CN114773255A

CN114773255A - 一种绿原酸类似物及其制备方法与应用

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Publication number: CN114773255A
Application number: CN202210573586.5A
Authority: CN
Inventors: 黄强; 朱蕾; 王书奇; 罗会川
Original assignee: Zunyi Medical University
Current assignee: Zunyi Medical University
Priority date: 2022-05-24
Filing date: 2022-05-24
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2042-05-24
Also published as: CN114773255B

Abstract

本发明属于绿原酸类似物合成技术领域，具体涉及一种绿原酸类似物及其制备方法与应用，上述绿原酸类似物具有很强的抗氧化活性，可应用于制备抗氧化药物制剂中，而且，在上述绿原酸类似物的制备方法中，首次利用六元环连接咖啡酸和奎尼酸两个药效团，并且本发明中的绿原酸类似物中含有稳定的酰胺键，有效克服了绿原酸易水解而失去活性的缺陷。此外，本发明中绿原酸类似物的制备方法简单，有利于推广使用。

Description

一种绿原酸类似物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于绿原酸类似物合成技术领域，具体涉及一种绿原酸类似物及其制备方法与应用。

背景技术

绿原酸(chlorogenic acid，CGA)是一种植物次生代谢产物，属于多酚类化合物。研究表明，CGA具有多种生物学活性，如抗氧化、抗糖尿病、抗肥胖、抗炎、抗高血压、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、神经保护等。

研究发现，CGA的抗氧化性能与结构中五个活性羟基有关，这种结构利于清除机体多余的羟基自由基和超氧阴离子等，从而发挥较强的抗氧化作用。但由于CGA分子中有化学性质不稳定的酯键存在，绿原酸口服后仅有微量被完整吸收，绝大部分绿原酸在体内会发生酯键断裂水解释放出咖啡酸。因此，基于绿原酸结构开展药物设计与结构改造从而进一步提高绿原酸的生物活性是当前的研究热点之一，例如将绿原酸中原有酯键改为酰胺键有助于提高其稳定性，提高其抗氧化活性。

本发明人经过深入研究和大量实验，首次以六元环连接了咖啡酸和奎尼酸两个药效团，合成含酰胺键的绿原酸类似物，其比绿原酸更为稳定，且实验证明，与绿原酸相同，上述绿原酸类似物具有很强的抗氧化活性，由此可以预期，上述绿原酸类似物有望在体内更长久存在，将具有更佳的药代动力学参数。

发明内容

本发明意在提供一种绿原酸类似物及其制备方法与应用，以解决绿原酸不稳定易水解的问题。

为了达到上述目的，本发明一方面提供一种绿原酸类似物，所述绿原酸类似物的结构式如通式(Ⅰ)所示，

通式(Ⅰ)中，R1选自氢、乙酰基、甲基中的任意一种；

通式(Ⅰ)中，R2选自氢、乙酰基、甲基中的任意一种。

可选地，所述绿原酸类似物为下述化合物：

可选地，所述绿原酸类似物为下述化合物：

可选地，所述绿原酸类似物为下述化合物：

可选地，所述绿原酸类似物为下述化合物：

本发明另一方面提供上述化合物8的制备方法，包括以下步骤：

a)将化合物1在乙酸酐作溶剂、DMAP做催化剂的条件下，DIPEA提供碱性条件反应制备得到化合物2；

b)化合物2和化合物3通过缩合反应制备得到化合物4；

c)化合物4通过脱氢反应制备得到化合物5；

d)化合物5和化合物6通过缩合反应制备得到化合物7；

e)化合物7通过水解反应制备得到化合物8；

化合物8的合成路线如下：

本发明又一方面提供上述化合物9的制备方法，包括以下步骤：

b)化合物2和化合物3通过缩合反应制备得到化合物4；

c)化合物4通过脱氢反应制备得到化合物5；

d)化合物5和化合物6通过缩合反应制备得到化合物7；

e)化合物7通过水解反应制备得到化合物9；

化合物9的合成路线如下：

本发明又一方面提供上述化合物10的制备方法，包括以下步骤：

b)化合物2和化合物3通过缩合反应制备得到化合物4；

c)化合物4通过脱氢反应制备得到化合物5；

d)化合物5和化合物6通过缩合反应制备得到化合物7；

e)化合物7通过水解反应制备得到化合物9；

f)化合物9通过甲基化反应制备得到化合物10；

化合物9的合成路线如下：

b)化合物2和化合物3通过缩合反应制备得到化合物4；

c)化合物4通过脱氢反应制备得到化合物5；

d)化合物5和化合物6通过缩合反应制备得到化合物7；

e)化合物7通过水解反应制备得到化合物9；

f)化合物9通过甲基化反应制备得到化合物10；

g)化合物10进一步水解制备得到化合物11；

化合物11的合成路线如下：

可选地，在步骤b)中，缩合反应所使用的缩合剂选自HATU、HTBU、DCC、HOBT和BOP中的任意一种。

可选地，在步骤b)中，缩合反应所使用的溶剂选自DMF、DMSO、乙腈和1,4-二氧六环中的任意一种。

可选地，在步骤e)中，水解反应所使用的碱选自NaOH、LiOH、KOH、碳酸钾、碳酸钠和三乙胺中的任意一种。

可选地，在步骤f)中，甲基化反应所使用的碱选自碳酸钾、碳酸钠中的任意一种，溶剂为DMF、乙腈和1,4-二氧六环中的任意一种。

本发明又一方面提供一种含上述通式(Ⅰ)化合物和/或化合物8和/或化合物9和/或化合物10和/或化合物11的组合物。

本发明又一方面提供一种含上述通式(Ⅰ)化合物和/或化合物8和/或化合物9和/或化合物10和/或化合物11的药物制剂。

本发明又一方面提供上述通式(Ⅰ)化合物或上述组合物在制备抗氧化制剂中的应用。

本发明的工作原理及有益效果在于：本发明中，利用六元环连接咖啡酸和奎尼酸两个药效团，本发明的绿原酸类似物具有很强的抗氧化活性，且其中含有稳定的酰胺键，有效克服了绿原酸易水解而失去活性的缺陷，能够长久保持原本的结构，发挥抗氧化活性。并且，本发明中的制备方法简单，有利于推广使用。

附图说明

图1为实验例1中抗坏血酸、绿原酸和化合物8的DPPH自由基清除趋势图；

图2为实验例2中抗坏血酸、绿原酸和化合物8的ABTS自由基清除趋势图；

图3为实验例3中抗坏血酸、绿原酸和化合物8的羟基自由基清除趋势图；

图4为实验例4中抗坏血酸、绿原酸和化合物8的超氧负离子清除趋势图。

图5为实验例1中抗坏血酸、绿原酸和化合物9的DPPH自由基清除趋势图；

图6为实验例2中抗坏血酸、绿原酸和化合物9的ABTS自由基清除趋势图；

图7为实验例3中抗坏血酸、绿原酸和化合物9的羟基自由基清除趋势图；

图8为实验例4中抗坏血酸、绿原酸和化合物9的超氧负离子清除趋势图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例一

本实施例提供一种绿原酸类似物，该绿原酸类似物为下述化合物：

化合物8的合成路线如下：

化合物8的制备方法包括：

a)化合物2的合成：

称取DMAP(0.338g，2.77mmol)溶解于乙酸酐(26mL，277mmol)，使得DMAP与乙酸酐充分反应；然后，加入化合物1(奎尼酸，5g，27.7mmol)，并在反应体系中加入DIPEA(48mL，277mmol)。TCL监测：(DCM:甲醇＝10:1)；待反应结束，NaHCO₃水溶液调pH为碱性，EA萃出杂质(舍弃)；2mol/L HCl调节pH＝2，EA萃取，无水Na₂SO₄干燥、抽滤、旋干即可得化合物2，收率100％，未纯化直接用于下一步反应。

b)化合物4的合成：

称取化合物2(0.5g，1.4mmol)溶解于DMF中，依次加入HATU(1.065g，2.8mmol)，DIPEA(0.98mL，5.6mmol)冰浴下搅拌30分钟，然后加入化合物3(4-氨基-1-苄基哌啶，0.36mL，1.4mmol)，转入室温继续搅拌4小时。TLC监测(DCM:MeOH＝10：1)，待反应结束，加入NH₄Cl水溶液终止反应，EA萃取，无水Na₂SO₄干燥，抽滤，旋干获得粗品。粗品通过柱层析(DCM:MeOH＝40:1)纯化获得纯品化合物4，收率55％。

c)化合物5的合成：

以甲醇为溶剂溶解化合物4(2g，3.8mmol)并向反应液加入0.2g Pd/C，于反应瓶上安装氢气装置并置换氢气；反应液于40℃加热条件下脱苄反应结束后垫硅藻土抽滤，旋干滤液即得化合物5，未纯化直接用于下一步反应。

d)化合物6的合成：

称取咖啡酸(5g，27.7mmol)溶解于50mL DMF中，然后加入乙酸酐(26mL，277mmol)，随后加入DAMP(0.338g，2.77mmol)在反应体系中，并在冰浴下滴加DIPEA(48mL，277mmol)。TCL监测：(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)；待反应结束，用饱和氯化铵溶液淬灭，加水100mL稀释反应液，并用EA萃取3次；EA相用无水NaSO₄干燥、抽滤、旋干即可得化合物6，未进一步纯化，直接用于下一步反应。

e)化合物7的合成：

称取化合物6(0.3g，1.14mmol)溶解于DMF中，并加入HATU(0.87g，2.28mmol)活化羧基；在反应体系中加入化合物5(0.5g，1.14mmol)；反应体系在冰浴条件下加入DIPEA(0.6mL，4.56mmol)即可。TLC监测:(DCM:甲醇＝10:1)反应结束后，NH₄Cl水溶液调终止反应，EA萃取、干燥、抽滤、旋干即可得粗品。粗品通过柱层析(DCM:MeOH＝40:1)纯化获得纯品化合物4，收率45％。

f)化合物8的合成：

方法一：氢氧化钠水解

取化合物7(2g，2.9mmol)溶剂于THF中，取20mL浓度为0.5mol/L的NaOH(0.4g，10mmol)水溶液缓慢加入反应液中。TLC监测：(EA:EtOH:H₂O＝3:1:0.1+2滴乙酸)；待反应结束，反应液于真空下除THF；取2mmol/L HCl水溶液调节pH＝3；冷冻干燥，无水乙醇研磨粗品，过滤不溶物，滤液旋干即可得化合物8的粗品。粗品通过柱层析(EA:EtOH:H₂O＝4:1:0.1)纯化得纯品化合物8，收率23％。

方法二：氢氧化锂水解

取化合物7(1.4g，2.0mmol)溶解于30mL THF中，量取10mL水溶解氢氧化锂(0.48g，20mmol)并缓慢加入反应液中。TLC监测：(EA:EtOH:H2O＝3:1:0.1+2滴乙酸)；待反应结束，反应液于真空下除THF；取2mmol/L HCl水溶液调节pH＝3，旋干即可得化合物8粗品。粗品通过柱层析(EA:EtOH:H₂O＝4:1:0.1)纯化得纯品化合物8，收率58％。

方法一和方法二得到的化合物8的氢核磁共振谱：¹H NMR(400MHz,dmso)δ9.41(s,1H),8.95(s,1H),7.66(d,J＝7.9Hz,1H),7.27(d,J＝14.8Hz,1H),7.05(s,1H),6.98–6.82(m,1H),6.70(s,1H),5.46(s,1H),5.20(s,1H),4.84(s,1H),4.69(s,1H),4.34(s,1H),4.16(s,1H),3.91(s,1H),3.73(s,1H),3.48–3.37(m,2H),3.18(s,1H),3.08(s,1H),2.65(s,1H),1.84–1.52(m,4H),1.37(s,2H),1.20(s,1H),1.02(t,J＝7.0Hz,2H)。

实施例二

本实施例提供另一种绿原酸类似物，该绿原酸类似物为下述化合物：

化合物9的合成路线如下：

化合物9的制备方法中的步骤a)～e)均与化合物8的制备方法中的步骤a)～e)相同，不同之处仅在于：

化合物9的制备方法中的步骤f)如下：

f)化合物9的合成：

称取化合物7(2.4g，3.5mmol)溶解于10mL甲醇中；量取三乙胺(10mL，2mmol)加入反应液中。TLC监测(DCM:MeOH＝10:1)，待反应结束，除去有机溶剂即可得化合物9粗品。粗品通过柱层析(DCM:MeOH＝40:1)纯化得纯品化合物9，收率78％。

化合物9的氢核磁共振谱：¹H NMR(400MHz,cdcl₃)δ8.14(s,1H),7.44(d,J＝15.2Hz,1H),7.26(s,1H),7.02(s,1H),6.84(dd,J＝25.3,8.4Hz,2H),6.57(d,J＝15.1Hz,1H),6.40(dd,J＝30.1,6.6Hz,1H),5.55(s,1H),5.38(td,J＝10.4,4.5Hz,1H),4.97(dd,J＝10.2,3.5Hz,1H),4.53(s,1H),3.93(s,2H),3.06(t,J＝11.3Hz,1H),2.77(d,J＝15.7Hz,2H),2.58–2.34(m,2H),2.10(s,3H),2.04(s,3H),2.01(s,3H),1.99(s,3H),1.87(m,3H)。

实施例三

化合物10的合成路线如下：

化合物10的制备方法中的步骤a)～f)均与化合物9的制备方法中的步骤a)～f)相同，不同之处仅在于：

化合物10的制备方法还包括步骤g)如下：

g)化合物10的合成：

称取化合物9(100mg，0.165mmol)溶解于10mLDMF中；称取碳酸钾(91.2mg，0.66mmol)加入反应液中，再加入碘甲烷(234mg,1.65mmol)，80℃搅拌反应。TLC监测(DCM:MeOH＝30:1)，待反应结束，加水稀释反应液，EA萃取3次，饱和食盐水洗两次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩反应液得到化合物10粗品。粗品通过柱层析(DCM:MeOH＝100:1)纯化得纯品化合物10，收率92％。

化合物10的氢核磁共振谱：¹H NMR(400MHz,cdcl₃)δ7.56(d,J＝15.3Hz,1H),7.07(dd,J＝8.3,1.7Hz,1H),6.99(d,J＝1.8Hz,1H),6.82(d,J＝8.4Hz,1H),6.69(d,J＝15.3Hz,1H),5.94(s,1H),5.55(s,1H),5.44–5.29(m,1H),4.96(dd,J＝10.2,3.6Hz,1H),4.59(s,1H),4.07–3.93(m,2H),3.88(d,J＝5.9Hz,6H),3.19(s,1H),2.76(d,J＝16.5Hz,2H),2.45(d,J＝13.2Hz,2H),2.11(s,3H),2.04(s,3H),2.01(s,3H),1.97(s,3H),1.94–1.83(m,2H),1.77(s,1H),1.39–1.26(m,2H)。

实施例四

化合物11的合成路线如下：

化合物11的制备方法中的步骤a)～g)均与化合物10的制备方法中的步骤a)～g)相同，不同之处仅在于：

化合物11的制备方法还包括步骤k)如下：

k)化合物11的合成：

取化合物10(80mg，0.13mmol)溶解于30ml体积比(甲醇：THF＝2：1)的混合液中，量取5mL水溶解氢氧化锂(31mg，1.3mmol)并缓慢加入反应液中。TLC监测：(EA:EtOH:H2O＝3:1:0.1+2滴乙酸)；待反应结束，反应液于真空下除THF；取2mmol/LHCl水溶液调节pH＝3，蒸干溶剂即可得化合物8粗品。柱层析(EA:EtOH:H2O＝4:1:0.1)纯化即为化合物11纯品，收率87％。

化合物11的氢核磁共振谱：¹H NMR(400MHz,cd₃od)δ7.50(d,J＝15.3Hz,1H),7.25(d,J＝1.7Hz,1H),7.14(dd,J＝8.3,1.7Hz,1H),7.03(d,J＝15.4Hz,1H),6.94(d,J＝8.4Hz,1H),4.56(d,J＝13.6Hz,1H),4.29(d,J＝13.3Hz,1H),4.12(d,J＝2.7Hz,1H),4.05–3.88(m,3H),3.85(d,J＝9.8Hz,6H),3.62–3.49(m,3H),3.38(dd,J＝9.1,3.0Hz,1H),3.28–3.18(m,1H),2.87(t,J＝12.0Hz,1H),2.35(t,J＝7.5Hz,1H),1.97–1.81(m,5H),1.60–1.41(m,3H)。

实验例1

DPPH自由基清除能力实验

将化合物8分别按照一定浓度梯度(0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125、0.00390625mmol/L)配制成不同浓度的甲醇溶液。取DPPH(0.2mol/L)甲醇溶液与不同浓度的化合物8的甲醇溶液各2mL分别置于离心管中充分混匀，避光反应30min。然后在517nm波长处测定其吸光度值——A₁。以相同浓度梯度的抗坏血酸和CGA的吸光度值作为对照。

DPPH清除率(％)＝[1-(A₁-A₂)/A₀]×100％

其中，A₂为化合物8与甲醇混合后的吸光值，A₀为蒸馏水与DPPH甲醇溶液混合后的吸光值。

按照上述方法对化合物9进行实验，抗坏血酸、绿原酸、化合物8和化合物9的DPPH自由基清除率结果如表1所示，抗坏血酸、绿原酸和化合物8的DPPH自由基清除趋势如图1所示，抗坏血酸、绿原酸和化合物8的DPPH自由基清除趋势如图5所示。

表1各物质的DPPH自由基清除率

结论：由表1和图1、图5可知，这四种物质均具有清除DPPH自由基的能力，且呈剂量依赖性。随着药物浓度升高，绿原酸、化合物8和化合物9清除DPPH自由基的能力较接近抗坏血酸。

实验例2

ABTS自由基清除能力实验

将化合物8按照一定浓度梯度(1.00、0.50、0.25、0.125、0.0625、0.03125mmol/L)配制成不同浓度的甲醇溶液。首先，将过硫酸钾溶解于蒸馏水中配制成2.6mmol/L的水溶液；其次，再将ABTS溶解于2.6mmol/L的过硫酸钾水溶液中配制成7.4mmol/L的ABTS自由基储备液，混合液于室温下避光、静置过夜。配制成ABTS自由基测定液，吸取1mL ABTS自由基储备液用蒸馏水将其浓度稀释为原液的1/29.33，使混合液在734nm波长处的吸光度值为0.70±0.02即可。最后，取不同浓度的样品溶液0.2mL与ABTS自由基测定液2mL充分混匀并在室温下避光反应6min，然后于在734nm波长处测定吸光度值——A₁。以相同浓度梯度的抗坏血酸和CGA的吸光度值作为对照。

ABTS自由基清除率(％)＝[1-(A₁-A₂)/A₀]×100％

其中，A₂为化合物8与过硫酸钾溶液混合后的吸光值，A₀为蒸馏水与ABTS自由基测定液混合后的吸光值。

按照上述方法对化合物9进行实验，抗坏血酸、绿原酸、化合物8和化合物9的ABTS自由基清除率结果如表2所示，抗坏血酸、绿原酸和化合物8的ABTS自由基清除趋势如图2所示，抗坏血酸、绿原酸和化合物9的ABTS自由基清除趋势如图6所示。

表2各物质的ABTS自由基清除率

结论：由表2和图2、图6可知，这四种物质均具有清除ABTS自由基的能力，且呈剂量依赖性。随着药物浓度升高，绿原酸、化合物8与化合物9清除ABTS自由基的能力较接近抗坏血酸。

实验例3

羟基自由基清除能力实验

将化合物8按照一定浓度梯度(4.00、2.00、1.00、0.50、0.25、0.125mmol/L)配成不同浓度的溶液。分别取不同浓度的样品溶液9mmol/L水杨酸、9mmol/L FeSO₄溶液各0.5mL并使三者混匀。再加入(0.5mL，8.8mM)H₂O₂，37℃水浴加热30min。然后在510nm波长处测定吸光值——A₁，以相同浓度梯度的抗坏血酸和CGA的吸光度值作为对照。

羟基自由基清除率(％)＝[1-(A₁-A₂)/A₀]×100％

其中，A₂为化合物8与蒸馏水代替H₂O₂的检测液混合后的吸光值，A₀为蒸馏水与检测液混合后的吸光值。

按照上述方法对化合物9进行实验，抗坏血酸、绿原酸、化合物8和化合物9的羟基自由基清除率结果如表3所示，抗坏血酸、绿原酸和化合物8的羟基自由基清除趋势如图3所示，抗坏血酸、绿原酸和化合物9的羟基自由基清除趋势如图7所示。

表3各物质的羟基自由基清除率

结论：由表3和图3、图7可知，这四种物质均具有清除羟基自由基的能力，且呈剂量依赖性。其中，化合物8与化合物9相比，化合物8清除羟自由基能力接近绿原酸。

实验例4

超氧负离子自由基清除能力实验

将化合物8按照一定浓度梯度(4.00、2.00、1.00、0.50、0.25、0.125mmol/L)配成不同浓度的溶液。首先，取不同浓度样品溶液各1.0mL分别与50mmol/L、pH＝8.2的Tris-HCl缓冲液4.0mL混匀；其次，混合液于25℃水浴中反应10min，再将0.1mL 25mmol/L的邻苯三酚溶液加入混合液中反应5min；最后，加入10mol/L的HCl溶液2滴终止反应，然后在325nm波长处测定吸光值——A₁，以相同浓度梯度的抗坏血酸和CGA的吸光度值作为对照。

超氧负离子自由基清除率(％)＝[1-(A₁-A₂)/A₀]×100％

其中，A₂为化合物8与蒸馏水代替邻苯三酚的检测液混合后的吸光值，A₀为蒸馏水与检测液混合后的吸光值。

按照上述方法对化合物9进行实验，抗坏血酸、绿原酸、化合物8和化合物9的超氧负离子自由基清除率结果如表4所示，抗坏血酸、绿原酸和化合物8的超氧负离子自由基清除趋势如图4所示，抗坏血酸、绿原酸和化合物9的超氧负离子自由基清除趋势如图8所示。

表4各物质的超氧负离子自由基清除率

结论：由表4和图4、图8可知，这四种物质均具有清除超氧负离子自由基的能力，且呈剂量依赖性。随着药物浓度升高，化合物8和化合物9清除超氧负离子自由基能力优于绿原酸。

综上所述，化合物8和化合物9均具有抗氧化活性，且与绿原酸作用接近。在清除超氧负离子方面，当浓度达到2.00mmol/L以上后，化合物8和化合物9对超氧负离子的清除效果优于绿原酸。此外，化合物10以及化合物11按照上述方法进行实验，实验结果显示化合物10和化合物11亦具有较好的DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基以及超氧负离子自由基清除率，具有较好的抗氧化活性。

以上的仅是本发明的实施例，该发明不限于此实施案例涉及的领域，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。