CN114767622B - 一种预防或治疗口腔溃疡的枸杞糖肽水凝胶及其制备方法和用途 - Google Patents

一种预防或治疗口腔溃疡的枸杞糖肽水凝胶及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种预防或治疗口腔溃疡的枸杞糖肽水凝胶及其制备方法和用途。本发明水凝胶是温敏型水凝胶，所述水凝胶能够紧密粘附于口腔内部、包载活性成分并能够通过温度控制粘附，以重量体积百分比g/100mL计，所述水凝胶中包含枸杞糖肽0.5％‑4％，凝胶基质10％‑30％，粘附性材料0.2％‑0.4％，优选地，所述凝胶基质是泊洛沙姆407，所述粘附性材料是羧甲基纤维素钠。采用本发明方法制备得到的枸杞糖肽水凝胶具有粘附性强，疗效显著且持久，使用方便，安全性高等优点，本发明枸杞糖肽水凝胶可显著缩短口腔溃疡愈合时间，减少患者疼痛，提高患者生活质量。

Description

一种预防或治疗口腔溃疡的枸杞糖肽水凝胶及其制备方法和 用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种预防或治疗口腔溃疡的枸杞糖肽水凝胶及其制备方法和用途。
背景技术
口腔溃疡是较为常见的口腔粘膜疾病，其发病率比较高，多见于唇内侧，舌头、软腭等部位，发作时，疼痛剧烈，局部灼痛明显，口腔溃疡恢复时间长，且病情反复，时好时坏，严重时会影响饮食、说话，对日常生活造成极大不便。临床上常见的口腔溃疡有复发型口疮、病毒引起的口腔溃疡、创伤性口腔溃疡以及放射性口腔溃疡等，至今大多数口腔溃疡的病因尚属不明。在治疗上，除全身用药外，一般以抗生素、合成抗菌药、激素、维生素及具有清热养阴收敛生肌功效的中药局部应用为主，并取得一定的疗效。但是，上述药物通常存在在患处作用时间较短、药物渗透作用不足以及疗效较差等问题。
此外，放射性口腔粘膜炎(radiotherapy-induced oral mucositis，RTOM)常见于头颈部肿瘤特别是鼻咽癌放射治疗中，发生率为50％-100％。RTOM的发生率与放射治疗照射剂量、分割方式相关；也与合并使用化疗时化疗药物的种类、剂量有关。随着病变的进展，RTOM表现为口腔溃疡，造成患者口腔部疼痛，影响进食，营养不良风险和治疗中断发生率增加，住院时间延长，降低放化疗疗效。放射性口腔粘膜炎包括了放射性口腔溃疡，溃疡是粘膜炎的一个发展阶段。随着放射剂量与时间的增加，口腔粘膜从红肿、糜烂发展为溃疡，最后是愈合阶段。目前，临床上对于放射性口腔粘膜炎的防治方法主要有以下几种：在放射治疗计划设计中限制口腔/口咽部的照射剂量，应用改善细胞缺血药物、非甾体类抗炎药物、粘膜保护剂、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等，效果并不理想。临床上仍缺乏疗效确切的防治放射性口腔粘膜炎方法，主要以局部止痛等对症治疗为主。
枸杞糖肽(Lycium barbarum polysaccharide-glycoprotein,LBP)是从中药枸杞子中分离、提取得到的一种糖复合物，其分子量由SDS-PAGE测定为88kD,糖含量为70％,糖组成为ArA:GAl:GlC＝2.5:1.0:1.0(摩尔比),并含有其他18种天然氨基酸。目前已有多项研究证实枸杞糖肽具有抗氧化、免疫调节、神经保护、抗衰老、抗癌、调节血糖血脂和血-视网膜屏障保护等多种作用。枸杞糖肽具有免疫调节作用，通过调节巨噬细胞分化为不同亚群来维持炎症反应的平衡。在LPS等刺激的炎症环境中，显著抑制TNF-α和IL-1β等炎症因子的分泌，防止巨噬细胞过度活化而引起的免疫损伤。多项体外实验表明枸杞糖肽能清除超氧化物、DPPH和羟基自由基以及羟自由基的联合作用，还能抑制炎性环境中的活性氧的过度产生，此外，枸杞糖肽具有较多还原端基，有较强的还原能力，体现出良好的抗氧化性。枸杞糖肽的良好生物相容性、免疫调节性与抗氧化性为其在口腔制剂中的应用提供了新思路，且尚未见枸杞糖肽预防或治疗口腔粘膜炎以及口腔溃疡方面的报道。
凝胶制剂是口腔常用药的形式之一，但目前口腔用凝胶制剂粘附性差，作用时间短，且没有温度敏感型的凝胶。
鉴于现有技术中用于预防或治疗口腔溃疡的口腔用药无论是在活性成分的疗效方面，还是在药物制剂的性能方面均存在较大缺陷，因此，急需开发出一种疗效显著、安全性高、在患处作用时间长且价格低廉的用于预防或治疗口腔溃疡的口腔用药物制剂。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种预防或治疗口腔溃疡的枸杞糖肽水凝胶及其制备方法和用途。采用本发明方法制备得到的枸杞糖肽水凝胶具有粘附性强，疗效显著且持久，使用方便，安全性高等优点，本发明枸杞糖肽水凝胶可显著缩短口腔溃疡时间，减少患者疼痛，提高患者生活质量。
具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
在第一个方面中，本发明提供了一种预防或治疗口腔溃疡的枸杞糖肽水凝胶，所述水凝胶中包含枸杞糖肽、凝胶基质、粘附性材料和水，所述水凝胶是温敏型水凝胶，所述水凝胶能够紧密粘附于口腔内部、包载活性成分并能够通过温度控制粘附。
作为可选的方式，在上述水凝胶中，以重量体积百分比g/100mL计，所述水凝胶中包含枸杞糖肽0.5％-4％，凝胶基质10％-30％，粘附性材料0.2％-0.4％。
优选地，以重量体积百分比g/100mL计，所述水凝胶中包含枸杞糖肽1％，凝胶基质20％，粘附性材料0.3％。
另外优选地，以重量体积百分比g/100mL计，所述水凝胶中包含枸杞糖肽2％，凝胶基质20％，粘附性材料0.3％。
另外优选地，以重量体积百分比g/100mL计，所述水凝胶中包含枸杞糖肽3％，凝胶基质20％，粘附性材料0.3％。
作为可选的方式，在上述水凝胶中，所述凝胶基质是泊洛沙姆188或泊洛沙姆407，所述粘附性材料选自以下一种或多种：卡波姆、聚乙二醇、海藻酸钠、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、壳聚糖、聚乙烯醇或环糊精，所述水为纯化水或注射用水。
作为可选的方式，在上述水凝胶中，所述凝胶基质是泊洛沙姆407，所述粘附性材料是羧甲基纤维素钠。
在第二个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)称取适量凝胶基质溶于纯水，搅拌后置于4℃冰箱，约48h后，所述凝胶基质完全溶解，呈透明澄清的液体，制得30％凝胶基质溶液，所得凝胶溶液在4℃冰箱保存；
(2)称取适量粘附性材料溶于纯水，制得2％所述粘附性材料溶液；
(3)取适量步骤(2)中制备得到的2％所述粘附性材料溶液，加入适量纯水，使得所述粘附性材料溶液的终浓度为上述第一个方面中所需终浓度，再加入适量枸杞糖肽粉末，使得所述枸杞糖肽的终浓度为上述第一个方面中所需终浓度，最后加入适量步骤(1)中制备得到的30％凝胶基质溶液，使得所述凝胶基质溶液的终浓度为上述第一个方面中所需终浓度。
作为可选的方式，在上述制备方法中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)称取适量泊洛沙姆407溶于纯水，搅拌后置于4℃冰箱，约48h后，泊洛沙姆407完全溶解，呈透明澄清的液体，制得30％泊洛沙姆407溶液，所得凝胶溶液在4℃冰箱保存；
(2)称取适量羧甲基纤维素钠溶于纯水，制得2％羧甲基纤维素钠溶液；
(3)取适量步骤(2)中制备得到的2％羧甲基纤维素钠溶液，加入适量纯水，使得所述羧甲基纤维素钠溶液的终浓度为0.3％，再加入适量枸杞糖肽粉末，使得所述枸杞糖肽的终浓度为1％或2％或3％，最后加入适量步骤(1)中制备得到的30％泊洛沙姆407溶液，使得所述泊洛沙姆407溶液的终浓度为20％。
在第三个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的水凝胶或者采用上述第二个方面所述制备方法制备得到的水凝胶在制备预防或治疗口腔溃疡的药物中的用途。
作为可选的方式，在上述用途中，所述口腔溃疡是复发型口疮、病毒引起的口腔溃疡、创伤性口腔溃疡、放射性口腔溃疡或化学刺激性口腔溃疡，优选地，所述口腔溃疡是放射性口腔溃疡或化学刺激性口腔溃疡。
在第四个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的水凝胶或者采用上述第二个方面所述制备方法制备得到的水凝胶在制备预防或治疗口腔粘模炎中的用途。
作为可选的方式，在上述用途中，所述口腔粘膜炎是放射性口腔粘膜炎或化学刺激性口腔粘膜炎。
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
本发明结合我国在天然产物研究方面的优势，首次发现了天然产物枸杞糖肽在预防或治疗口腔溃疡方面的新用途。
本发明枸杞糖肽水凝胶制剂以泊洛沙姆407为基质，具有良好的温敏性，便于口腔用药。该凝胶添加羧甲基纤维素钠为粘附性材料，以常用临床用药重组人表皮生长因子为对照，枸杞糖肽凝胶的粘附性显著优于重组人表皮生长因子，缓释作用时间更长，且2小时为突释点，减少由于进食导致的药物流失。
采用本发明方法制备得到的枸杞糖肽水凝胶具有粘附性强，疗效显著且持久，使用方便，安全性高等优点，本发明枸杞糖肽水凝胶可显著缩短口腔溃疡时间，减少患者疼痛，提高患者生活质量。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1：粘附力测定装置示意图。
图2：本发明枸杞糖肽水凝胶的粘附力测定结果。其中，***,P<0.001。
图3：本发明枸杞糖肽水凝胶的体外药物释放曲线。
图4：本发明枸杞糖肽水凝胶对HaCaT细胞活力的影响。
图5：活细胞/死细胞染色结果。其中，放大倍数为×100。图5A：细胞培养1天后；图5B：细胞培养3天后；图5C：细胞培养5天后。图中：a：对照组；b：空白凝胶组；c：1％枸杞糖肽温敏水凝胶组；d：2％枸杞糖肽温敏水凝胶组；e：3％枸杞糖肽温敏水凝胶组。1：活细胞染色；2：死细胞染色。
图6：本发明枸杞糖肽水凝胶对化学性口腔粘膜炎大鼠口腔溃疡情况的影响。图6A：大鼠建模后1天的口腔溃疡照片；图6B：大鼠给药5天后和9天后的口腔溃疡照片。其中，a：空白对照组；b：重组人表皮生长因子凝胶组；c：空白凝胶组；d：1％枸杞糖肽温敏水凝胶组；e：2％枸杞糖肽温敏水凝胶组；f：3％枸杞糖肽温敏水凝胶组。1：给药5天后；2：给药9天后。
图7：本发明枸杞糖肽水凝胶对化学性口腔粘膜炎大鼠体重的影响。
图8：本发明枸杞糖肽水凝胶对化学性口腔粘膜炎大鼠内脏影响的HE染色结果。其中，放大倍数为×100。图8A：给药5天后；图8B：给药9天后。其中，a：空白对照组；b：重组人表皮生长因子凝胶组；c：空白凝胶组；d：1％枸杞糖肽温敏水凝胶组；e：2％枸杞糖肽温敏水凝胶组；f：3％枸杞糖肽温敏水凝胶组。1-5：心、肝、脾、肺、肾。
图9：本发明枸杞糖肽水凝胶对化学性口腔粘膜炎大鼠下唇影响的HE染色结果。图9A：给药5天后；图9B：给药9天后。其中，a：空白对照组；b：重组人表皮生长因子凝胶组；c：空白凝胶组；d：1％枸杞糖肽温敏水凝胶组；e：2％枸杞糖肽温敏水凝胶组；f：3％枸杞糖肽温敏水凝胶组。1：×40；2：×200。
图10：本发明枸杞糖肽水凝胶对化学性口腔粘膜炎大鼠下唇影响的免疫组化染色结果。图10A：TNF-α；图10B：IL-6；图10C：IL-10；图10D：bFGF。其中，放大倍数为×400。a：空白对照组；b：重组人表皮生长因子凝胶组；c：空白凝胶组；d：1％枸杞糖肽温敏水凝胶组；e：2％枸杞糖肽温敏水凝胶组；f：3％枸杞糖肽温敏水凝胶组。1：给药5天；2：给药9天。
图11：本发明枸杞糖肽水凝胶对化学性口腔粘膜炎大鼠下唇影响的免疫组化染色分析结果。图10A：TNF-α；图10B：IL-6；图10C：IL-10；图10D：bFGF。
图12：本发明枸杞糖肽水凝胶对放射性口腔粘膜炎大鼠口腔溃疡情况的影响。图12A：大鼠建模后1天的口腔溃疡照片；图12B：大鼠给药5天后和9天后的口腔溃疡照片。其中，a：空白对照组；b：重组人表皮生长因子凝胶组；c：空白凝胶组；d：1％枸杞糖肽温敏水凝胶组；e：2％枸杞糖肽温敏水凝胶组；f：3％枸杞糖肽温敏水凝胶组。1：给药5天后；2：给药9天后。
图13：本发明枸杞糖肽水凝胶对放射性口腔粘膜炎大鼠体重的影响。
图14：本发明枸杞糖肽水凝胶对放射性口腔粘膜炎大鼠内脏影响的HE染色结果。其中，放大倍数为×100。图14A：给药5天后；图14B：给药9天后。其中，a：空白对照组；b：重组人表皮生长因子凝胶组；c：空白凝胶组；d：1％枸杞糖肽温敏水凝胶组；e：2％枸杞糖肽温敏水凝胶组；f：3％枸杞糖肽温敏水凝胶组。1-5：心、肝、脾、肺、肾。
图15：本发明枸杞糖肽水凝胶对放射性口腔粘膜炎大鼠下唇影响的HE染色结果。图15A：给药5天后；图15B：给药9天后。其中，a：空白对照组；b：重组人表皮生长因子凝胶组；c：空白凝胶组；d：1％枸杞糖肽温敏水凝胶组；e：2％枸杞糖肽温敏水凝胶组；f：3％枸杞糖肽温敏水凝胶组。1：×40；2：×200。
图16：本发明枸杞糖肽水凝胶对放射性口腔粘膜炎大鼠下唇影响的免疫组化染色结果。图16A：TNF-α；图16B：IL-6；图16C：IL-10；图16D：bFGF。其中，放大倍数为×400。a：空白对照组；b：重组人表皮生长因子凝胶组；c：空白凝胶组；d：1％枸杞糖肽温敏水凝胶组；e：2％枸杞糖肽温敏水凝胶组；f：3％枸杞糖肽温敏水凝胶组。1：给药5天；2：给药9天。
图17：本发明枸杞糖肽水凝胶对化学性口腔粘膜炎大鼠下唇影响的免疫组化染色分析结果。图17A：TNF-α；图17B：IL-6；图17C：IL-10；图17D：bFGF。
具体实施方式
本发明人采用现代药物研究方法对天然产物进行深入开发利用，通过大量筛选，首次发现枸杞糖肽能够预防或治疗预防或治疗口腔溃疡，特别是放射性口腔粘膜炎或放射性口腔溃疡。并且，基于上述发现，开发出了一种新型口腔用枸杞糖肽水凝胶。在此基础上完成了本发明。
在本发明中使用的“枸杞糖肽”可以采用本领域常规的天然产物提取方法从含有该活性成分的枸杞子等植物中提取分离得到，也可以购自市售产品。
在本文所述的医药用途中，对于枸杞糖肽的给药时间、给药次数和给药频率等等，需要根据病情的具体诊断结果而定，这在本领域技术人员掌握的技术范围之内。
将对大鼠的治疗方案应用于人体上，所有药物对人的有效剂量可以通过该药物对大鼠的有效剂量进行换算，这对于本领域的普通技术人员而言也是容易实现的。
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
以下实施例处方中当出现百分比时，如果未明确指出，则表示重量/体积％，g/100mL。
实施例：
本发明根据已有文献和实践经验筛选出泊洛沙姆407为凝胶基质，通过胶凝温度与胶凝时间筛选出最佳基质比例，通过根据已有文献和实践经验筛选出羧甲基纤维素钠为粘附性材料，添加不同浓度的枸杞糖肽与羧甲基纤维素钠，根据药物溶解度与胶凝时间选择羧甲基纤维素钠比例以及制作高中低三种浓度的枸杞糖肽温敏水凝胶。对3种浓度(1％、2％、3％)的枸杞糖肽凝胶进行胶凝温度、胶凝时间、pH、缓释曲线、粘附力、生物相容性的测定，检验该凝胶是否符合临床用药的性能需求。利用重组人表皮生长因子凝胶做阳性对照，大鼠动物实验进一步检验枸杞糖肽凝胶预防或治疗口腔溃疡的疗效。具体如下所示：
实施例1：本发明枸杞糖肽水凝胶的处方筛选
1.1凝胶基质的筛选
采用泊洛沙姆407与泊洛沙姆188为基质，选取不同质量/体积分数溶液配比，通过胶凝温度与胶凝时间，选取最佳比例的基质。具体实验步骤如下所示：
称取适量的泊洛沙姆407与泊洛沙姆188粉末，分别溶于纯水，搅拌后置于4℃冰箱，约48h后，泊洛沙姆完全溶解，呈透明澄清的液体。将泊洛沙姆407与泊洛沙姆188溶液按表1比例配制凝胶溶液，凝胶溶液4℃冰箱保存。
取1mL凝胶加入离心管，置于4℃冰箱20min，再取出放于20℃的恒温水浴锅，水浴锅以0.5℃/min的速度逐渐升温，每10s将离心管90度倒置，凝胶倒置后不流动时的水浴锅显示温度为胶凝温度。
取1mL凝胶加入离心管，4℃冰箱放置20min，将离心管倾斜60度，放于37℃水浴锅，凝胶形成的斜面不再流动时所需的时间为胶凝时间。
实验结果见表1。根据胶凝时间和温度筛选最佳基质配比：20％(g/100mL)泊洛沙姆407。制备空白凝胶和1％(低)、2％(中)、3％(高)(g/100mL)的3种浓度的枸杞糖肽温敏水凝胶。
表1
Figure BDA0003603962460000081
Figure BDA0003603962460000091
1.2粘附性材料的选取
实验结果表明，在20％泊洛沙姆407凝胶中，羧甲基纤维素钠浓度≤0.2％，枸杞糖肽无法溶解完全；羧甲基纤维素钠浓度≥0.4％，胶凝时间过长。羧甲基纤维素钠加入后，增加枸杞糖肽溶解度，但枸杞糖肽浓度≥4％，凝胶放置后会有枸杞糖肽析出。
1.3最终确定的最佳凝胶处方
20％泊洛沙姆407+0.3％羧甲基纤维素钠，枸杞糖肽浓度1％(低)、2％(中)、3％(高)。
实施例2：本发明枸杞糖肽水凝胶的制剂性质研究
2.1胶凝温度、胶凝时间、pH测定
对空白凝胶基质以及3种浓度(1％、2％、3％)的枸杞糖肽凝胶的凝胶胶凝温度(凝胶从4℃拿出，放至不断升温的水浴锅成胶的温度)、4℃与20℃胶凝时间(凝胶从4℃/20℃拿出，放至37℃水浴锅成胶的时间)和pH进行了检测。结果见表2。
表2
Figure BDA0003603962460000092
2.2粘附力测定
制作凝胶粘附力测定装置(如图1所示)，检测重组人表皮生长因子凝胶(市售重组人表皮生长因子凝胶规格为5万IU(100μg)/10g/支，购自桂林华诺威基因药业有限公司；以下简称为rhEGF)与不同浓度枸杞糖肽水凝胶的粘附力。
取两块SD大鼠(购自成都达硕实验动物有限公司)肠粘膜，洗净，生理盐水润湿肠粘膜表面，用光滑胶布将一块肠粘膜平整固定于天平右侧托盘底部，一块肠粘膜平整固定于下部试验台表面，保证两块粘膜暴露的面积相同，且粘膜以外的环境干燥。测量暴露的肠粘膜表面积(A,cm2)。左侧天平托盘放置一小塑料瓶。在30℃环境下，取适量温敏凝胶液体置于两块肠粘膜之间，在右侧天平托盘顶部施力使两块粘膜粘附在一起，待凝胶成胶后，调节天平，使天平两侧保持平衡。在天平左侧塑料瓶逐渐滴入纯水，直至右侧两块粘膜分开。记录塑料瓶里水的重量(W,g)。1KPa＝10.2g/cm2。重复测定3次，每次测量均更换肠粘膜。粘附力(KPa)＝W/(A×10.2)。测定结果如图2所示。
图2中的结果表明，重组人表皮细胞生长因子凝胶粘附力较低，为2.663±0.042KPa，泊洛沙姆水凝胶粘附力显著高于重组人表皮细胞生长因子凝胶(P＝0.000)，添加枸杞糖肽后，凝胶的粘附力降低(P＝0.000)，不同浓度的枸杞糖肽凝胶粘附力无明显区别(P>0.05)。但是，各组枸杞糖肽水凝胶的粘附力均显著高于重组人表皮细胞生长因子凝胶组。其中，图2中的实验结果，独立重复实验3次，定量数据用平均数±标准差(平均值±SD)表示。采用SPSS26.0软件行数据处理，两组数据比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.3本发明枸杞糖肽水凝胶的体外缓释曲线
将4mg枸杞糖肽粉末溶于2mL纯水，得2mg/mL枸杞糖肽溶液。取适量枸杞糖肽溶液，纯水稀释，制得25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、1000μg/mL梯度枸杞糖肽溶液，酶标仪289nm波长处检测吸光度。绘制枸杞糖肽标准曲线，得到枸杞糖肽标准曲线为Y＝0.0015X+0.0471，r＝0.9997。
配制人工唾液，将1mL枸杞糖肽凝胶均匀无气泡地缓缓加入西林瓶，37℃静置5min后缓缓沿瓶壁加入37℃预热的人工唾液。西林瓶置于37℃、100rpm的气温摇床，5min、10min、20min、40min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h后取1mL上部液体置于1.5mL离心管，再往西林瓶重新加入1mL人工唾液。将取出液体3000rpm离心5min，取200μL上清液加入96孔板，每个组3个复孔，人工唾液为空白对照组。酶标仪289nm检测吸光度，通过枸杞糖肽标准曲线计算药物缓释率。
结果如图3所示。实验结果表明，本发明3种浓度枸杞糖肽水凝胶在前2小时释放速度快，7小时释放接近100％。
2.4本发明枸杞糖肽水凝胶的生物相容性测定
按凝胶∶培养基＝1∶10的比例配制凝胶浸提液。取适量温敏凝胶加入离心管，待凝胶成胶后，缓慢加入37℃预热的十倍体积的1640培养基，离心管静置于37℃环境，24h后提取上清液，孔径为0.22μm的过滤器过滤后，添加青霉素与链霉素双抗使其终浓度为1％，添加血清使其终浓度为5％，制得凝胶浸提液培养基。
分5组：①空白对照组(加1640培养基)；②空白凝胶组；③1％枸杞糖肽温敏水凝胶组；④2％枸杞糖肽温敏水凝胶组；⑤3％枸杞糖肽温敏水凝胶组。20h HaCaT细胞(来自武汉大学中国典型培养物保藏中心)贴壁后，去除培养基，按分组添加700μL培养基或凝胶浸提液，每2天更换一次培养基。与HaCaT细胞共培养1、3、5天后，通过CCK-8和活细胞/死细胞染色检测枸杞糖肽凝胶生物相容性。
活细胞/死细胞染色的具体染色方法如下：(1)配制1×Assay Buffer：用去离子水将10×Assay Buffer稀释10倍；(2)配制染色液：取2μL Calcein-AM溶液和6μL PI溶液加入2mL 1×Assay Buffer，混匀；(3)细胞染色：去除孔板上层培养基，1×Assay Buffer轻轻冲洗2次，去净1×Assay Buffer，每个孔加入100μL染色液，孔板37℃孵育15min；(4)避光环境下，倒置荧光显微镜观察细胞染色情况并拍照。
实验结果如图4和图5A-图5C所示。CCK-8实验结果表明，在细胞培养1天、3天、5天后，与空白组相比，空白凝胶与3种浓度的枸杞糖肽凝胶浸提液对细胞活性无明显影响(P＞0.05)，凝胶基质与枸杞糖肽无细胞毒性。活细胞/死细胞染色实验结果表明，细胞不断增殖，在各时间段，各组细胞形态正常，呈梭形，细胞存活率高，死细胞较少。其中，凝胶促进细胞增殖或对细胞增殖无影响均能证明凝胶具有良好生物相容性。
实施例3：本发明枸杞糖肽水凝胶对口腔溃疡的防治作用研究
本研究所用动物为SPF级SD大鼠，体重160±20g，全身及口腔粘膜健康，由成都达硕实验动物有限公司提供。
3.1化学性口腔粘膜炎
3.1.1实验方法
模型的制备：SD大鼠10％水合氯醛腹腔注射水合氯醛溶液行全身麻醉。边长2mm2的正方形滤纸浸泡于35％冰乙酸溶液5min。棉签擦干大鼠下唇粘膜，将滤纸置于大鼠下唇粘膜，吸取滤纸多余冰乙酸溶液，避免其蔓延至周围，70s后移去滤纸，生理盐水棉签擦拭下唇粘膜。
将建模后的大鼠随机分成6组(n＝12)：①空白对照组：生理盐水棉签擦拭；②阳性对照组：重组人表皮生长因子凝胶组；③空白凝胶组；④1％枸杞糖肽温敏水凝胶组；⑤2％枸杞糖肽温敏水凝胶组；⑥3％枸杞糖肽温敏水凝胶组。
建模1天后开始给药，每天2次，早晚各一次。给药0、3、5、7、9天后称量每只大鼠的体重，数显游标卡尺测量口腔溃疡面积(mm2)(溃疡面积＝(d1/2)×(d2/2)×π，d1为溃疡最大直径，d2为溃疡最小直径)。给药5天、9天后每组颈椎脱臼法随机处死6只大鼠，取心、肝、脾、肺、肾脏，行HE染色。取大鼠下唇，保证粘膜炎创面完整，保留粘膜炎周围至少3mm正常组织，采用常规方法进行HE染色和TNF-α、IL-6、IL-10、bFGF免疫组化。
本研究采用的统计分析方法为采用SPSS 26.0软件行数据处理，定量数据用平均数±标准差(平均值±SD)表示，两组数据比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
3.1.2实验结果
大鼠建模后第1天以及给药5天和9天后的口腔溃疡情况分别如图6A和图6B所示。
溃疡面积结果如表3所示。建模1天后大鼠下唇粘膜出现溃疡，呈圆形，中央凹陷，表面覆盖黄色假膜，周围粘膜红肿，各组大鼠的溃疡面积均为13mm2，无明显差异(P＞0.05)。在给药后，枸杞糖肽凝胶组的溃疡面积始终小于空白对照组。给药5天后，枸杞糖肽凝胶组的溃疡面积显著小于空白对照组(P＜0.01)，尤其是3％枸杞糖肽凝胶组，溃疡面积最小，已经接近愈合；空白凝胶组溃疡面积为4.95±2.78mm2，小于空白对照组(6.72±3.11mm2)(P＜0.05)；重组人表皮生长因子凝胶组溃疡愈合速度与空白对照组无明显区别(P＞0.05)。9天后，空白组溃疡明显，仍有4.16±1.67mm2，2％与3％枸杞糖肽凝胶组溃疡已经全部愈合，空白凝胶组、1％枸杞糖肽凝胶组与重组人表皮生长因子组溃疡面积大小差异无统计学意义(P＞0.05)。
表3
Figure BDA0003603962460000131
注：①空白对照组；②重组人表皮生长因子凝胶组；③空白凝胶组；④1％枸杞糖肽温敏水凝胶组；⑤2％枸杞糖肽温敏水凝胶组；⑥3％枸杞糖肽温敏水凝胶组。以下表格同。与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01；与重组人表皮生长因子凝胶相比，#P<0.05，##P<0.01；与空白凝胶相比，△P<0.05，△△P<0.01；与1％枸杞糖肽温敏水凝胶相比，□P<0.05，□□P<0.01；与2％枸杞糖肽温敏水凝胶相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。
各组大鼠的体重结果如图7所示。结果表明，各组大鼠体重稳定增长，无大鼠死亡。各组大鼠内脏HE染色结果如图8A-图8B所示。结果表明，各脏器细胞形态正常，无水肿变性，无明显炎症浸润区，说明本发明枸杞糖肽水凝胶无毒性。
各组大鼠下唇HE染色结果如图9A-图9B所示。结果表明，给药5天后，3％枸杞糖肽凝胶组上皮破坏程度较小，基底细胞尚存，下方炎症细胞浸润，有纤维增生组织。其余组大鼠下唇上皮完整性破坏，深及固有层，固有层见大量炎症细胞浸润。给药9天后，各枸杞糖肽凝胶组上皮再生，上皮基本恢复完整性，下方有纤维增生组织。其余组大鼠下唇上皮完整性破坏，固有层仍有大量炎症细胞浸润，纤维组织增生。
各组大鼠下唇免疫组化染色照片如图10A-图10D所示，对各组大鼠TNF-α、IL-6、IL-10、bFGF免疫组化照片进行分析的结果如图11A-图11D所示。TNF-α：给药5天后，与空白对照组(0.163±0.009)相比，其余各组TNF-α表达量明显降低(P＜0.05)。2％枸杞糖肽凝胶组的TNF-α表达量最低，MOD值仅为0.041±0.021，明显低于重组人表皮生长因子凝胶组(0.086±0.028)(P＝0.009)。重组人表皮生长因子凝胶组、空白凝胶组、1％枸杞糖肽凝胶组3组的TNF-α量差异无统计学意义(P＞0.05)。2％、3％枸杞糖肽凝胶组的TNF-α表达量明显低于1％枸杞糖肽凝胶组(P＜0.01)。给药9天后，与空白对照组(0.119±0.012)相比，其余各组TNF-α表达量明显降低(P＝0.000)。2％、3％枸杞糖肽凝胶组的TNF-α表达量低于其余各组(P＜0.05)。重组人表皮生长因子凝胶组TNF-α表达量低于空白凝胶组(P＝0.023)，与1％枸杞糖肽凝胶组的TNF-α表达量差异无统计学意义(P＝0.751)。
IL-6：给药5天后，空白对照组(0.141±0.010)与重组人表皮生长因子凝胶组(0.124±0.017)IL-6表达量较高，明显高于枸杞糖肽凝胶组(P＜0.01)。2％、3％枸杞糖肽凝胶组的IL-6表达量明显低于1％枸杞糖肽凝胶组(P＜0.05)，2％、3％枸杞糖肽凝胶组的IL-6表达量差异无统计学意义(P＝0.338)。空白凝胶组(0.120±0.023)IL-6表达量也较高，和空白对照组、重组人表皮生长因子凝胶组差异无统计学意义(P＞0.05)。给药9天后，与其余组相比，2％枸杞糖肽凝胶组(0.027±0.007)、3％枸杞糖肽凝胶组(0.023±0.006)的IL-6表达量最低(P＜0.01)，两组间IL-6表达量无明显差别(P＝0.302)。1％枸杞糖肽凝胶组(0.051±0.010)IL-6表达量虽高于高浓度枸杞糖肽组，但仍低于空白对照组(0.086±0.027)和空白凝胶组(0.080±0.022)(P＜0.05)。空白对照组、重组人表皮生长因子凝胶组(0.062±0.016)、空白凝胶组的IL-6表达量仍处于较高水平，差异无统计学意义(P＞0.05)。
IL-10：给药5天后，与空白对照组(0.077±0.007)相比，各组IL-10表达量均增加(P＜0.05)，2％枸杞糖肽凝胶组IL-10表达量最高(P＜0.05)。1％枸杞糖肽凝胶组(0.111±0.029)与重组人表皮生长因子凝胶组(0.098±0.011)的IL-10表达量差异无统计学意义(P＝0.324)。空白凝胶组IL-10表达量明显低于重组人表皮生长因子凝胶组(P＝0.000)。给药9天后，各组IL-10表达量较第5天减少，2％枸杞糖肽凝胶组(0.087±0.014)、3％枸杞糖肽凝胶组(0.082±0.010)、重组人表皮生长因子凝胶组(0.073±0.013)IL-10表达量仍高于空白对照组(0.043±0.011)(P＜0.01)和空白凝胶组(0.044±0.011)(P＜0.01)。重组人表皮生长因子凝胶组与3种浓度的枸杞糖肽凝胶组IL-10表达量差异无统计学意义(P＞0.05)，3种浓度的枸杞糖肽凝胶组IL-10表达量无明显差别(P＞0.05)。
bFGF：给药5天后，重组人表皮生长因子凝胶组(0.078±0.012)与2％枸杞糖肽凝胶组(0.102±0.013)、3％枸杞糖肽凝胶组(0.078±0.013)bFGF表达量显著高于空白对照组(0.046±0.013)(P＜0.01)，其中2％枸杞糖肽凝胶组bFGF表达量最高(P＜0.01)。空白凝胶组与空白对照组bFGF表达量均处于较低水平，两组表达量无明显差别(P＝0.487)。给药9天后，各组bFGF表达量仍处于较高水平。重组人表皮生长因子凝胶组与枸杞糖肽凝胶组bFGF表达量仍高于空白对照组(0.056±0.0121)(P＝0.000)。2％枸杞糖肽凝胶组(0.122±0.013)bFGF表达量仍处于最高水平，高于其它组(P＜0.05)。空白凝胶组bFGF表达量与空白对照组无差异(P＝0.579)，低于重组人表皮生长因子凝胶组(P＝0.000)。
3.2放射性口腔粘膜炎
3.2.1实验方法
模型的制备：SD大鼠10％水合氯醛腹腔注射水合氯醛溶液行全身麻醉。将麻醉后的大鼠仰卧位置于直线加速器照射平台，调节放射区域，头部置于放射范围，以4Gy/min的放射线照射头部，总剂量10Gy，照射后1小时35％冰乙酸滤纸烧灼下唇粘膜70s。
将建模后的大鼠随机分成6组(n＝12)：①空白对照组：生理盐水棉签擦拭；②阳性对照组：重组人表皮生长因子凝胶组；③空白凝胶组；④1％枸杞糖肽温敏水凝胶组；⑤2％枸杞糖肽温敏水凝胶组；⑥3％枸杞糖肽温敏水凝胶组。
建模1天后开始给药，每天2次，早晚各一次。给药0、3、5、7、9天后称量每只大鼠的体重，数显游标卡尺测量口腔溃疡面积(mm2)(溃疡面积＝(d1/2)×(d2/2)×π，d1为溃疡最大直径，d2为溃疡最小直径)。给药5天、9天后每组颈椎脱臼法随机处死6只大鼠，取心、肝、脾、肺、肾脏，行HE染色。取大鼠下唇，保证粘膜炎创面完整，保留粘膜炎周围至少3mm正常组织，采用常规方法进行HE染色和TNF-α、IL-6、IL-10、bFGF免疫组化。
本研究采用的统计分析方法为采用SPSS 26.0软件行数据处理，定量数据用平均数±标准差(平均值±SD)表示，两组数据比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
3.2.2实验结果
大鼠建模后第1天以及给药5天和9天后的口腔溃疡情况分别如图12A和图12B所示。
溃疡面积结果如表4所示。建模1天后大鼠下唇粘膜出现溃疡，各组大鼠溃疡14mm2左右，无明显差别(P＞0.05)。在给药3、5、7、9天后，枸杞糖肽凝胶组溃疡面积均小于空白组。给药5天后，2％、3％枸杞糖肽凝胶组溃疡面积小于空白对照组、重组人表皮生长因子凝胶组、空白凝胶组(P＜0.05)；3％枸杞糖肽凝胶组溃疡面积最小，仅4.94±1.51mm2；空白对照组与空白凝胶组溃疡面积较大，差异无统计学意义(P＞0.05)。重组人表皮生长因子凝胶组在给药3、5、7后，溃疡面积小于空白组(P＜0.05)。在给药9天后，3种浓度的枸杞糖肽凝胶组溃疡面积显著小于其余各组(P＜0.01)。空白对照组、重组人表皮生长因子凝胶组与空白凝胶组溃疡明显，大小无统计学意义(P＞0.05)。
Figure BDA0003603962460000161
Figure BDA0003603962460000171
表4
注释与表3相同。
各组大鼠的体重结果如图13所示。结果表明，各组大鼠体重稳定增长，无大鼠死亡。各组大鼠内脏HE染色结果如图14A-图14B所示。结果表明，各脏器细胞形态正常，无水肿变性，无明显炎症浸润区，说明本发明枸杞糖肽水凝胶无毒性。
各组大鼠下唇HE染色结果如图15A-图15B所示。给药5天后，各组大鼠下唇粘膜上皮完整性破坏，上皮细胞与上皮钉突消失，固有层大量炎症细胞聚集。给药9天后，阳性对照组上皮完整性未恢复，但破坏程度较空白组小，下方仍有较多炎性细胞浸润；2％、3％枸杞糖肽凝胶组上皮再生，上皮完整性恢复，可见到基底细胞等正常上皮细胞；1％枸杞糖肽凝胶组上皮破坏面积较小，下方增生组织较少；空白对照组大鼠下唇粘膜上皮完整性破坏，固有层仍有大量炎症细胞浸润，纤维组织增生。
各组大鼠下唇免疫组化染色照片如图16A-图16D所示，对各组大鼠TNF-α、IL-6、IL-10、bFGF免疫组化照片进行分析的结果如图17A-图17D所示。TNF-α：给药5天后，枸杞糖肽凝胶组TNF-α表达量明显低于其余各组(P＜0.05)，3种浓度的枸杞糖肽TNF-α表达量无明显差别(P＞0.05)。空白对照组(0.094±0.024)、重组人表皮生长因子凝胶组(0.098±0.008)、空白凝胶组(0.088±0.023)TNF-α均处于较高水平，各组表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。给药9天后，2％、3％枸杞糖肽凝胶组TNF-α表达量均低于其余各组(P＜0.05)，两组间TNF-α无明显差别(P＝0.348)，表达量较第5天降低。重组人表皮生长因子凝胶组、空白凝胶组、1％枸杞糖肽凝胶组TNF-α表达量低于空白对照组(P＜0.05)，3组间表达量无明显区别(P＞0.05)。
IL-6：给药5天后，与对照组相比，3种浓度的枸杞糖肽凝胶组IL-6表达量明显较低(P＜0.01)，2％枸杞糖肽凝胶组IL-6表达量高于3％枸杞糖肽凝胶组(P＝0.012)，与1％枸杞糖肽凝胶组差异无统计学意义(P＝0.169)。重组人表皮生长因子凝胶组(0.106±0.017)、空白凝胶组(0.095±0.017)与空白对照组(0.103±0.026)IL-6表达量较高，3组间差异无统计学意义(P＞0.05)。给药9天后，空白对照组(0.102±0.026)IL-6表达量与给药5天(0.103±0.026)时无明显变化，重组人表皮生长因子凝胶组(0.054±0.017)与枸杞糖肽凝胶组IL-6表达量明显低于空白对照组(P＜0.01)，2％、3％枸杞糖肽凝胶组IL-6表达量低于其余各组(P＜0.05)，2％枸杞糖肽凝胶组(0.032±0.010)IL-6表达量与3％枸杞糖肽凝胶组(0.026±0.011)差异无统计学意义(P＝0.315)。
IL-10：给药5天后，2％、3％枸杞糖肽凝胶组IL-10表达量高于对照组(P＜0.05)，两组间IL-10表达量差异无统计学意义(P＝0.929)。其余组IL-10均处于较低水平，各组间IL-10表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。给药9天后，枸杞糖肽凝胶组IL-10表达量高于空白对照组与空白凝胶组(P＜0.05)，3种浓度的枸杞糖肽凝胶组IL-10表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。重组人表皮生长因子凝胶组IL-10也处于较高水平，MOD值为0.073±0.013，与枸杞糖肽凝胶组差异无统计学意义(P＞0.05)。空白对照组(0.060±0.006)、重组人表皮生长因子凝胶组(0.073±0.013)、空白凝胶组(0.059±0.014)间IL-10表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。
bFGF：给药5天后，2％枸杞糖肽凝胶组bFGF表达量明显高于其余组(P＜0.01)，枸杞糖肽凝胶组bFGF表达量均高于空白凝胶组(P＜0.05)。重组人表皮生长因子凝胶组bFGF表达量高于空白对照组(P＝0.046)。空白凝胶组、1％与3％枸杞糖肽凝胶组bFGF表达量与空白对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。1％枸杞糖肽凝胶组(0.080±0.014)与3％枸杞糖肽凝胶组(0.085±0.006)bFGF表达量差异无统计学意义(P＝0.414)。治疗9天后，枸杞糖肽凝胶组、重组人表皮生长因子凝胶组bFGF表达量明显高于空白对照组(P＜0.01)。3种浓度的枸杞糖肽凝胶组bFGF表达量无明显区别(P＞0.05)。重组人表皮生长因子凝胶组(0.092±0.007)bFGF表达量低于1％与3％枸杞糖肽凝胶组(P＜0.05)，高于空白凝胶组(P＝0.002)。
综上所述，从上面的实验结果可以看出，本发明成功构建出枸杞糖肽温敏水凝胶。该凝胶具有良好的温度敏感性与粘附性、生物相容性。凝胶药物缓释时间长达7h，符合临床口腔粘膜用药需求。本发明枸杞糖肽温敏水凝胶对大鼠无毒性，2％、3％枸杞糖肽凝胶能显著减少化学性口腔粘膜炎和放射性口腔粘膜炎局部TNF-α、IL-6的表达，促进IL-10和bFGF的表达，显著减轻化学性口腔粘膜炎和放射性口腔粘膜炎，缩短粘膜炎愈合时间，促进大鼠口腔粘膜炎和口腔溃疡的愈合。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.一种预防或治疗口腔溃疡的枸杞糖肽水凝胶，其特征在于：所述水凝胶中包含枸杞糖肽、凝胶基质、粘附性材料和水，所述水凝胶是温敏型水凝胶，所述水凝胶能够紧密粘附于口腔内部、包载活性成分并能够通过温度控制粘附，以重量体积百分比g/100 mL计，所述水凝胶中包含枸杞糖肽1-3%，凝胶基质20%，粘附性材料0.3%，所述凝胶基质是泊洛沙姆407，所述粘附性材料是羧甲基纤维素钠。
2.权利要求1所述的水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）称取适量凝胶基质溶于纯水，搅拌后置于4℃冰箱，48 h后，所述凝胶基质完全溶解，呈透明澄清的液体，制得30%凝胶基质溶液，所得凝胶溶液在4℃冰箱保存；
（2）称取适量粘附性材料溶于纯水，制得2%所述粘附性材料溶液；
（3）取适量步骤（2）中制备得到的2%所述粘附性材料溶液，加入适量纯水，使得所述粘附性材料溶液的终浓度为权利要求1中所需终浓度，再加入适量枸杞糖肽粉末，使得所述枸杞糖肽的终浓度为权利要求1中所需终浓度，最后加入适量步骤（1）中制备得到的30%凝胶基质溶液，使得所述凝胶基质溶液的终浓度为权利要求1中所需终浓度。
3.权利要求1所述的水凝胶或者采用权利要求2所述制备方法制备得到的水凝胶在制备预防或治疗口腔溃疡的药物中的用途，其特征在于：所述口腔溃疡是放射性口腔溃疡或化学刺激性口腔溃疡。
4.权利要求1所述的水凝胶或者采用权利要求2所述制备方法制备得到的水凝胶在制备预防或治疗口腔粘膜炎中的用途，其特征在于：所述口腔粘膜炎是放射性口腔粘膜炎或化学刺激性口腔粘膜炎。
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