CN114766595A - 一种饲料添加剂、制备方法及其在制备治疗伪狂犬病药物中的应用 - Google Patents

一种饲料添加剂、制备方法及其在制备治疗伪狂犬病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种饲料添加剂、制备方法及其在制备治疗伪狂犬病药物中的应用，属于饲料添加剂技术领域。本发明通过采用特定质量份数的生姜、大蒜、洋葱、香蕉皮和苦瓜作为原料，制得饲料添加剂，克服了现有技术中PV治疗效果不佳的问题。本发明原料成本较低，且容易获取，并意外发现该饲料添加剂具有治疗伪狂犬病的效果，不仅不会出现药物残留、没有细胞毒性，还能抑制PRV病毒的复制，在体外实验中具有抗伪狂犬(PRV)病毒的作用，为伪狂犬病的治疗提供了新思路。

Description

一种饲料添加剂、制备方法及其在制备治疗伪狂犬病药物中 的应用
技术领域
本发明涉及饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种饲料添加剂、制备方法及其在制备治疗伪狂犬病药物中的应用。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies，PR；又名Aujeszky's disease，AD)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的一种传染病。PRV是感染动物种类多和致病性强的一种病毒。除各种年龄的猪、牛都易感外，在自然条件下使羊、犬、猫、兔、鼠、水貂、狐等动物感染发病。实验动物中家兔、豚鼠、小鼠都易感。PRV属疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科，属于抵抗力较强的疱疹病毒，在物体表面和液体中可存活7d。在pH4～9之间保持稳定。
防治本病的疫苗包括灭活疫苗和弱毒疫苗。近年的趋势主要是发展弱毒疫苗，但是经过免疫的动物并不能完全抵制强毒感染和带毒排毒，带毒动物也因此成为潜在的感染源，给其它易感动物带来严重威胁。目前目前尚无治疗PR的有效药物，现有的抗疱疹病毒药物以西药为主，比较具有代表性的比如阿昔洛韦、利巴韦林等，但这些抗病毒药物在杀灭病毒的同时对宿主细胞有较大的毒副作用，并且在投入临床使用后，相继出现了耐药株以及药物残留等现象。
发明内容
本发明的目的在于提供一种饲料添加剂、制备方法及其在制备治疗伪狂犬病药物中的应用，以解决现有技术中PV治疗效果不佳的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种饲料添加剂，由包含如下质量份数的原料制备得到：
生姜15～25份、大蒜15～25份、洋葱15～25份、香蕉皮5～15份、苦瓜15～25份、水15～25份。
本发明还提供了一种上述饲料添加剂的制备方法，包含如下步骤：
将原料进行破碎，得到粉碎物料；
将粉碎物料与水混合，搅拌5～10天，得到混合物料；
将混合物料进行酶解，得到酶解物；
将酶解物静置12～15天，然后进行压榨，固液分离，收集液相组分；
将所述液相组分静置1～3天，收集上清液并调节浓度，即得饲料添加剂。
优选的，所述破碎的粒径为40～60目。
优选的，所述搅拌的转速为40～60r/min。
优选的，所述酶解采用淀粉酶，所述淀粉酶与混合物料的重量比为0.1～0.3g:1kg；
所述酶解采用的温度为55～60℃。
优选的，所述酶解的时间为5～10天，所述酶解伴随搅拌，所述搅拌的转速为40～60r/min。
优选的，所述饲料添加剂的浓度为3～15mg/ml。
本发明还提供了一种上述饲料添加剂在制备治疗伪狂犬病药物中的应用。
本发明的技术效果和优点：
本发明采用常见廉价的原料以特定配比制备成饲料添加剂，原料成本较低，且容易获取。并意外发现该饲料添加剂具有治疗伪狂犬病的效果，不会出现药物残留，不仅没有细胞毒性，还能抑制PRV病毒的复制，在体外实验中具有抗伪狂犬(PRV)病毒的作用，为伪狂犬病的治疗提供了新思路。本发明通过实验证实了所述饲料添加剂在6mg/mL浓度下对PK15细胞没有产生毒性，CC50值为15mg/mL；浓度为6mg/mL和15mg/mL的本发明饲料添加剂能减少PK15细胞内PRV病毒的复制情况，在安全浓度范围内，饲料添加剂浓度为6mg/mL时，能抑制PRV病毒IE180、UL18、UL54和UL21相关基因的复制，具有抗伪狂犬病毒的作用，EC50值为6mg/mL。
附图说明
图1为不同浓度各组细胞指数图①；
图2为不同浓度处理第60小时各组细胞指数统计图①；
图3为不同浓度各组细胞指数图②；
图4为不同浓度处理第60小时各组细胞指数统计图②；
图5为高内涵筛选结果统计图；
图6为第12小时免疫荧光值统计图；
图7为浓度为0mg/mL和15mg/mL饲料添加剂处理组的免疫荧光图；
图8为qRT-PCR实验测量的PRV病毒相关基因mRNA的表达量；
图9为处理3和6小时后IE180基因mRNA的表达水平；
图10为处理3和6小时后UL54基因mRNA的表达水平；
图11为处理3和6小时后UL18基因mRNA的表达水平；
图12为处理3和6小时后UL21基因mRNA的表达水平。
具体实施方式
本发明提供了一种饲料添加剂，由包含如下质量份数的原料制备得到：
生姜15～25份、大蒜15～25份、洋葱15～25份、香蕉皮5～15份、苦瓜15～25份。
在本发明中，所述饲料添加剂的原料包括生姜15～25份，优选为18～22份，进一步优选为19～21份。本发明对所述生姜的鲜嫩程度没有特殊要求，嫩姜或老姜均可。
在本发明中，所述饲料添加剂的原料包括大蒜15～25份，优选为16～24份，进一步优选为18～23份。本发明对所述大蒜的种类没有特殊要求，紫皮蒜或白皮蒜均可。
在本发明中，所述饲料添加剂的原料包括洋葱15～25份，优选为17～23份，进一步优选为18～22份。本发明对所述洋葱的种类没有特殊要求，紫皮洋葱、白皮洋葱或黄皮洋葱均可。
在本发明中，所述饲料添加剂的原料包括香蕉皮5～15份，优选为9～14份，进一步优选为10～12份。
在本发明中，所述饲料添加剂的原料包括苦瓜15～25份，优选为17～21份，进一步优选为19～20份。
在本发明中，所述饲料添加剂的原料包括水15～25份，优选为18～22份，进一步优选为19～21份，所述水优选为去离子水。
在本发明中，所述饲料原料优选舍弃霉变、腐烂、变质的原料，避免杂菌污染。
本发明还提供了一种上述饲料添加剂的制备方法，包含如下步骤：
将原料进行破碎，得到粉碎物料；
将粉碎物料与水混合，搅拌5～10天，得到混合物料；
将混合物料进行酶解，得到酶解物；
将酶解物静置12～15天，然后进行压榨，固液分离，收集液相组分；
将所述液相组分静置1～3天，收集上清液并调节浓度，即得饲料添加剂。
在本发明中，所述破碎的粒径优选为40～60目，进一步优选为42～48目。
在本发明中，所述粉碎物料与水混合优选在304不锈钢酶化罐中进行；所述粉碎物料与水混合后搅拌5～10天，优选为6～8天；所述搅拌的转速优选为40～60r/min，进一步优选为45～55r/min；所述搅拌优选在常温、常压条件下进行。
在本发明中，所述酶解优选采用淀粉酶，所述淀粉酶与混合物料的重量比优选为0.1～0.3g:1kg，进一步优选为0.15～0.25g:1kg；所述酶解采用的温度优选为55～60℃，进一步优选为57～58℃；所述酶解的时间优选为5～10天，进一步优选为6～9天；所述酶解过程中伴随搅拌，所述搅拌的转速优选为40～60r/min，进一步优选为45～55r/min。
在本发明中，所述酶解结束后将酶解物进行静置12～15天，优选为13～14天，在静置过程中，优选加入山梨酸钾以防止污染杂菌，山梨酸钾用量为100kg原料添加0.5kg山梨酸钾。
在本发明中，所述液相组分进行静置1～3天，优选为静置1.5～2.5天；所述饲料添加剂的浓度优选为3～15mg/ml，进一步优选为5～10mg/ml，制得后优选采用密封容器保存，常温备用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
挑选无霉变、腐烂、变质的原料，将生姜、大蒜、洋葱去皮，所有原料洗净、控干。
取处理后的生姜200g、大蒜200g、洋葱200g、香蕉皮100g、苦瓜200g，采用50目破碎机进行破碎，加入100ml水，转入304不绣钢酶化罐。
将物料以50r/min的速度，在常温、常压下连续搅拌7天，7天后加入0.15g淀粉酶混合搅拌，待酶解搅拌至第14天时，停止搅拌，静置14天，过程中防止污染杂菌。
将物料转入压榨机压榨，使其固液分离，将分离得到的液体转入储液罐，经过自然沉淀2天后取上清液，采用双蒸水调节浓度至6mg/ml，即得饲料添加剂，转入密封容器内，入库常温保存待用。
实施例2
挑选无霉变、腐烂、变质的原料，将生姜、大蒜、洋葱去皮，所有原料洗净、控干。
取处理后的生姜250g、大蒜150g、洋葱150g、香蕉皮50g、苦瓜150g，采用50目破碎机进行破碎，加入90ml水，转入304不绣钢酶化罐。
将物料以50r/min的速度，在常温、常压下连续搅拌10天，10天后加入0.11g淀粉酶混合搅拌，待酶解搅拌至第16天时，停止搅拌，静置15天，过程中防止污染杂菌。
将物料转入压榨机压榨，使其固液分离，将分离得到的液体转入储液罐，经过自然沉淀3天后取上清液，调节浓度至3mg/ml，即得饲料添加剂，转入密封容器内，入库常温保存待用。
实施例3
挑选无霉变、腐烂、变质的原料，将生姜、大蒜、洋葱去皮，所有原料洗净、控干。
取处理后的生姜1kg、大蒜1kg、洋葱1kg、香蕉皮500g、苦瓜1kg，采用50目破碎机进行破碎，加入500ml水，转入304不绣钢酶化罐。
将物料以50r/min的速度，在常温、常压下连续搅拌5天，5天后加入0.75g淀粉酶混合搅拌，待酶解搅拌至第15天时，停止搅拌，静置13天，过程中防止污染杂菌。
将物料转入压榨机压榨，使其固液分离，将分离得到的液体转入储液罐，经过自然沉淀2天后取上清液，调节浓度至10mg/ml，即得饲料添加剂，转入密封容器内，入库常温保存待用。
实验例1实验准备
取实施例1所得调节浓度之前的上清液，测定浓度为900mg/mL，测定浓度后使用0.22mm过滤膜进行过滤除菌，并在4℃冰箱中保存备用，在后续实验中以含胎牛血清的DMEM作为稀释缓冲液。
从液氮中取出PK15细胞(分离自华中农业大学实验室)冻存瓶后快速放进37℃恒温水浴箱内融解，放在水平离心机上1200rpm，离心5min。回到超净台缓慢掉倒掉液体，加入1mL的1×PBS重悬细胞，再放在水平离心机上1200rpm，离心5min。用1mL新的DMEM培养基重悬细胞沉淀。向25-cm2培养瓶中加入4mL的DMEM培养基，把冷冻瓶里的1mL培养基加入25-cm2瓶中，米字摇匀后放入培养箱中培养。PK15细胞在含有以下物质中培养：10％胎牛血清(FBS，Gibco)、50单位/mL青霉素和50μg/mL链霉素(Gibco)在37℃，5％CO2培养箱中。
本研究中使用PRV毒株(分离自华中农业大学实验室)。PK15细胞增值约为80％时加入PRV毒株稀释液。加入病毒三小时后，用1×PBS洗涤两次，再加入5mL含2％FBS的DMEM培养基。收集含有病毒的细胞在液氮中冻融三次后，4℃10000g离心15min。将病毒液分装，每管1mL，储存于-80℃冰箱保存备用。感染前一天将2×105个/ML的PK15细胞接种于96孔板中。在离心管中用培养基将PRV毒株液在DMEM中稀释连续10倍(10-1至10-10)。将不同稀释度病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8个孔重复，每孔接种100μL，设正常细胞对照组1纵排。将96plate放入37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。每天记录和观察细胞病变效应(cpe)，病毒滴度的计数采用Reed-muench方法。
数据采用T检验，不显著(P>0.05)、**(P<0.01)、***(P<0.001)、****(P<0.0001)。
实验例2细胞毒性检测
使用实时无标记细胞分析系统(RTCA)检测目的产品对细胞的毒性。在25-cm2瓶中PK15细胞长满80％-90％时，用1×PBS洗两遍，加入1mL的胰酶消化5min，然后加入3mL的培养基终止消化。收集细胞溶液到15mL的离心管中，1500g离心5min。接着加入2mL 1×PBS溶液混匀细胞沉淀，1500g离心5min。最后在超净台中用1ml含2％FBS的DMEM培养基重悬细胞。吸10μl的细胞溶液做细胞计数，确保铺在RTCA实验的细胞是1×105个/ml。以DMEM作为阴性对照，1×104个/100μlPK15细胞为阳性对照组。首先在每个孔中加入50μl含2％FBS的DMEM测基线，然后加入100μl细胞悬液(阴性对照组除外)。12小时后从RTCA机中取出16孔板，在超净台中加入不同浓度的饲料添加剂，分别是6mg/mL、60mg/mL、300mg/mL和600mg/mL，各设置三个孔重复，重新将E-plate 16放入RTCA Station，结果如图1～2所示(图1为不同浓度各组细胞指数图，图2为不同浓度处理第60小时各组细胞指数统计图)。浓度更换为3mg/mL、6mg/mL、15mg/mL和30mg/mL重复以上步骤，结果如图3～4所示(图3为不同浓度各组细胞指数图，图4为不同浓度处理第60小时各组细胞指数统计图)。
由图1～4可知，不同浓度的饲料添加剂处理组细胞指数存在显著差异，其中6mg/ml的饲料添加剂对PK15细胞没有产生毒性，根据半数安全浓度(CC50)的定义，该药物的CC50值为15mg/mL。
实验例3高内涵筛选
细胞以1×104个/150μl的密度接种到96孔板中，放入37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。设计一组对照组(加病毒)和四组试验组，每组设三个重复。以MOI为4的PRV 152-GFP毒株体外感染PK15细胞1h后加入不同浓度的饲料添加剂，它们分别是3mg/mL、6mg/mL、15mg/mL和30mg/mL。3h后换成新的DMEM培养基，弃掉未吸附的病毒。在高内涵分析系统上，每孔随机选定4个视野，然后实时收集视野中的病毒荧光数，用GraphPad Prism 6绘制图表，结果如图5所示；各组在第12小时免疫荧光值统计图如图6所示；浓度为0mg/mL和15mg/mL饲料添加剂处理组的免疫荧光图如图7所示。
由图5显示的数据进行的非线性回归分析确定饲料添加剂的EC50为6mg/mL；
由图6和图7可知，各组在第12小时免疫荧光值有显著差异性，浓度为6mg/mL和15mg/mL的饲料添加剂能减少PK15细胞内PRV病毒的免疫荧光数，证明PRV病毒在产品的作用下复制减少。
实验例4荧光定量PCR
接种2×106/600μl个细胞到24孔板中，放入37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。用1×PBS冲洗24孔板中的PK15细胞，设置两组实验组和对照组。第一组是加入浓度为6mg/mL药物9h后加入PRV 152-GFP毒株体外感染PK15细胞3h，对照组是以DMEM代替药物。第二组是加入浓度为6mg/mL药物6h后加入PRV 152-GFP毒株体外感染PK15细胞6h。两组实验均使用RNAiso Plus试剂纯化收集PK15细胞内的病毒。经DNase处理后，逆转录使用ReverTraAceqPCR RT MasterMix试剂盒(TOYOBO，上海，中国)。以Swine-29作为内参基因，使用2-△△Ct方法计算相对mRNA表达。根据Genebank设计qPCR的引物序列如下表1所示：
表1引物序列
Figure BDA0003623756850000081
经检测，本发明饲料添加剂抗伪狂犬病毒相关基因表达情况如图8～12所示，图8为qRT-PCR实验测量的PRV病毒相关基因mRNA的表达量；图9为本发明饲料添加剂处理3和6小时后IE180基因mRNA的表达水平；图10为本发明饲料添加剂处理3和6小时后UL54基因mRNA的表达水平；图11为本发明饲料添加剂处理3和6小时后UL18基因mRNA的表达水平；图12为本发明饲料添加剂处理3和6小时后UL21基因mRNA的表达水平。
由图8～12可知，在mRNA水平上，本发明饲料添加剂能使PRV的相关基因的表达量降低，说明其在体外实验中具有抗伪狂犬(PRV)病毒的作用，根据半数最大效应浓度(EC50)的定义，该产品的EC50值为6mg/mL，与上文相符合。
由以上实施例可知，本发明提供了一种饲料添加剂，在6mg/mL浓度下对PK15细胞没有产生毒性，CC50值为15mg/mL；浓度为6mg/mL和15mg/mL的本发明饲料添加剂能减少PK15细胞内PRV病毒的复制情况，在安全浓度范围内，饲料添加剂浓度为6mg/mL时，能抑制PRV病毒IE180、UL18、UL54和UL21相关基因的复制，具有抗伪狂犬病毒的作用，EC50值为6mg/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 武汉世纪迈得生命科技有限公司
任辛
<120> 一种饲料添加剂、制备方法及其在制备治疗伪狂犬病药物中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggccgaaac gatctcaacc 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccgggcttc ttacccatt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcagctaca ccctcgtcc 19
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaaaacagg tggttgcagt aaa 23
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcagctgttt cgggcgc 17
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
attgaggacg atggagatgt tgg 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggtgctgaa catgatcttc c 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggatgagcga cagcaggat 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
catcgtgctg gacaccatcg ag 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
catcgtgctg gacaccatcg ag 22

Claims (8)

1.一种饲料添加剂，其特征在于，由包含如下质量份数的原料制备得到：
生姜15～25份、大蒜15～25份、洋葱15～25份、香蕉皮5～15份、苦瓜15～25份、水15～25份。
2.权利要求1所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
将原料进行破碎，得到粉碎物料；
将粉碎物料与水混合，搅拌5～10天，得到混合物料；
将混合物料进行酶解，得到酶解物；
将酶解物静置12～15天，然后进行压榨，固液分离，收集液相组分；
将所述液相组分静置1～3天，收集上清液并调节浓度，即得饲料添加剂。
3.根据权利要求2所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述破碎的粒径为40～60目。
4.根据权利要求3所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述搅拌的转速为40～60r/min。
5.根据权利要求4所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述酶解采用淀粉酶，所述淀粉酶与混合物料的重量比为0.1～0.3g:1kg；
所述酶解采用的温度为55～60℃。
6.根据权利要求5所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述酶解的时间为5～10天，所述酶解伴随搅拌，所述搅拌的转速为40～60r/min。
7.根据权利要求6所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述饲料添加剂的浓度为3～15mg/ml。
8.权利要求1所述的饲料添加剂或权利要求2～7任一项所述的制备方法制得的饲料添加剂在制备治疗伪狂犬病药物中的应用。
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Title
孙丽红，等, 上海科学技术出版社 *

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