CN111494717B - 一种人工生物瓣膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人工生物瓣膜及其制备方法，人工生物瓣膜包括支架和附着在支架上的功能化生物组织材料；功能化生物组织材料为通过共价键连接有活性基团和功能分子或基团的生物组织。本发明通过在生物瓣膜表面共价修饰高嫁接度的活性基团和功能分子或基团改善抗血栓和抗钙化功能，制得的人工生物瓣膜不含有醛基残留，生物相容性佳，力学性能适宜，且具有良好的稳定性，可满足经导管介入的生物瓣膜的使用性能要求。

Description

一种人工生物瓣膜及其制备方法
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种人工生物瓣膜及其制备方法。
背景技术
瓣膜控制着人体内血流的方向，是人体的重要器官，瓣膜疾病的发生严重影响着患者的生活质量和生命安全。人体的瓣膜主要分为位于心脏处的心脏瓣膜和分布在全身静脉中的静脉瓣膜两大类。心脏瓣膜通过连续的开启和关闭来控制血液的单向流动，一旦发生病变或损坏，将阻碍正常血液循环，从而增加心脏负担，甚至导致心力衰竭。静脉瓣膜通过向心单向开闭保障静脉输送血液向心性流动，若静脉瓣膜功能异常，将导致静脉血液返流，造成静脉高压，临床表现为浅静脉迂曲扩张、组织水肿、皮肤脂质硬化、局部色素沉着以及静脉性溃瘍形成等。对于大部分瓣膜病患者，常规传统的治疗方法虽可以暂时控制病情，但无法从根本上解决瓣膜功能丧失的问题，存在着易复发、易恶化的高危风险，所以最终都需要进行瓣膜置换术治疗，使用人工生物瓣膜替代原生病变瓣膜，维持体内血液的正常流动。
人工生物瓣膜可以被安装在输送系统上，经皮经导管输送到瓣膜病变部位，从而完成人工生物瓣膜置换。经导管人工生物瓣膜置换方式符合微创治疗的理念和技术，极大的降低手术风险和手术难度，缩短术后恢复期。
近年来的临床试验已经证明经导管心脏瓣膜的有效性和安全性。目前植入的人工心脏瓣膜的寿命短于原生瓣膜，植入后容易出现瓣叶血栓和瓣叶钙化问题。临床数据表明，人工心脏瓣膜的瓣叶血栓可发生在整个植入期，发生率在15％-40％之间，人工心脏瓣膜的瓣叶和支架存在内窦区，体外流体力学模拟实验表明此区域血流速度明显低于瓣膜中心区域，易造成血流阻滞，从而延长血液与瓣叶的接触时间，瓣叶作为生物瓣膜中和血液接触的最主要部件，是血栓形成的一个重要诱因。瓣叶通常使用异种生物组织制备，该组织中含有大量胶原蛋白，它通过促进血小板的黏附激活和凝血因子的局部富集，从而引起瓣叶血栓。人工心脏瓣膜钙化一般出现在植入十年后，钙化导致瓣叶变硬发脆，产生开合障碍甚至破损，病人甚至需要进行二次瓣膜植入手术。目前临床上所使用的经导管生物瓣膜中的瓣叶材料来源于戊二醛固定的生物组织，戊二醛交联方式因为醛基残留、不稳定交联以及炎症反应等，会进一步促进钙化的发生。针对戊二醛交联生物瓣膜的钙化问题，爱德华兹的
Figure BDA0002465030110000021
技术和美敦力的
Figure BDA0002465030110000022
技术有一定的有益效果，但不能彻底消除戊二醛交联带来的醛基残留、不稳定交联和生物相容性差等问题，进一步这些技术并没有缓解血栓问题。一些其他化合物例如环氧化合物、EDC、京尼平用来交联生物瓣膜，虽然可以改善生物相容性和钙化问题，但同样不能解决血栓问题，因此现有技术无法同时解决经导管生物瓣膜容易发生血栓和钙化的问题。
经导管深静脉置换术的理念最早于1981年由美国Dotter教授提出，随后国外多个研究中心利用不同材质、不同结构的瓣膜和支架对该项技术进行研究。Uflacker等利用聚醚聚氨酯膜构成的单瓣式静脉瓣膜，经皮释放至实验动物猪的下腔静脉内；Gomez Jorge等利用戊二醛鞣化处理的牛颈静脉构建静脉瓣膜，通过经皮内的方式释放至实验猪的下腔静脉或骼静脉；Pavcnik等利用无免疫原性的猪小肠黏膜下层构建瓣膜，经导管释放至羊颈静脉，并进行了部分临床试验。虽然这些方法均获得一定成效，但目前仍没有大规模应用于临床的产品。最主要原因是植入一段时间后出现移植瓣膜部位的血栓堵塞。静脉血流速度相对缓慢，血液在瓣叶材料上的驻留时间较长，另外在瓣叶关闭时，瓣叶与支架之间容易在正常血流的上游侧形成局部血流阻滞，同样会延长血液与局部瓣叶材料的接触时间，造成血栓的发生几率提高。
因此无论是心脏瓣膜还是静脉瓣膜，血栓的形成都是一项不可忽视的风险，而瓣叶材料作为血栓形成的重要诱因，是目前亟须解决的问题之一。为了解决外来植入物的血栓问题，现有技术常通过共价方式对植入物表面进行抗凝分子修饰，这种方式可以维持较长时间的抗凝性能，但是共价修饰容易导致抗凝活性丧失，并且严重依赖修饰位点和修饰密度，常常导致修饰后的表面不具有期望的抗凝效果。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种人工生物瓣膜及其制备方法，通过在生物瓣膜表面共价修饰高嫁接度的活性基团和功能分子或基团改善抗血栓和抗钙化功能，制得的人工生物瓣膜不含有醛基残留，生物相容性佳，力学性能适宜，且具有良好的稳定性，可满足经导管介入的生物瓣膜的使用性能要求。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种人工生物瓣膜，包括支架和附着在支架上的功能化生物组织材料，该功能化生物组织材料为连接有活性基团和功能分子或基团的生物组织；活性基团和功能分子或基团均通过共价键连接在生物组织上；
其中，功能分子或基团为肝素(15000Mw)、透明质酸、聚乙二醇、阿加曲班、低分子肝素(4500-5000Mw)、水蛭素、比伐卢定、岩藻多糖、ACH11多肽、抗凝血酶-Ⅲ、水蛭素、APC、枸橼酸钠、白蛋白、尿激酶、羟基、磺酸基、磺酸苯基和两性离子中的至少一种。
进一步地，两性离子的结构式为：
Figure BDA0002465030110000041
上述结构式命名依次为：
N,N-二甲基-N-甲基丙烯酰胺基丙基-甲烷磺酸内盐；
N,N-二甲基-N-丙烯酰胺基丙基-甲烷磺酸内盐；
N,N-二甲基-N-甲基丙烯酰胺基丙基-甲烷羧酸内盐；
N,N-二甲基-N-甲基丙烯酰胺基丙基-甲烷羧酸内盐；
[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵(SBMA)；
[2-(丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵；
3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯(CBMA)；
3-[[2-(丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯；
2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)；
优选两性离子为[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵(SBMA)、3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯(CBMA)或2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)。
上述人工生物瓣膜为心脏瓣膜或静脉瓣膜。
进一步地，功能化生物组织材料通过以下方法制备得到：将生物组织浸泡于去离子水中，然后加入活性基团，使得活性基团体积浓度为3-10％，室温反应12-36h后，清洗生物组织，然后向清洗后的生物组织中加入功能分子或基团溶液，使得功能分子或基团终浓度为20-500mM，于35-40℃浸泡过夜，然后加入引发剂引发聚合，制得。
进一步地，加入活性基团后，使得活性基团体积浓度为4％，室温反应24h。
进一步地，向清洗后的生物组织中加入功能分子或基团溶液，使得功能分子或基团终浓度为500mM，于37℃浸泡过夜。
进一步地，生物组织为心包、主动脉根、主动脉瓣、肺动脉根、肺动脉瓣、腱、韧带、皮肤、硬膜、腹膜、血管、胸膜、隔膜、二尖瓣或三尖瓣。
进一步地，活性基团为丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或烯丙基。
进一步地，活性基团通过酰胺键连接在生物组织上，功能分子或基团与生物组织也通过酰胺键连接，并且与生物组织有两个以上的连接位点。
进一步地，功能分子或基团重量占功能化生物组织材料干重的1-30％；优选功能分子或基团重量占功能化生物组织材料干重的24.6％。
进一步地，引发剂引发聚合时反应温度不超过50℃，优选为37℃。
进一步地，引发剂为热引发剂或光引发剂，热引发剂为有机过氧化物引发剂、无机过氧化物引发剂、偶氮类引发剂、氧化还原引发剂，优选为氧化还原引发剂如过硫酸铵/亚硫酸氢钠体系；光引发剂为Irgacure D-2959。
进一步地，支架包括但不限于镍钛合金支架或钴铬合金支架。
上述人工生物瓣膜的制备方法包括以下步骤：
制备功能化生物组织材料，将功能化生物组织材料切割形成组织瓣叶组件，然后附着在支架上，制得。
进一步地，将组织瓣叶组件附着在支架上后，还要对其进行灭菌，然后包装，保存在无菌溶液中，如保存在乙醇、过氧乙酸或戊二醛的水溶液中。
本发明提供的人工生物瓣膜及其制备方法，具有以下有益效果：
本发明提供的人工生物瓣膜具有良好的抗凝血和抗钙化功能，植入后的瓣叶血栓和钙化发生率低于现有介入人工生物瓣膜。本发明介入人工生物瓣膜的瓣叶使用具有抗凝血和抗钙化功能的生物组织(功能化生物组织材料)，该生物组织经过特殊的交联处理后，经过切割以一定几何形状附着在支架上，从而制成可植入的人工生物瓣膜，该可植入的人工生物瓣膜在术前安装到导管输送系统，通过输送系统可将人工生物瓣膜通过血管到达指定部位，完成瓣膜的替换。本发明提供的人工生物瓣膜可为心脏瓣膜和静脉瓣膜，通过微创介入方式进行瓣膜替换以降低手术风险。
本发明中的抗凝血和抗钙化功能的生物组织(功能化生物组织材料)是在生物组织上引入可发生聚合反应的活性基团，将带有活性基团的组织与功能分子单体自由基共聚得到具有抗血栓和抗钙化功能的交联生物组织，通过一次交联引进功能分子，改善生物瓣膜的抗血栓和抗钙化功能，高嫁接度功能分子的引入可以减少血浆蛋白和血小板黏附，防止血栓生成，从而进一步减少因为血栓而引发的钙化，并且可以促进生物瓣膜的原位内皮化，形成血液相容性屏障，防止钙元素沉积，由于胶原蛋白之间通过聚合物多位点交联，实现了胶原纤维内和纤维间的充分交联，因此可以提供更好的灵活性和分散应力的功能，改善了生物瓣膜的疲劳性能和体内稳定性。
附图说明
图1为人工生物瓣膜制备流程图。
图2为抗血栓和抗钙化生物组织制备流程图。
图3为抗血栓和抗钙化功能化生物制备机理示意图。
图4为MPC-20生物组织的血小板吸附SEM图片。
图5为MPC-500生物组织的血小板吸附SEM图片。
图6为SBMA-20生物组织的血小板吸附SEM图片。
图7为SBMA-500生物组织的血小板吸附SEM图片。
图8为未经修饰生物组织的血小板吸附SEM图片。
图9为戊二醛交联生物组织的血小板吸附SEM图片。
图10为内皮细胞在SBMA-500生物组织上生长荧光图片。
图11为内皮细胞在未经修饰生物组织上生长荧光图片。
图12为内皮细胞在戊二醛交联生物组织上生长荧光图片。
图13为SBMA-500制成人工生物瓣膜后的脉动流图片(打开状态)。
图14为SBMA-500制成人工生物瓣膜后的脉动流图片(关闭状态)。
具体实施方式
实施例1制备功能化生物组织材料(抗凝血和抗钙化的生物材料)
制备流程图见图2，制备机理示意图见图3，具体步骤如下：
将新鲜猪心包用去离子水彻底清洗干净，然后加入去离子水使组织完全浸没，4℃冰浴搅拌下，逐滴加入甲基丙烯酸酐，酸酐终浓度为4％(v/v)，同时用氢氧化钠溶液维持pH值在7，滴加完毕后室温反应24h；彻底清洗甲基丙烯酸酐修饰后的猪心包，将甲基丙烯酸酐修饰后的猪心包加入如下表所示终浓度的两性离子单体溶液中，于37℃浸泡过夜，再加入引发剂交联于37℃反应24h，制得；将制备的猪心包用去离子水彻底清洗并保存在25％异丙醇溶液中备用。
未经修饰的生物组织：在加入引发剂交联前如上制备，不经单体浸泡，直接加入引发剂交联，将制备的猪心包用去离子水彻底清洗并保存在25％异丙醇溶液中备用。
具体参数如下：
Figure BDA0002465030110000081
注：SBMA:[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)氢氧化铵；
MPC:2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱；
*：未经修饰作为基线，设为0％；
引发剂浓度为刚加入反应体系时的浓度。
上述MPC/SBMA是将制得的生物材料冻干，
由于功能分子MPC中含有生物材料中几乎没有的磷元素，SBMA中含有特有的硫元素，所以使用ICP-OES分析生物材料中硫元素或者磷元素的含量，即可换算成功能分子含量，从而得到功能分子在生物组织上的修饰度，便于实验条件筛选。
具体换算方式如下：
Figure BDA0002465030110000091
其中，CS(P)(mg/L)为ICP-OES测定的硫元素或磷元素在溶液中的浓度，MS(P)为硫元素或磷元素的相对原子质量，MSBMA(MPC)为功能分子的相对分子质量，W(mg)为生物材料干重。
由上表可知，本发明制得的生物材料与对照组相比，说明功能分子很好的修饰在了生物组织上，尤其是SBMA-500组，修饰度最高。
实施例2抗凝血和抗钙化的生物材料的抗凝血性能
将制得的抗凝血和抗钙化的生物材料清洗并裁剪成合适大小，与富含血小板的血浆孵育1h，测定粘附在材料上的血小板裂解后乳酸脱氢酶(LDH)的量，以表示血小板粘附的数量，结果如下表所示，并通过SEM观察血小板在材料上的黏附情况，具体结果见图4-9。
样品名 吸光度值(490nm)
MPC-20 0.30
MPC-500 0.29
SBMA-20 0.24
SBMA-500 0.110
未经修饰 0.32
戊二醛交联 0.35
由上表可知，490nm处的吸光度值越高表示乳酸脱氢酶的含量越高，即材料上粘附的血小板数量越多。因此，由上表可知，本发明制得的生物材料的抗凝血效果要明显优于未修饰的生物组织和经戊二醛交联生物组织(将猪心包膜浸泡于0.625％体积浓度的戊二醛水溶液中，在室温、pH＝7.4条件下交联24h，然后脱水干燥)。而经SBMA修饰后的生物组织的抗凝血效果比经MPC修饰后的生物组织的抗凝血效果好，且高嫁接度的SBMA的抗凝血效果最佳。
由图4-9可知，本发明制得的生物材料的抗凝血效果要明显优于未修饰的生物组织和经戊二醛交联生物组织(将猪心包膜浸泡于0.625％体积浓度的戊二醛水溶液中，在室温、pH＝7.4条件下交联24h，然后脱水干燥)。而经SBMA修饰后的生物组织的抗凝血效果比经MPC修饰后的生物组织的抗凝血效果好，且高嫁接度的SBMA的抗凝血效果最佳。
图4-9中SEM定性观察结果与LDH定量测量结果一致。
实施例3抗凝血和抗钙化的生物材料的内皮化性能
将制得的抗凝血和抗钙化的生物材料表面接种内皮细胞，孵育3天后使用DAPI和FITC标记的鬼笔环肽染色，结果见图10-12。
由图10-12可知，SBMA-500修饰的生物组织上内皮细胞生长情况优于未经修饰和戊二醛交联生物组织。
实施例4抗凝血和抗钙化的生物材料的抗钙化和免疫反应表征
将制得的抗凝血和抗钙化的生物材料切成1平方厘米的片材，植入SD大鼠皮下90天后取出，利用ICP-OES测定样品中钙元素含量，其结果如下：
样品名 钙元素含量(g/kg)
SBMA-500 12.8
未经修饰 38.4
戊二醛交联 117.3
由上表可知，SBMA-500修饰的生物组织钙化程度明显弱于未经修饰的和戊二醛交联生物组织。
实施例5抗凝血和抗钙化的生物材料的稳定性
将制得的抗凝血和抗钙化的生物材料裁剪成3-8mg的小块，用滤纸吸干表面水分，放入铝制坩埚密封，将装有样品的坩埚放入仪器中通过差式扫描量热法分析热变性温度，从而表征生物组织的稳定性，其结果如下：
样品名 热变性温度(℃)
SBMA-500 80.15
新鲜组织 68.88
由上表可知，本发明制得的抗凝血和抗钙化的生物材料比新鲜组织更具有耐高温性，说明生物组织具有较优异的稳定性。
实施例6抗凝血和抗钙化的生物材料的人工血管植入
将制得的抗凝血和抗钙化的生物材料卷成直径约为2mm的管状并使用医用粘合剂粘结接口处，用滤纸吸干表面水分，称重并记录。使用血管吻合术替换长度约2cm的兔颈动脉。植入一段时间后取出观察，并用滤纸吸干取出材料表面水分，再次称重并计算增重，即为血栓生成量，结果如下：
样品名 初始重量(mg) 最终重量(mg) 血栓生成量(mg)
SBMA-500 80.9 83.6 2.7
未经修饰 78.6 262.4 183.8
戊二醛交联 82.5 295.3 212.8
由上表可知戊二醛交联生物组织和未经修饰生物组织有超过组织重量2倍的血栓生成，SBMA-500几乎无血栓生成。
实施例7人工生物瓣膜的制备(制备流程见图1)
将实施例1制备的SBMA单体浓度为500mM，具有抗血栓抗钙化性能的生物组织材料经过激光切割形成组织瓣叶组件，将组织瓣叶组件通过缝合附着镍钛合金支架上，从而制成可植入的人工生物瓣膜。
实施例8人工心脏瓣膜体外流体力学性能测试
将制得的直径为29mm最优的人工心脏瓣膜(SBMA-500修饰)在标准测试条件下(心率70次/min、平均心输出量5L/min、平均主动脉压力100mmHg)测定其体外流体力学性能，有效开口面积＝2.855cm2，反流比＝9.998％，其结果符合ISO 5840-1:2015的要求，表明该生物瓣膜符合流体力学要求，具体结果见图13和图14。
实施例9人工心脏瓣膜体外加速疲劳性能测试
将制得的直径为29mm最优的人工心脏瓣膜(SBMA-500修饰)在体外加速疲劳仪上进行体外加速疲劳试验。经过5000万次心跳，SBMA-500瓣膜外观依然良好，未经修饰生物瓣膜瓣叶有撕裂。
实施例10人工静脉瓣膜植入大动物体内实验
将制得的直径为12mm的人工静脉瓣膜(SBMA-500修饰)，将其灭菌，于术前安装到导管输送系统，通过输送系统人工生物瓣膜植入狗的髂静脉，随访3个月后通过血管超声诊断发现，血管通畅性良好，即表明SBMA-500瓣膜具有良好的抗血栓功能。

Claims (8)

1.一种人工生物瓣膜，其特征在于，包括支架和附着在支架上的功能化生物组织材料；所述功能化生物组织材料通过以下方法制备得到：将生物组织浸泡于去离子水中，然后加入活性基团，使得活性基团体积浓度为3-10％，室温反应12-36h后，清洗生物组织，然后向清洗后的生物组织中加入功能分子或基团溶液，使得功能分子或基团终浓度为20-500mM，于35-40℃浸泡过夜，然后加入引发剂引发聚合，制得；
其中，功能分子或基团为15000Mw的肝素、透明质酸、聚乙二醇、阿加曲班、4500-5000Mw的低分子肝素、水蛭素、比伐卢定、岩藻多糖、ACH11多肽、抗凝血酶-Ⅲ、水蛭素、APC、枸橼酸钠、白蛋白、尿激酶、羟基、磺酸基、磺酸苯基和两性离子中的至少一种；
活性基团为丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或烯丙基。
2.根据权利要求1所述的人工生物瓣膜，其特征在于，
两性离子的结构式为：
Figure FDA0002927799510000011
Figure FDA0002927799510000021
3.根据权利要求1所述的人工生物瓣膜，其特征在于，加入活性基团后，使得活性基团体积浓度为4％，室温反应24h。
4.根据权利要求1所述的人工生物瓣膜，其特征在于，向清洗后的生物组织中加入功能分子或基团溶液，使得功能分子或基团终浓度为500mM，于37℃浸泡过夜。
5.根据权利要求1或2所述的人工生物瓣膜，其特征在于，生物组织为心包、主动脉根、主动脉瓣、肺动脉根、肺动脉瓣、腱、韧带、皮肤、硬膜、腹膜、血管、胸膜、隔膜、二尖瓣或三尖瓣。
6.根据权利要求1所述的人工生物瓣膜，其特征在于，功能分子或基团重量占功能化生物组织材料干重的1-30％。
7.根据权利要求1所述的人工生物瓣膜，其特征在于，引发剂引发聚合时反应温度不超过50℃。
8.权利要求1-7任一项所述的人工生物瓣膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备功能化生物组织材料，将功能化生物组织材料切割形成组织瓣叶组件，然后附着在支架上，制得。
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