CN114748693A - 一种共交联联合双键交联制备生物瓣膜材料的方法及生物瓣膜材料 - Google Patents

一种共交联联合双键交联制备生物瓣膜材料的方法及生物瓣膜材料 Download PDF

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Abstract

本申请公开一种共交联联合双键交联制备生物瓣膜材料的方法及生物瓣膜材料，(1)将生物材料浸泡于含功能单体的溶液中进行物理渗透；所述功能单体具有至少一个碳碳双键和至少一个与醛基反应的基团；(2)向步骤(1)的体系中加入醛基交联剂，进行共交联；(3)将经步骤(2)处理后的生物材料与引发剂接触，引发双键聚合。本申请的方法在醛基交联时引入功能单体进行共交联，共交联的同时引入碳碳双键，作为二次交联的基础，通过两次交联制备交联生物材料，可提高生物材料的交联度，改善生物材料的机械性能。

Description

一种共交联联合双键交联制备生物瓣膜材料的方法及生物瓣 膜材料
技术领域
本申请涉及介入材料技术领域，具体涉及一种共交联联合双键交联制备生物瓣膜材料的方法及制备得到的生物瓣膜材料。
背景技术
生物心脏瓣膜通常采用猪或牛的心包膜制备而成，用于替换功能缺损的人体自有心脏瓣膜；生物心脏瓣膜相比于机械心脏瓣膜有很多优点：生物心脏瓣膜植入后患者不需要长期服用抗凝药、生物心脏瓣膜可以采用微创介入的手术方式，这些优点使得生物心脏瓣膜在临床应用当中逐步成为市场主流。
当前市场上的生物瓣膜产品几乎全部是采用戊二醛进行交联制备而成，戊二醛可以交联心包膜当中的胶原蛋白，但是，戊二醛交联的生物瓣膜存在着不容忽视的血栓问题，严重威胁着患者的生活质量及生命。
戊二醛交联仍是当前生物瓣膜产品的主流方法，因此，开发在戊二醛交联基础上改善生物瓣膜产品性能，对于科学研究以及相关产业领域的发展具有重大意义。
发明内容
本申请提供一种共交联联合双键交联制备生物瓣膜材料的方法及制备得到的生物瓣膜材料，改善生物瓣膜材料的抗钙化和抗凝血性能。
一种共交联联合双键交联制备生物瓣膜材料的方法，包括：
(1)将生物材料浸泡于含功能单体的溶液中进行物理渗透；所述功能单体具有至少一个碳碳双键和至少一个与醛基反应的基团；
(2)向步骤(1)的体系中加入醛基交联剂，进行共交联；
(3)将经步骤(2)处理后的生物材料与引发剂接触，引发双键聚合。
可选的，所述醛基交联剂为戊二醛或甲醛。
可选的，步骤(1)中所述溶液的溶剂为水、生理盐水、pH中性缓冲液或乙醇的水溶液；所述溶液中功能单体的浓度为10～100mM；浸泡时间为2～20h；
可选的，所述交联剂的浓度为10～800mM；共交联时间为10～30h。
可选的，步骤(3)中：将引发剂加入前步处理的体系中；或将前步处理后的生物材料清洗后再浸泡于含引发剂的溶液中。
可选的，所述引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠的混合物，所述过硫酸铵和亚硫酸氢钠的浓度分别为10～100mM；或
所述引发剂为过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基乙二胺的混合物，所述过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基乙二胺的质量百分浓度分别为2％～5％和0.2％～0.5％。
可选的，在步骤(3)之前还包括步骤(2M)：将经步骤(2)处理后的生物材料浸泡于含功能单体的溶液中，消除残留醛基；所述功能单体具有至少一个与醛基反应的基团。
可选的，步骤(2M)中，所述溶液的溶剂为水、生理盐水、pH中性缓冲液或乙醇的水溶液；所述溶液中功能单体的浓度为10～100mM；浸泡时间为2～48h。
可选的，步骤(1)和步骤(2M)中所述与醛基反应的基团各自独立地选自氨基、酰肼中的一种。
可选的，步骤(1)和步骤(2M)中所述功能单体各自独立地选自DL-2-氨基-4-戊烯酸2-甲基烯丙胺、3-丁烯-1-胺、戊-4-烯-1-胺、甲基丙烯酸2-氨基乙酯、甲基丙烯酰肼、丙烯酰肼、双键化多聚赖氨酸中的一种。
本申请还提供一种双键交联生物瓣膜材料，由所述的方法制备得到。
本申请还提供一种生物瓣膜，包括支架和瓣膜，所述瓣膜为所述的双键交联生物瓣膜材料制成。
可选的，所述生物瓣膜为心脏瓣膜。
与现有技术相比，本申请至少具有如下有益效果之一：
(1)本申请的方法在醛基交联时引入功能单体进行共交联，共交联的同时引入碳碳双键，作为二次交联的基础，通过两次交联制备交联生物材料，可提高生物材料的交联度，改善生物材料的机械性能。
(2)本申请在共交联过程中，功能单体引入双键的同时也可封闭生物材料上的部分残留醛基，改善生物材料的抗钙化和抗凝血性能，同时也可进一步提高交联效率。
附图说明
图1为本申请一种较优选实施方式的工艺流程图；
图2为本申请一种较优选实施方案的反应原理图；
图3为本申请另一种较优选实施方案的反应原理图；
图4为实施例1的样品1与对照组1心包膜(GA)的红外光谱图；
图5为实施例1的样品1与对照组2心包膜(GA)乳酸脱氢酶检测结果图；
图6为实施例1的样品1与对照组1心包膜(GA)大鼠皮下植入后挂钙量检测结果图；
图7为实施例2的样品2与对照组2心包膜(GA)水接触角结果图；
图8为实施例2的样品2与对照组2心包膜(GA)乳酸脱氢酶检测以及溶血率结果图；
图9为实施例2的样品2与对照组2心包膜(GA)钙离子浓度结果图；
图10为实施例3的基本原理图；
图11为对照组3切片的茜素红染色结果图；
图12为样品3大鼠皮下植入后切片的茜素红染色结果图；
图13为样品4大鼠皮下植入后切片的茜素红染色结果图；
图14为样品5大鼠皮下植入后切片的茜素红染色结果图；
图15为样品6大鼠皮下植入后切片的茜素红染色结果图；
图16为样品7大鼠皮下植入后切片的茜素红染色结果图；
图17为样品8大鼠皮下植入后切片的茜素红染色结果图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
当前市场上的生物瓣膜产品几乎全是采用戊二醛进行交联制备而成，戊二醛可以交联心包膜当中的胶原蛋白，但是，戊二醛交联的生物瓣膜存在着不容忽视的血栓问题，严重威胁着患者的生活质量及生命。本申请在戊二醛交联基础上通过交联手段的改进，改善戊二醛交联膜的机械性能、抗钙化及抗凝血性能。
本申请改进的交联方案中，在戊二醛交联前引入带有碳碳双键和与醛基反应基团的功能单体，该功能单体先物理渗透进入生物材料，然后与醛基交联剂进行共交联，共交联过程中，功能单体与生物材料上的残留醛基反应，将碳碳双键引入生物材料中，再引发双键聚合，发生二次交联，完成生物材料的交联处理，二次交联后的生物材料还可带有功能性基团，进一步改善生物膜的生物相容性等。
具体的，包括：
(1)将生物材料浸泡于含功能单体的溶液中进行物理渗透；所述功能单体具有至少一个碳碳双键和至少一个与醛基反应的基团；
(2)向步骤(1)的体系中加入醛基交联剂，进行共交联；
(3)将经步骤(2)处理后的生物材料与引发剂接触，引发双键聚合。
本申请的原理：
第一步：功能单体先物理渗透进入生物材料中，引入的功能单体带有碳碳双键和与醛基反应的基团(如氨基)，功能单体充分渗透后加入醛基交联剂(如戊二醛)，进行共交联，共交联过程中，所发生的反应至少包括：
1)一部分交联剂两端的醛基均与生物材料的氨基反应；2)一部分交联剂其中一端的醛基与生物材料的氨基反应、另一端的醛基与功能单体的氨基反应；3)一部分交联剂其中一端的醛基与生物材料的氨基反应，另一端的醛基在生物材料上形成残留醛基；4)部分残留醛基与功能单体的氨基反应，将碳碳双键引入生物材料。
第二步：完成交联并引入碳碳双键的生物材料与含引发剂的溶液接触，引发双键聚合，发生二次交联。
本申请的交联剂采用当前主流交联方法所用的醛基交联剂，可选的，所述醛基交联剂可选择戊二醛、甲醛中的一种。
本申请所采用的生物材料为现有戊二醛交联工艺中常规的生物材料。所述生物材料的胶原含量为60％～90％。所述生物材料为动物组织，动物来源为猪、牛、马或羊，包括心包膜、瓣膜、肠膜、脑膜、肺膜、血管、皮肤或韧带的一种或多种。
较为优选的实施方式中，可选的，在步骤(3)之前还包括步骤(2M)：将经步骤(2)处理后的生物材料浸泡于含功能单体的溶液中，消除剩余部分的残留醛基；该步骤的功能单体具有至少一个与醛基反应的基团。进一步可选的，该步骤的功能单体还具有至少一个碳碳双键，再次用功能单体溶液处理生物材料时，通过功能单体上的氨基与生物材料上的残留醛基反应，封闭剩余残留醛基的同时再次引入碳碳双键，增加用于后续双键聚合的碳碳双键基数，有利于提高交联度。
本申请步骤(1)中的功能单体具有至少一个与醛基反应的基团，在共交联过程中，功能单体通过该基团与生物材料上的残留醛基反应，将碳碳双键引入生物材料中；可选的，步骤(1)中所述与醛基反应的基团包括但不限于氨基和酰肼。
步骤(2M)中的功能单体具有至少一个与醛基反应的基团，通过该基团与生物材料上的残留醛基反应，消除残留醛基。可选的，步骤(2M)中所述与醛基反应的基团包括但不限于氨基和酰肼。
即，步骤(1)和步骤(2M)中所述与醛基反应的基团各自独立地选自氨基和酰肼中的一种，可相同也可不同。
满足带有至少一个氨基和至少一个碳碳双键的功能单体的一种方案中，可直接采用市购产品，可选的，步骤(1)和步骤(2M)中所述功能单体各自独立地选自DL-2-氨基-4-戊烯酸、2-甲基烯丙胺、3-丁烯-1-胺、戊-4-烯-1-胺、甲基丙烯酸2-氨基乙酯、甲基丙烯酰肼和丙烯酰肼中的至少一种。
另一种方案中，所需功能单体还可以通过双键改性制备，例如双键化多聚赖氨酸。
步骤(1)和步骤(2M)中所述功能单体各自独立地选自上述可选范围(包括市购和改性制备)，可相同也可不同。
双键化改性透明质酸的一种实施方案，包括：
称取2g分子量为10000的透明质酸钠，并使用20ml PBS溶解，再依次加入6-12ml甲基丙烯酸缩水甘油酯以及4-8ml三乙胺。在37℃摇床上放置5-10天。最后使用截留分子量为5000的透析袋透析5-7天，冷冻干燥得到双键化的透明质酸(根据实际需要可以等比例放大制备)；
双键化改性透明质酸的一种实施方案，包括：
将多聚赖氨酸溶解在去离子水中，然后以1：1.5-1：5(甲基丙烯酸缩水甘油酯：氨基)的摩尔比加入甲基丙烯酸缩水甘油酯。将混合物在37℃摇床上放置5-10天。最后使用截留分子量为1000的透析袋透析5-7天，冷冻干燥得到部分双键化的多聚赖氨酸。
本申请的生物材料在引入功能单体前，需先进行常规的预处理，可选的，所述预处理包括常规的清洗操作：获取生物材料，并于4℃低温湿润状态下保存；将新鲜的生物材料采用柔和摩擦和流体压力在4℃、100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，直至没有可见的粘附的非心包或非胶原组织，同时通过渗压休克实现对心包组织有效脱细胞。
预处理后的生物材料与含功能单体的溶液接触，可选的，所述接触过程可为静态接触也可为动态接触；采用静态接触时，将生物材料置于含功能单体的溶液中浸泡即可；动态接触时可在浸泡的过程中摇床震动。与功能单体接触过程中，温度在20～50℃均可，优选的，接触过程终温度无需特别控制，室温环境均可，以不超过人体适应温度为宜，优选在36～37℃进行。
步骤(1)中功能单体的浓度以及生物材料与含功能单体溶液的接触时间以保证更多的功能单体渗透进入生物材料中为宜，一般地，功能单体的浓度较高、相应的接触时间可较短，功能单体的浓度较低、相应的接触时间适应延长。
可选的，步骤(1)中所述溶液的溶剂为水、生理盐水或pH中性缓冲液或乙醇的水溶液其中，乙醇的水溶液中，乙醇和水可按任意比例混合，常用为50％左右乙醇；所述溶液中功能单体的浓度为10～100mM。
可选的，在功能单体浓度为10～100mM条件下，浸泡时间为2～20h，确保功能单体充分渗透进入生物材料。
进一步可选的，步骤(1)中所述溶液中功能单体的浓度为10～30mM，浸泡时间为2～5h。
功能单体渗透后，向反应体系中加入交联剂，可选的，所述交联剂的浓度为10～800mM。
共交联过程中，温度在20～50℃均可，优选的，所述共交联过程中温度无需特别控制，室温环境均可，以不超过人体适应温度为宜，可选的，在36～37℃进行；所述共交联的反应时间以交联反应尽量彻底为宜，可选的，在交联剂浓度为10～800mM条件下，共交联时间为10～30h。
进一步可选的，步骤(2)中交联剂的浓度为50～150mM，共交联时间为20～30h。
可选的，所述共交联过程中接触过程可为静态接触也可为动态接触，动态接触过程可选择在浸泡的同时震荡反应体系，加快交联进程。
步骤(2M)中功能单体的浓度及浸泡时间以更多的封闭残留醛基为宜，可选的，步骤(2M)中，所述溶液中功能单体的浓度为10～100mM；浸泡时间为2～48h。
进一步可选的，步骤(2M)中，所述溶液中溶剂为水、生理盐水、pH中性缓冲液或乙醇的水溶液其中，乙醇的水溶液中，乙醇和水可按任意比例混合，常用为50％左右乙醇；所述溶液中功能单体的浓度为10～30mM；浸泡时间为3～8h。
该步骤(2M)中，将经步骤(2)处理后的生物材料清洗后再浸泡于功能单体溶液中；或将经步骤(2)处理后的生物材料直接转移至功能单体溶液中。
该步骤(2M)中，在20～50℃下进行均可，优选的，浸泡温度无需特别控制，室温环境均可，以不超过人体适应温度为宜，优选在36～37℃进行。
本申请在完成共交联后，生物材料中引入了碳碳双键，进一步地，引发碳碳双键聚合，完成二次交联。
本申请在共交联完成后再通过双键聚合完成二次交联，一种可选的方案中，在所述共交联完成后直接引发双键聚合。该方案俗称一锅法，即在共交联完成后直接向反应体系中加入引发剂，无需将生物材料取出清洗的过程。
另一种可选的方案中，还包括共交联完成后清洗生物材料的步骤。该方案中，共交联后取出生物材料，对生物材料进行清洗操作，去除残余功能单体、交联剂等，再浸泡于含引发剂的溶液中。
在增设步骤(2M)的优选方案中，向步骤(2M)浸泡后的体系中直接加入引发剂；或将步骤(2M)浸泡后的生物材料清洗后再浸泡于含引发剂的溶液中。
一种可选的引发方案中，所述引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠的混合物；所述过硫酸铵和亚硫酸氢钠的浓度分别为10～100mM；进一步地，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的浓度分别为20～40mM。另一种可选的引发方案中，所述引发剂为过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基乙二胺的混合物；所述溶液中过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基乙二胺的质量百分浓度分别为2％–5％和0.2％-0.5％。
可选的，所述含引发剂的溶液中溶剂为水、生理盐水或pH中性缓冲液。
如前所述的引发剂的浓度，在一锅法中，该浓度可以理解为硫酸铵和亚硫酸氢钠在步骤(2)反应体系所含溶液中的浓度，在分步法中，该浓度可以理解为含引发剂的溶液中的浓度。
可选的，双键聚合过程在20～50℃下进行均可，优选的，温度无需特别控制，室温环境均可，以不超过人体适应温度为宜，优选在36～37℃进行。双键聚合时间以2～48h为宜，优选20～25h。
可选的，还包括双键聚合结束后的后处理过程，所述后处理包括常规的清洗、柔顺、干燥等操作。
对于制备湿膜的需求，甘油柔顺处理后溶剂保存即可，例如可采用甘油保存。对于制备干膜的需求，甘油柔顺处理后再对生物材料进行干燥处理：干燥过程为室温干燥、鼓风干燥、真空干燥、冷冻干燥中的一种或几种组合方式。干燥时间为1h～10天，室温干燥温度为10℃～30℃，鼓风干燥或真空干燥温度为15℃～100℃，冷冻干燥温度为-20℃～-80℃。
以下以图1所示的流程为例对本申请的工艺流程进行简要说明：
步骤一，摘取生物瓣膜材料，对生物瓣膜材料进行常规的预处理操作；
步骤二，功能单体(氨基-双键化合物)溶液浸泡生物材料；
步骤三，向步骤二的反应体系中加入交联剂(戊二醛)，对功能单体(氨基-双键化合物)和生物瓣膜材料进行共交联，引入自由基(碳碳双键)；
步骤四，将经步骤三处理后的生物材料再次浸泡于功能单体溶液中。
步骤五，引发自由基聚合的二次交联。
步骤六，二次交联后对生物材料进行清洗、甘油处理，干态或湿态保存生物瓣膜。
在一些优选的方案中，还包括在共交联步骤和二次聚合步骤之间二次引入碳碳双键的步骤，包含二次引入碳碳双键的方案的一种实施方案中，包括如下步骤：
S1、获取生物材料，并于4℃低温湿润状态下保存；
S2、将步骤S1中的生物材料采用柔和摩擦和流体压力在4℃、100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，直至没有可见的粘附的非心包或非胶原组织；
S3、然后将步骤S2清洗后的生物材料浸泡于摩尔浓度为10-100mM的DL-2-氨基-4-戊烯酸水溶液中，在37℃条件下浸泡12小时，确保DL-2-氨基-4-戊烯酸充分的物理渗透；
S4、向步骤S3处理后的生物材料所浸泡的溶液中加入戊二醛发生共聚合，溶液体系中的戊二醛摩尔浓度为10-500mM，在37℃条件下反应24小时。
S5、向步骤S4处理后的生物材料用蒸馏水浸泡清洗，清除没有反应的DL-2-氨基-4-戊烯酸和戊二醛。
S6、将步骤S5处理后的生物材料浸泡于5％的聚乙二醇二丙烯酸酯的水溶液中，在37℃条件下浸泡12小时，确保聚乙二醇二丙烯酸酯充分的物理渗透。
S7、将步骤S6处理后的生物材料加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠引发剂引发，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的摩尔浓度为10-100mM。
该实施方案的化学原理示意图如图2所示。
该实施方式中，在步骤S3中，采用DL-2-氨基-4-戊烯酸/戊二醛/心包膜共交联引入可自由基聚合烯丙基的方法相比于文献已报道的类似研究具有更高的引入可自由基聚合基团的效率，且本方案在引入烯丙基基团的同时，可以进一步提高心包膜的交联度。
包含二次引入碳碳双键的方案的另一种实施方案中，包括如下步骤：
S1、获取生物材料，并于4℃低温湿润状态下保存；
S2、将步骤S1中的生物材料采用柔和摩擦和流体压力在4℃、100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，直至没有可见的粘附的非心包或非胶原组织，同时通过渗压休克实现对心包组织有效脱细胞；
S3、称取2g分子量为10000的透明质酸钠，并使用20ml PBS溶解，再依次加入6-12ml甲基丙烯酸缩水甘油酯以及4-8ml三乙胺。在37℃摇床上放置5-10天。最后使用截留分子量为5000的透析袋透析5-7天，冷冻干燥得到双键化的透明质酸(根据实际需要可以等比例放大制备)；
S4、将多聚赖氨酸溶解在去离子水中，然后以1：1.5-1：5(甲基丙烯酸缩水甘油酯：氨基)的摩尔比加入甲基丙烯酸缩水甘油酯。将混合物在37℃摇床上放置5-10天。最后使用截留分子量为1000的透析袋透析5-7天，冷冻干燥得到部分双键化的多聚赖氨酸；
S5、将S2中的心包膜浸泡于S4中制备的部分双键化的多聚赖氨酸(摩尔浓度为100mM-500mM)水溶液1-3天，确保其达到接近饱和的物理渗透，从而尽可能多地引入部分双键化的多聚赖氨酸，然后向水溶液中加入戊二醛至其质量浓度为2.5％。
S6、将步骤S5处理后的生物材料与S3中制备的双键化透明质酸在过硫酸铵以及/N,N,N',N'-四甲基乙二胺的引发下进行自由基共聚反应，使用的双键化透明质酸浓度为20mg/ml-60mg/ml。置于37℃下反应12-24小时；
S7、最后用蒸馏水浸泡清洗，将清除没有接枝上的双键化透明质酸。
该实施方案中，透明质酸以及多聚赖氨酸的改性示意图和部分双键化多聚赖氨酸修饰心包膜以及双键化透明质酸自由基聚合原理示意图如图3所示。
该优选实施方案与已经报道的类似心包膜多糖亲水处理研究的对比，优点包括：
1)采用甲基丙烯酸化的多聚赖氨酸/戊二醛/心包膜共同交联的同时引入可自由基聚合的甲基丙烯基，与其他已经报道的方法(先将心包与戊二醛反应，然后利用残基引入双键)相比，本方法具有更高的引入双键的效率；
2)本研究策略是采用双重交联，包括戊二醛交联和自由基聚合交联，材料交联度较高；
3)与大部分使用多糖进行表界面亲水改性的研究相比，本方法中透明质酸与心包材料的结合方式为化学共价结合，具有更高的稳定性。
综上所述，该方案中利用甲基丙烯酸缩水甘油酯分别对多聚赖氨酸以及透明质酸进行修饰得到部分双键化的多聚赖氨酸和双键化的透明质酸，随后在戊二醛的作用下对心包膜和部分双键化的多聚赖氨酸(同时具备氨基和双键)进行共聚交联以同时实现心包膜的交联和双键化修饰。最后利用双键化的戊二醛瓣膜与双键化的透明质酸自由基共聚得到透明质酸改性的戊二醛心包材料。
上述方法制备得到的生物瓣膜材料，可以用于介入生物瓣膜，例如通过微创介入；也可用于外科生物瓣膜，例如通过外科手术植入。
作为介入生物瓣膜的一种实现形式，包括支架和瓣膜，瓣膜为上述方法制备得到的生物瓣膜材料。瓣膜可采用缝缀等方式固定于支架，根据功能需要一般可包括用于控制血流的瓣叶以及覆着在支架内壁或外壁的覆膜。
一种更具体的实施形式，生物瓣膜可以是心脏瓣膜。心脏瓣膜可以是通过导管介入或外科手术植入。作为介入方式其支架一般为径向可形变的网筒结构。
用于微创介入时，介入系统包括心脏瓣膜和输送管，心脏瓣膜经输送管输送。
以下以具体的实施例为例进行进一步说明：
实施例1
在本实施例中，新鲜采集的猪心包于4℃100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在30mM DL-2-氨基-4-戊烯酸水溶液在37℃当中12小时，然后加入戊二醛使其浓度为100mM，在37℃，100RPM转速振荡条件之下浸泡24小时后，采用蒸馏水进行清洗。清洗后浸泡于5％的聚乙二醇二丙烯酸酯的水溶液中，在37℃条件下浸泡12小时，确保聚乙二醇二丙烯酸酯充分的物理渗透，加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠引发剂引发，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的摩尔浓度均为40mM，在37℃条件下反应24小时，记为样品1。
在处理过程中，设置戊二醛处理组为对照组1，即将心包膜浸泡于0.625％的戊二醛当中24小时。
实施例1以及戊二醛对照组1乳酸脱氢酶相对活性的分析结果如表1所示，挂钙量如表2所示。
表1
乳酸脱氢酶相对活性
戊二醛对照组1 0.410±0.072
实施例 0.100±0.019
表2
挂钙量μg/mg
戊二醛对照组1 168.595±9.973
实施例 43.220±10.873
样品1和对照组1样品的心包膜(GA)的红外光谱图如图4所示；样品1和对照组1样品的心包膜(GA)大鼠皮下植入后弹性蛋白定量结果示意图人如图5所示；样品1和对照组1样品的心包膜(GA)大鼠皮下植入后挂钙量检测示意图如图6所示。
实施例2
改性透明质酸的制备：称取2g分子量为10000的透明质酸钠，并使用20ml PBS溶解，再依次加入6.5ml甲基丙烯酸缩水甘油酯以及4.5ml三乙胺。在37℃摇床上放置7天。最后使用截留分子量为5000的透析袋透析7天，冷冻干燥得到双键化的透明质酸；
改性多聚赖氨酸的制备：将多聚赖氨酸溶解在去离子水中，然后以(1：1.5)的摩尔比加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(甲基丙烯酸缩水甘油酯：氨基)。将混合物在37℃摇床上放置7天。最后使用截留分子量为1000的透析袋透析7天，冷冻干燥得到部分双键化的多聚赖氨酸；
在本实施例中，新鲜采集的猪心包于4℃100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在180mM改性多聚赖氨酸水溶液在室温当中12小时，然后加入戊二醛溶液至质量浓度为2.5％，在37℃摇床上反应24小时，取出心包材料清洗后浸泡在50mg/ml改性透明质酸水溶液在室温当中12小时，然后采用2.5％过硫酸铵和0.25％N,N,N',N'-四甲基乙二胺在37℃下浸泡12小时，最后采用蒸馏水进行清洗，记为样品2。
对实施例2制备的样品2与对照组2样品分别进行水接触角测试、乳酸脱氢酶活性测试、溶血率测试以及钙化测试。
对照组2：将新鲜采集的猪心包于4℃100RPM转速振荡条件下用蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在质量浓度为0.625％戊二醛溶液中24小时，反应完成后取出浸泡在质量分数为0.2％的戊二醛溶液中保存。
(1)水接触角测试
将对照组2与实施例1材料裁剪成1*1cm的方片，放在两片玻璃片中间压平，真空冷冻干燥后进行水接触角测试。
(2)乳酸脱氢酶活性测试：采集新鲜兔血，1500rpm离心15min，获得富血小板血浆。将对照组以及实施例1材料剪成直径为10mm的圆片并用PBS冲洗3次，放入48孔板中，加入100μL富血小板血浆在37℃浸泡1h。选取100μL富血小板血浆作为阳性对照进行定量检测。孵育后，用PBS冲洗3次。用乳酸脱氢酶测定试剂盒测定血小板粘附的相对量。用酶标仪记录各组在490nm处的吸光度，并计算每组乳酸脱氢酶相对活性，血小板相对数量用乳酸脱氢酶相对活性表示。
(3)溶血率测试
采集新鲜兔血，1500rpm离心15min，弃上清液，取红细胞。将对照组以及实施例1样品放入2ml离心管中，加入PBS稀释红细胞(9/1,PBS/RBC)在37℃孵育1小时。PBS和去离子水稀释10倍的红细胞设阴性对照和阳性对照。在3000rpm转速下离心5min，把上清转移到96孔板。用酶标仪记录545nm处的吸光度值并计算溶血率。
(4)钙化测试
在45-50g雄性SD大鼠背部做切口，并用钝器分离皮下组织创建空腔，将对照组以及实施例1的样品放入空腔中，然后缝合皮肤，在30天后取出样品，冷冻干燥并称重，使用1ml6M的盐酸在100℃下消解，然后将消解的溶液用去离子水稀释至10ml，进行电感耦合等离子体原子发射光谱测定钙浓度。
实施例2以及戊二醛对照组2最终的水接触角结果如表3所示。
表3
水接触角(°)
戊二醛对照组2 84.29
实施例2 55.26
实施例2以及戊二醛对照组2最终的乳酸脱氢酶活性以及溶血率结果如表4所示。
表4
乳酸脱氢酶活性 溶血率(％)
戊二醛对照组2 0.41 1.54
实施例2 0.24 0.38
实施例2以及戊二醛对照组2最终的钙离子浓度结果如表5所示。
表5
钙离子浓度(μg/mg)
戊二醛对照组2 188.39
实施例2 36.95
结合表1、表2和表3可以发现采用实施例2的方法对生物膜进行处理后，生物膜水接触角均下降，乳酸脱氢酶活性均降低，钙离子含量均减少。
如图7所示，该实验为水接触角检测，对照组为戊二醛处理组，实验组为亲水处理组，实验组水接触角降低。
如图8所示，该实验为乳酸脱氢酶活性及溶血率检测，对照组为戊二醛处理组，实验组为亲水处理组，实验组乳酸脱氢酶活性及溶血率均减低。
如图9所示，该实验为钙离子浓度检测，对照组为戊二醛实验组，实验组为亲水处理组，实验组钙离子含量均减小。
该实施例提供的方法能够提升生物材料的亲水性能及血液相容性和抗钙化能力，潜在地延长其使用寿命。
对照组3
新鲜采集的猪心包于4℃100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在100mM的戊二醛溶液中，室温下，100RPM转速振荡条件之下交联24小时。
实施例3
制备流程见图1，根据制备流程图一种共交联联合双键交联制备生物瓣膜材料的方法，基本原理见图10。新鲜采集的猪心包于4℃100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在20mM的2-甲基烯丙胺水溶液在37℃中2小时，然后加入戊二醛使其终浓度为100mM，在37℃，100RPM转速振荡条件之下浸泡24小时。取出猪心包，采用蒸馏水进行清洗。清洗后浸泡于20mM的2-甲基烯丙胺水溶液在37℃中4小时，取出猪心包，采用蒸馏水进行清洗。清洗后浸泡于蒸馏水中，加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠引发剂引发，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的摩尔浓度均为30mM，在37℃条件下反应24小时。为方便区分各实施例制备的样品，本实施例所得样品记为样品3。
实施例4
新鲜采集的猪心包于4℃100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在20mM的3-丁烯-1-胺水溶液在37℃当2小时，然后加入戊二醛使其终浓度为100mM，在37℃，100RPM转速振荡条件之下浸泡24小时。取出猪心包，采用蒸馏水进行清洗。清洗后浸泡于去离子水中，加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠引发剂引发，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的摩尔浓度均为30mM，在37℃条件下反应24小时。本实施例所得样品记为样品4。
实施例5
新鲜采集的猪心包于4℃100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后在37℃下浸泡在20mM的甲基丙烯酸2-氨基乙酯水溶液中2小时，然后加入戊二醛使其终浓度为100mM，在37℃，100RPM转速振荡条件之下浸泡24小时。取出猪心包，采用蒸馏水进行清洗。清洗后浸泡于去离子水中，加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠引发剂引发，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的摩尔浓度均为30mM，在37℃条件下反应24小时。本实施例所得样品记为样品5。
实施例6
新鲜采集的猪心包于4℃100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在含有10mM的甲基丙烯酸2-氨基乙酯和10mM的2-甲基烯丙胺水溶液在37℃当中2小时，然后加入戊二醛使其终浓度为100mM，在37℃，100RPM转速振荡条件之下浸泡24小时。取出猪心包，采用蒸馏水进行清洗。清洗后浸泡于去离子水中，加入等物质的量的过硫酸钾和亚硫酸氢钠引发剂引发聚合反应，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的摩尔浓度均为30mM，在37℃条件下反应24小时后用蒸馏水清洗并转移至甘油中脱水得干燥瓣膜样品。本实施例所得样品记为样品6。
实施例7
新鲜采集的猪心包于4℃100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后在37℃下浸泡在20mM的甲基丙烯酸2-氨基乙酯水溶液中2小时，然后加入戊二醛使其终浓度为100mM，在37℃，100RPM转速振荡条件之下浸泡24小时。取出猪心包，采用蒸馏水进行清洗。清洗后浸泡于20mM的2-氨基-4-戊烯酸水溶液在37℃当中24小时。取出猪心包，采用蒸馏水进行清洗。清洗后浸泡于蒸馏水中，加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠引发剂引发，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的摩尔浓度均为30mM，在37℃条件下反应24小时。本实施例所得样品记为样品7。
实施例8
新鲜采集的猪心包于4℃100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后在37℃下浸泡在20mM的甲基丙烯酸2-氨基乙酯水溶液中2小时，然后加入戊二醛使其终浓度为100mM，在37℃，100RPM转速振荡条件之下浸泡24小时。随后直接向溶液中继续加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠引发剂引发，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的摩尔浓度均为30mM，在37℃条件下反应24小时。本实施例所得样品记为样品8。
实施例9
改性透明质酸的制备：称取2g分子量为10000的透明质酸钠，并使用20ml PBS溶解，再依次加入6.5ml甲基丙烯酸缩水甘油酯以及4.5ml三乙胺。在37℃摇床上放置7天。最后使用截留分子量为5000的透析袋透析7天，冷冻干燥得到双键化的透明质酸；
改性多聚赖氨酸的制备：将多聚赖氨酸溶解在去离子水中，然后以(1：1.5)的摩尔比加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(甲基丙烯酸缩水甘油酯：氨基)。将混合物在37℃摇床上放置7天。最后使用截留分子量为1000的透析袋透析7天，冷冻干燥得到部分双键化的多聚赖氨酸；
在本实施例中，新鲜采集的猪心包于4℃、100RPM转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在60mM(按赖氨酸算)改性多聚赖氨酸水溶液在室温当中12小时，然后加入戊二醛溶液至质量浓度为250mM，在37℃摇床上反应24小时，取出心包材料清洗后浸泡在50mg/ml改性透明质酸水溶液在室温当中12小时，然后采用2.5％过硫酸铵和0.25％N,N,N',N'-四甲基乙二胺在37℃下浸泡12小时，最后采用蒸馏水进行清洗，记为样品9。相对于对照样2，样品9的水接触角下降，乳酸脱氢酶活性降低，钙离子含量减少，可提升生物材料的亲水性能及血液相容性和抗钙化能力，潜在地延长其使用寿命。
酶降解实验(表征交联度)
将样品5、样品6、样品7、样品8和对照组3裁剪成直径为1cm的圆形片材，每组设置6个平行样。将所有圆形片材样本放置于48孔板，负80℃冷冻过夜然后转移到真空冻干机中冻干48小时。在十万分之一天平上称取每片样品的重量记为初始重量(W0)放回48孔板。用移液枪向48孔板中各孔加入0.5mL胶原酶Ⅰ的PBS溶液并保证生物瓣膜样品完全浸没于胶原酶的PBS溶液中(100U/mL)，将48孔板转移到37℃恒温孵育箱中孵育24小时。孵育结束后弃去孔板中的溶液，用胶头滴管吸取去离子水反复吹打孔板中的生物瓣膜样品。经过反复吹洗3次后在负80℃下冷冻过夜然后转移到真空冻干机中冻干48小时。在十万分之一天平上称取每片样品经过胶原酶溶液降解后的重量记为最终重量(Wt)。酶降解失重率计算公式如下：
Figure BDA0003554132560000131
表6
样品 酶降解失重率(％)
对照组3 8.31
样品5 5.27
样品6 4.88
样品7 4.11
样品8 3.23
对样品5、样品6、样品7、样品8和对照组3进行酶降解实验以表征各组样品的交联效率，利用胶原酶Ⅰ处理样品5、样品6、样品7、样品8和对照组3后计算各组样品的酶降解失重率如表6所示。样品5、样品6、样品7、样品8的酶降解失重率均低于对照组3，这表明样品5、样品6、样品7、样品8的酶降解稳定性均高于对照组3，即样品5、样品6、样品7、样品8的交联效率更高。酶降解实验结果表明本申请的共交联联合双键交联制备生物瓣膜材料的方法能够提高生物瓣膜材料的交联度。
对对照组3及实施例3～8所得样品进行茜素红染色实验，茜素红染色实验：
将样品3、样品4、样品5、样品6、样品7、样品8和对照组3植入到大鼠皮下30天后取出，经过多聚甲醛组织固定液固定。固定结束后取出用手术刀进行修理平整后转移到脱水盒中。用50％、75％、85％、95％(v/v)和无水乙醇对材料样品进行梯度脱水。脱水结束后将材料样品转移至包埋机用融化的石蜡进行包埋，然后转移到-20℃冰箱冷却、修整形状。在切片机上从修整好的蜡块切取3-5μm厚的切片，从摊片机转移至载玻片上并进行脱蜡和复水。用茜素红染液对切片进行染色3分钟，经水洗、烘干后用二甲苯通透5分钟。切片用中性树胶封片后在病理切片扫描仪上采集染色结果图像。
通过茜素红染色对植入到大鼠皮下30天后的样品3、样品4、样品5、样品6、样品7、样品8和对照组3以表征各组样品的钙化程度。植入到大鼠皮下30天后的样品切片的茜素红染色结果图像如图11-17所示，其中茜素红染色后样品的颜色越深表明钙化程度越高。相比于对照样3切片的茜素红染色结果(图11)，样品3、样品4、样品5、样品6、样品7和样品8切片的茜素红染色结果图颜色明显较淡，这表明样品3、样品4、样品5、样品6、样品7和样品8的钙化程度低于对照组3，即样品3、样品4、样品5、样品6、样品7和样品8相比于对照组3具有一定的抗钙化效果。对植入到大鼠皮下30天后的样品3、样品4、样品5、样品6、样品7、样品8和对照组3的茜素红染色结果表明本申请的共交联联合双键交联制备生物瓣膜材料的方法能够提升生物瓣膜的抗钙化性能。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (12)

1.一种共交联联合双键交联制备生物瓣膜材料的方法，其特征在于，包括：
(1)将生物材料浸泡于含功能单体的溶液中进行物理渗透；所述功能单体具有至少一个碳碳双键和至少一个与醛基反应的基团；
(2)向步骤(1)的体系中加入醛基交联剂，进行共交联；
(3)将经步骤(2)处理后的生物材料与引发剂接触，引发双键聚合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醛基交联剂为戊二醛或甲醛。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述溶液的溶剂为水、生理盐水、pH中性缓冲液或乙醇的水溶液；所述溶液中功能单体的浓度为10～100mM；浸泡时间为2～20h；步骤(2)中，所述交联剂的浓度为10～800mM；共交联时间为10～30h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中：将引发剂加入前步处理的体系中；或将前步处理后的生物材料清洗后再浸泡于含引发剂的溶液中。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠的混合物，所述过硫酸铵和亚硫酸氢钠的浓度分别为10～100mM；或
所述引发剂为过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基乙二胺的混合物，所述过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基乙二胺的质量百分浓度分别为2％～5％和0.2％～0.5％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)之前还包括步骤(2M)：将经步骤(2)处理后的生物材料浸泡于含功能单体的溶液中，消除残留醛基；所述功能单体具有至少一个与醛基反应的基团。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2M)中，所述溶液的溶剂为水、生理盐水、pH中性缓冲液或乙醇的水溶液；所述溶液中功能单体的浓度为10～100mM；浸泡时间为2～48h。
8.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，步骤(1)或步骤(2M)中所述与醛基反应的基团各自独立地选自氨基、酰肼中的一种。
9.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，步骤(1)或步骤(2M)中所述功能单体各自独立地选自DL-2-氨基-4-戊烯酸、2-甲基烯丙胺、3-丁烯-1-胺、戊-4-烯-1-胺、甲基丙烯酸2-氨基乙酯、甲基丙烯酰肼、丙烯酰肼、双键化多聚赖氨酸中的一种。
10.一种双键交联生物瓣膜材料，其特征在于，由权利要求1～9任一项权利要求所述的方法制备得到。
11.一种生物瓣膜，包括支架和瓣膜，其特征在于，所述瓣膜为权利要求10所述的双键交联生物瓣膜材料。
12.根据权利要求11所述的生物瓣膜，其特征在于，所述生物瓣膜为心脏瓣膜。
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