CN113476659A - 一种人工生物瓣膜处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人工生物瓣膜处理方法，包括以下步骤：(1)将戊二醛交联后的生物组织置于含氨基化合物的溶液中处理；(2)将步骤(1)处理后的生物组织置于还原剂溶液中进行处理；(3)将步骤(2)处理后的生物组织浸泡在双键多巴胺溶液中进行处理；(4)将步骤(3)处理后的生物组织浸泡在甲基丙烯酸磺酸甜菜碱溶液中；(5)向步骤(4)所得溶液中加入引发剂，引发自由基聚合反应，即得。本发明的处理方法可有效提升瓣叶材料的抗蛋白吸附能力、血液相容性、细胞相容性和抗钙化能力。

Description

一种人工生物瓣膜处理方法
技术领域
本发明属于人工生物瓣膜处理技术领域，具体涉及一种人工生物瓣膜处理方法。
背景技术
经导管主动脉瓣植入术(TAVI)是一种微创介入的生物瓣膜(BHV)置换术，因其手术无需开胸、大大缩短和降低手术所需时间及体外循环、全身麻醉所带来的风险等优点而成为治疗结构性心脏疾病的重要突破之一。自从2002年第一个经导管介入主动脉瓣(TAV)被成功植入以来，到目前为止，全球已经完成近40万例TAVI手术，TAV逐渐成为瓣膜置换的主流。
尽管TAVI手术因其自身优势在治疗主动脉瓣狭窄和返流等疾病上有出色的表现，但TAVI技术也面临一些挑战。由于TAV瓣叶材料是经戊二醛处理的BHV组织，因此戊二醛交联的弊端仍然存在，游离的醛基和残留戊二醛具有细胞毒性或与Ca2+具有的高亲和结合力会导致瓣膜因钙化或炎症反应等原因而发生结构性退化(SVD)。同时TAV在植入人体前需要经历压握卷曲至导管的过程，可能会改变基底组织材料的力学性能或引起其结构损坏，从而提高瓣叶的血栓发生率。BHV的血栓形成风险要明显低于机械瓣膜，但临床数据表明，TAV的血栓形成率在15-40％之间。瓣叶血栓的形成如果不得到及时治疗，可能会导致瓣叶功能运动紊乱和流体力学性能恶化，增加卒中和短暂性脑缺血发作的风险，同时血栓的形成也与瓣膜钙化等有关，从而影响瓣膜的使用寿命。综上所述，临床TAV需要解决戊二醛瓣膜固有的弊端及提高血液相容性。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种人工生物瓣膜处理方法，可有效提升瓣叶材料的抗蛋白吸附能力、血液相容性、细胞相容性和抗钙化能力。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种人工生物瓣膜处理方法，包括以下步骤：
(1)将戊二醛交联后的生物组织置于含氨基化合物的溶液中处理；
(2)将步骤(1)处理后的生物组织置于还原剂溶液中进行处理；
(3)将步骤(2)处理后的生物组织浸泡在双键多巴胺溶液中进行处理；
(4)将步骤(3)处理后的生物组织浸泡在甲基丙烯酸磺酸甜菜碱溶液中；
(5)向步骤(4)所得溶液中加入引发剂，引发自由基聚合反应，即得。
人工生物瓣膜处理方法，具体包括以下步骤：
(1)将戊二醛交联后的生物组织置于5-10mg/mL的含氨基化合物的PBS溶液中，常温搅拌24h，随后用PBS溶液清洗；
(2)在4℃预冷条件下，将步骤(1)处理后的生物组织置于0.01-0.02mol/L的还原剂的PBS溶液中，在3-5℃条件下反应16h；
(3)将步骤(2)处理后的生物组织浸泡在含1-5wt％双键多巴胺的Tris乙醇溶液中，室温搅拌下反应24-36h，去离子水清洗；
(4)将步骤(3)处理后的生物组织浸泡在0.1-1M的甲基丙烯酸磺酸甜菜碱水溶液中反应12-24h；
(5)向步骤(4)所得溶液中加入引发剂，使其终浓度为20mM，在37℃震荡下反应24h引发自由基聚合反应，即得。
进一步，步骤(1)中，生物组织为猪心包或牛心包。
进一步，步骤(1)中，戊二醛交联处理具体为：将脱细胞处理的生物组织浸泡在0.625wt％的戊二醛水溶液中，在常温下振荡反应7d，得戊二醛交联后的生物组织。
进一步，步骤(1)中，氨基化合物为聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、羧甲基壳聚糖、多聚赖氨酸或聚乙二胺等富含氨基基团的聚合物。
进一步，步骤(2)中，还原剂为硼氢化钠。
进一步，步骤(3)中，Tris乙醇溶液中，Tris浓度为100mM，pH＝8.5；Tris和乙醇体积比为1:1。
进一步，步骤(5)中，引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠，引发条件为37℃；过硫酸铵和亚硫酸氢钠终浓度均为20mM。
进一步，步骤(1)中，将戊二醛交联后的生物组织置于10mg/mL的含氨基化合物的PBS溶液中。
进一步，将步骤(1)处理后的生物组织置于0.01mol/L的还原剂的PBS溶液中。
进一步，步骤(3)中，将步骤(2)处理后的生物组织浸泡在含3wt％双键多巴胺的Tris乙醇溶液中。
进一步，步骤(4)中，将步骤(3)处理后的生物组织浸泡在0.5M的甲基丙烯酸磺酸甜菜碱水溶液中反应12h。
综上所述，本发明具备以下优点：
本发明在处理时先将交联后的生物组织氨基化，硼氢化钠还原后分别修饰上双键多巴胺和两性离子单体甲基丙烯酸磺酸甜菜碱，最后在热引发剂作用下引发自由基聚合交联反应在生物组织上形成功能性涂层，从而有效提升瓣叶材料的抗蛋白吸附能力、血液相容性、细胞相容性和抗钙化能力，降低现有人工生物瓣膜材料存在的钙化和血栓风险。具体的，通过在戊二醛交联生物组织表面引入大量胺基，一方面可与生物组织中游离的醛基基团发生反应，从而降低自身的细胞毒性及由此引起的钙化情况，一方面可提供大量用于后续反应的活性氨基基团；随后经还原剂还原以稳定易发生水解的席夫碱结构，随后分别修饰上双键多巴胺和两性离子单体并经自由基聚合得到功能涂层，以提升瓣叶材料抗蛋白吸附能力、血液相容性、细胞相容性。
附图说明
图1为血小板黏附实验SEM图；
图2为内皮细胞的细胞活性；
图3为单位组织内钙元素含量。
具体实施方式
实施例1
一种人工生物瓣膜处理方法，包括以下步骤：
(1)将戊二醛交联后的猪心包置于10mg/mL的聚乙烯亚胺的PBS溶液中，常温搅拌24h，随后用PBS溶液清洗；戊二醛交联处理具体为：将脱细胞处理的猪心包浸泡在0.625wt％的戊二醛水溶液中，在常温下振荡反应7d，得戊二醛交联后的猪心包；
(2)在4℃预冷条件下，将步骤(1)处理后的猪心包置于0.01mol/L的硼氢化钠的PBS溶液中，4℃条件下反应16h；
(3)将步骤(2)处理后的猪心包浸泡在含3wt％双键多巴胺的Tris乙醇溶液中，室温搅拌下反应24h，去离子水清洗；Tris乙醇溶液中，Tris浓度为100mM，pH＝8.5；Tris和乙醇体积比为1:1；
(4)将步骤(3)处理后的猪心包浸泡在0.5M的甲基丙烯酸磺酸甜菜碱水溶液中反应12h；
(5)向步骤(4)所得溶液中加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠，使其终浓度为20mM，在37℃震荡下反应24h引发自由基聚合反应，即得。
实施例2
一种人工生物瓣膜处理方法，包括以下步骤：
(1)将戊二醛交联后的牛心包置于10mg/mL的聚乙烯亚胺的PBS溶液中，常温搅拌24h，随后用PBS溶液清洗；戊二醛交联处理具体为：将脱细胞处理的牛心包浸泡在0.625wt％的戊二醛水溶液中，在常温下振荡反应7d，得戊二醛交联后的牛心包；
(2)在4℃预冷条件下，将步骤(1)处理后的牛心包置于0.01mol/L的硼氢化钠的PBS溶液中，在4℃条件下反应16h；
(3)将步骤(2)处理后的牛心包浸泡在含3wt％双键多巴胺的Tris乙醇溶液中，室温搅拌下反应24h，去离子水清洗；Tris乙醇溶液中，Tris浓度为100mM，pH＝8.5；Tris和乙醇体积比为1:1；
(4)将步骤(3)处理后的牛心包浸泡在0.5M的甲基丙烯酸磺酸甜菜碱水溶液中反应12h；
(5)向步骤(4)所得溶液中加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠，使其终浓度为20mM，在37℃震荡下反应24h引发自由基聚合反应，即得。
实施例3
一种人工生物瓣膜处理方法，包括以下步骤：
(1)将戊二醛交联后的猪心包置于10mg/mL的聚丙烯酰胺的PBS溶液中，常温搅拌24h，随后用PBS溶液清洗；戊二醛交联处理具体为：将脱细胞处理的猪心包浸泡在0.625wt％的戊二醛水溶液中，在常温下振荡反应7d，得戊二醛交联后的猪心包；
(2)在4℃预冷条件下，将步骤(1)处理后的猪心包置于0.01mol/L的硼氢化钠的PBS溶液中，4℃条件下反应16h；
(3)将步骤(2)处理后的猪心包浸泡在含5wt％双键多巴胺的Tris乙醇溶液中，室温搅拌下反应36h，去离子水清洗；Tris乙醇溶液中，Tris浓度为100mM，pH＝8.5；Tris和乙醇体积比为1:1；
(4)将步骤(3)处理后的猪心包浸泡在0.5M的甲基丙烯酸磺酸甜菜碱水溶液中反应12h；
(5)向步骤(4)所得溶液中加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠，使其终浓度为20mM，在37℃震荡下反应24h引发自由基聚合反应，即得。
实验例
将实施例1所得生物组织与富含血小板的血浆混合，孵育2h后的血小板黏附实验SEM图，见图1。将实施例1所得生物组织与内皮细胞共培养后内皮细胞的细胞活性，见图2。将实施例1所得生物组织植入大鼠皮下30天后，通过ICP-OES技术测定的单位组织内钙元素含量，见图3。
由图1可知，相对于对照组，处理后的生物组织表面基本没有血小板的粘附与激活，由此说明本发明制得的生物组织具有优异的抗凝血功能。
由图2可知，处理后的生物组织可有效促进内皮细胞的生长。
由图3可知，处理后的生物组织具有更好的抗钙化能力。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (10)

1.一种人工生物瓣膜处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将戊二醛交联后的生物组织置于含氨基化合物的溶液中处理；
(2)将步骤(1)处理后的生物组织置于还原剂溶液中进行处理；
(3)将步骤(2)处理后的生物组织浸泡在双键多巴胺溶液中进行处理；
(4)将步骤(3)处理后的生物组织浸泡在甲基丙烯酸磺酸甜菜碱溶液中；
(5)向步骤(4)所得溶液中加入引发剂，引发自由基聚合反应，即得。
2.如权利要求1所述的人工生物瓣膜处理方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)将戊二醛交联后的生物组织置于5-10mg/mL的含氨基化合物的PBS溶液中，常温搅拌24h，随后用PBS溶液清洗；
(2)在4℃预冷条件下，将步骤(1)处理后的生物组织置于0.01-0.02mol/L的还原剂的PBS溶液中，在3-5℃条件下反应16h；
(3)将步骤(2)处理后的生物组织浸泡在含1-5wt％双键多巴胺的Tris乙醇溶液中，室温搅拌下反应24-36h，去离子水清洗；
(4)将步骤(3)处理后的生物组织浸泡在0.1-1M的甲基丙烯酸磺酸甜菜碱水溶液中反应12-24h；
(5)向步骤(4)所得溶液中加入引发剂，使其终浓度为20mM，在37℃震荡下反应24h引发自由基聚合反应，即得。
3.如权利要求1或2所述的人工生物瓣膜处理方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物组织为猪心包或牛心包。
4.如权利要求1或2所述的人工生物瓣膜处理方法，其特征在于，步骤(1)中，戊二醛交联处理具体为：将脱细胞处理的生物组织浸泡在0.625wt％的戊二醛水溶液中，在常温下振荡反应7d，得戊二醛交联后的生物组织。
5.如权利要求1或2所述的人工生物瓣膜处理方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氨基化合物为聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、羧甲基壳聚糖、多聚赖氨酸或聚乙二胺。
6.如权利要求1或2所述的人工生物瓣膜处理方法，其特征在于，步骤(2)中，所述还原剂为硼氢化钠。
7.如权利要求2所述的人工生物瓣膜处理方法，其特征在于，步骤(3)中，所述Tris乙醇溶液中，Tris浓度为100mM，pH＝8.5；Tris和乙醇体积比为1:1。
8.如权利要求1或2所述的人工生物瓣膜处理方法，其特征在于，步骤(5)中，所述引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠，引发条件为37℃。
9.如权利要求2所述的人工生物瓣膜处理方法，其特征在于，步骤(1)中，将戊二醛交联后的生物组织置于10mg/mL的含氨基化合物的PBS溶液中。
10.如权利要求2所述的人工生物瓣膜处理方法，其特征在于，步骤(3)中，将步骤(2)处理后的生物组织浸泡在含3wt％双键多巴胺的Tris乙醇溶液中。
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