝5.8；
前期分化培养基为：MS+0.2mg/L 6-BA+35g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH＝5.8中培养；
后期分化培养基为：1/2MS+10g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH＝5.8；
生根培养基为：1/2MS+0.5mg/L NAA+10g/L蔗糖+5g/L琼脂，pH＝5.8
采用本套组培技术方法，保定苜蓿的愈伤诱导率为89.32％，体胚发生率为80.24％，生根率为40.21％，将150颗外植体放入愈伤诱导培养基中，最终获得327棵再生植物，褐化率为8.39％，从将外植体放入到愈伤诱导培养基中到最后获得再生植株，总周期为3个月25天。
实施例3
本实施例涉及一种保定苜蓿的组织培养方法，与实施例1相比，区别为：
取培养6天后的苜蓿幼苗子叶；
愈伤诱导培养基：MS+4mg/L 2,4-D+0.1mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+6g/L植物凝胶，pH＝6.0；
前期分化培养基为：MS+0.6mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+6g/L植物凝胶，pH＝6.0中培养；
后期分化培养基为：1/2MS+20g/L蔗糖+6g/L植物凝胶，pH＝6.0；
生根培养基为：1/2MS+1.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+9g/L琼脂，pH＝6.0；
采用本套组培技术方法，保定苜蓿的愈伤诱导率为85.35％，体胚发生率为80.3％，生根率为45.41％，将150颗外植体放入愈伤诱导培养基中，最终获得364棵再生植物，褐化率为7.49％，从将外植体放入到愈伤诱导培养基中到最后获得再生植株，总周期为4个月。
对比例1
与实施例1相比，其区别在于，所述外植体选择室外生长15天嫩叶。
保定苜蓿的愈伤诱导率为50.4％，体胚发生率为60.3％，生根率为40.2％，将150颗外植体放入愈伤诱导培养基中，最终获得297棵再生植物，褐化率为15％，染菌率为4.3％从将外植体放入到愈伤诱导培养基中到最后获得再生植株，总周期为5个月20天。
对比例2
与实施例1相比，其区别在于，所述外植体选择生长8天的苜蓿细苗子叶。
保定苜蓿的愈伤诱导率为83.2％，体胚发生率为78.3％，生根率为46.2％，将150颗外植体放入愈伤诱导培养基中，最终获得253棵再生植物，褐化率为8.43％，从将外植体放入到愈伤诱导培养基中到最后获得再生植株，总周期为4个月20天。
对比例3
与实施例1相比，其区别在于，所述前期分化培养基为：
愈伤诱导培养基：MS+5mg/L 2,4-D+0.3mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+6g/L植物凝胶，pH＝5.8；
前期分化培养基为：MS+1mg/LKT+0.5mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+6g/L植物凝胶，pH＝5.8中培养；
后期分化培养基为：1/2MS+20g/L蔗糖+6g/L植物凝胶，pH＝5.8；
生根培养基为：1/2MS+1.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+9g/L琼脂，pH＝5.8
保定苜蓿的愈伤诱导率为83.2％，体胚发生率为70.24％，生根率为46.27％，将150颗外植体放入愈伤诱导培养基中，最终获得240棵再生植物，褐化率为11.4％，从将外植体放入到愈伤诱导培养基中到最后获得再生植株，总周期为4个月27天。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种生态修复用保定苜蓿的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)外植体的选择：选择发芽4～6天的苜蓿幼苗的子叶作为外植体；
2)愈伤组织的诱导：将所述外植体接种到愈伤诱导培养基中，培养至形成愈伤组织；
所述愈伤诱导培养基为添加了3mg/L 2,4-D、0.2mg/L 6-BA、25～35g/L蔗糖和2～6g/L植物凝胶的MS培养基；
3)愈伤组织的分化：
将所述愈伤组织接种到前期分化培养基中，至出现体胚；再将所述体胚接种到后期分化培养基中，至分化出芽；
所述前期分化培养基为添加了0.4mg/L 6-BA、25～35g/L蔗糖和2～6g/L植物凝胶的MS培养基；
所述后期分化培养基为添加了14～16g/L蔗糖和2～6g/L植物凝胶的1/2MS培养基；
4)生根培养：将所述芽接种到生根培养基中进行生根培养，得苜蓿幼苗；
生根培养基为添加了1.0mg/L NAA、10～20g/L蔗糖和5～9g/L琼脂的1/2MS培养基；
所述愈伤诱导培养基、前期分化培养基、后期分化培养基和生根培养基的pH均为5.8。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤的组织诱导过程中的培养条件为温度24～26℃，光照30～50μE/m2/s，16h光照培养，8h黑暗培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织的分化过程中的培养条件为温度24～26℃，光照40～50μE/m2/s，光照周期为16h光照培养，8h黑暗培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养的过程中的培养条件为温度24～26℃，光照40～50μE/m2/s，16h光照培养，8h黑暗培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤的诱导过程中，每2周继代一次。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在后期分化培养过程中，至所述芽生长至8～10cm再接入生根培养基。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)外植体的选择：选择发芽5天的苜蓿幼苗的子叶作为外植体；
2)愈伤组织的诱导：将所述外植体接种到愈伤诱导培养基中，培养至形成愈伤组织；
所述愈伤诱导培养基为添加了3mg/L 2,4-D、0.2mg/L 6-BA、30g/L蔗糖和4g/L植物凝胶的MS培养基；
3)愈伤组织的分化：
将所述愈伤组织接种到前期分化培养基中，至出现体胚；再将所述体胚接种到后期分化培养基中，至分化出芽；
所述前期分化培养基为添加了0.4mg/L 6-BA、30g/L蔗糖和4g/L植物凝胶的MS培养基；
所述后期分化培养基为添加了15g/L蔗糖和4g/L植物凝胶的1/2MS培养基；
4)生根培养：将所述芽接种到生根培养基中进行生根培养，得苜蓿幼苗；
生根培养基为添加了1.0mg/L NAA、15g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基；
所述愈伤诱导培养基、前期分化培养基、后期分化培养基和生根培养基的pH均为5.8。
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