CN111454480B - 一种细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法 - Google Patents

一种细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法，制备时先在高分子瓣膜表面通过光聚合制备富含活性基团的中间层，再将细胞外基质通过化学键合的方式连接到高分子瓣膜表面，形成细胞外基质涂层。细胞外基质具有良好的生物相容性，本发明通过在高分子瓣膜材料表面涂覆细胞外基质涂层，有效提高了高分子瓣膜的抗污能力、抗凝血能力、细胞相容性和降低免疫反应。高分子瓣膜的生物相容性改善，可以满足其作为人工高分子瓣膜材料的应用需求。

Description

一种细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法
技术领域
本发明属于特种材料制备技术领域，具体涉及一种细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法。
背景技术
心脏瓣膜疾病通常通过人工心脏瓣膜置换来治疗。机械心脏瓣膜经久耐用，结构稳定，但可能存在凝血、免疫反应、组织增生的问题。生物心脏瓣膜具有与人体自身心脏瓣膜相似的血流动力学特性，然而生物心脏瓣膜易发生钙化使瓣叶变硬，最终破裂。同时，生物心脏瓣膜的耐久性差，植入10～15年后需要更换，因此对病人的年龄范围提出了要求。除此之外，生物心脏瓣膜取材于动物组织(心包膜、瓣膜)，均一性较难保证，无法根据需求进行针对性调整。另外，成本也相对较高。由一些具有生物惰性的高分子聚合物制成的高分子瓣膜可以加工成与人体自身心脏瓣膜相似的结构，因此可以保证相似的血流动力学特性。此外，这种高分子瓣膜比生物心脏瓣膜具有更好的耐久性。但是，这些聚合物可能仍存在凝血、免疫反应等问题，妨碍心脏瓣膜的正常工作。
脱细胞的细胞外基质凭借其优良的生物相容性已经被广泛应用于医疗领域。利用人类皮肤、猪小肠粘膜和猪膀胱等部位的脱细胞细胞外基质，制成了外科手术过程中使用的补片、软组织修复(烧伤、溃疡等)用贴片和糖尿病患者的伤口敷料。细胞外基质本身由成纤维细胞、平滑肌细胞和免疫细胞等多种细胞分泌物堆积而成，并长期稳定存在于生物体内。因此细胞外基质具有优异的生物相容性。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供一种细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法，以解决现有高分子瓣膜生物相容性差的问题。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是，提供一种细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法，包括以下步骤：
S1：将清洗干净的高分子瓣膜在光引发剂溶液中浸泡4～8min后，取出风干，得瓣膜基底；
S2：将瓣膜基底浸泡于甲基丙烯酸水溶液中，于紫外光下聚合反应3～15min，然后捞出并清洗干净，得反应基底，甲基丙烯酸水溶液的浓度为10～30wt％；
S3：将反应基底浸泡在细胞外基质溶液中，加入引发剂，于20～50℃下反应18～48h，得具有良好生物相容性的高分子瓣膜；所述细胞外基质溶液由猪皮切碎后消化得到。
本发明在制备具有良好生物相容性的高分子瓣膜时，先将高分子瓣膜在光引发剂溶液中浸泡一定时间，浸泡过程中光引发剂均匀沉积到高分子瓣膜表面，为后续光催化反应的稳定进行提供良好的基础。然后将附着有光催化剂的高分子瓣膜转移到甲基丙烯酸水溶液中，并用紫外光进行照射，甲基丙烯酸中包含羧基和双键两种反应性基团，在紫外光照射下，光催化剂催化甲基丙烯酸中的双键进行聚合反应，形成空间网状结构的膜层并包覆在高分子瓣膜表面，在高分子表面形成涂层。再将包覆有涂层的高分子瓣膜转移到细胞外基质溶液中，涂层中未反应的羧基在引发剂的作用下与细胞外基质溶液中的细胞外基质相结合，形成生物涂层，由于细胞外基质具有优良的生物相容性，其固定包覆到高分子瓣膜上后，所得到的新材料同样具有了良好的生物相容性。
本发明中通过光催化的方式在高分子表面形成反应涂层，不仅反应更快，而且反应更加均匀，在高分子瓣膜表面形成的膜层分布也更加均匀，同时膜层在高分子瓣膜表面结合也更加牢固，最终所制得的新材料性能更加优良。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，高分子瓣膜为括硅橡胶、聚乳酸、聚醚醚酮、聚氨酯或苯乙烯-b-异丁烯-b-苯乙烯。
进一步，光引发剂溶液的溶质为I295或苯甲酮，溶剂为乙醇；其浓度为5～20wt％。
本发明中优先采用I295或苯甲酮作为光引发剂，两者对紫外光敏感，在紫外照射下可产生大量的自由基，从而可快速引发甲基丙烯酸进行交联聚合反应，大大缩短发硬时间。而且这两种光引发剂无毒，通过它们制备得到的材料可以应用于医学领域，拓宽了材料的应用场景。
进一步，S1中高分子瓣膜在光引发剂溶液中的浸泡时间为5min。
进一步，S2中紫外聚合反应时间为10min。
进一步，引发剂为EDC或NHS，所加入的引发剂在细胞外基质溶液中的浓度为30～70mM。
进一步，细胞外基质溶液经过以下步骤制得：
SS1：将洗净后的猪皮切成粒径小于1cm的碎块，然后将猪皮碎块浸没于胰酶溶液中，室温下浸泡2～4h；
SS2：将经过胰酶处理后的猪皮碎块浸没于胃蛋白酶溶液中，于20～45℃下消化24～72h；
SS3：分离消化液与猪皮残渣，并将消化液的pH值调节至7.4，得细胞外基质溶液。
本发明中以猪皮作为细胞外基质的来源，不仅可以有效降低生产成本，而且最主要的是猪的基因组与人类基因组相似度较高，利用其制备细胞外基质并负载到高分子瓣膜上后，可以显著改善高分子瓣膜的生物相容性，同时可以将排异反应的程度降至最低，适合生产开胸高分子瓣膜、介入高分子瓣膜或人工血管等用于人体的生物相容性材料。
制备细胞外基质时，先用胰酶对猪皮进行脱细胞处理，可以将猪皮内的细胞成分完全除去，减小对材料生物活性以及机械完整性的不利影响。然后用胃蛋白酶对脱细胞后的猪皮进行消化，可以促进猪皮内的胶原蛋白等释放到消化液中，增加消化液中细胞外基质的含量，同时不会在消化液中引入污染物，可以保证最终制得的生物相容性高分子瓣膜具有优良的性能。
进一步，胃蛋白酶溶液以0.01M的盐酸为溶剂，胃蛋白酶溶液的浓度为1～20mg/mL。
本发明中的胃蛋白酶溶液以稀盐酸为溶剂，在酸性条件下胃蛋白酶的活性较强，同时可对猪皮细胞进行进一步破坏，使胶原蛋白等细胞外基质更容易释放出来。
本发明在高分子瓣膜表面通过光聚合制备富含活性基团的中间层，再将细胞外基质通过化学键合的方式连接到高分子瓣膜表面，形成细胞外基质涂层。凭借细胞外基质良好的生物学相容性，细胞外基质涂层有效提高了高分子瓣膜的抗凝血性能、细胞相容性和抑制免疫反应，使高分子涂层有希望成为制备长期血液接触型医疗器械的理想材料。
本发明的有益效果是：
本发明在高分子瓣膜表面引入细胞外基质，由于细胞外基质涂层具有较强的亲水性，因此所得到的材料具有较强的抗污能力。同时，由于细胞外基质本身具有良好的生物相容性，因此具有细胞外基质涂层的高分子瓣膜的凝血时间、细胞相容性等性能显著提升，同时可以有效抑制其免疫反应。
附图说明
图1为不同材料的水接触角；
图2为不同材料的凝血时间；
图3为不同材料的内皮细胞粘附相对含量；
图4为SIBS和SIBS-BP+植入体内后CD68(巨噬细胞)表达量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
一种细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法，包括以下两个部分：
第一部分：制备细胞外基质溶液
(1)将洗净后的猪皮切成粒径小于1cm的碎块；
(2)将切碎的猪皮浸泡在胰酶溶液中脱细胞；胰酶溶液的溶剂为PBS，浓度为0.25wt％；
(3)将脱细胞后的猪皮浸泡在1mg/mL胃蛋白酶溶液中，于45℃下反应72h；
(4)分离消化液与猪皮残渣，并将消化液的pH调节至7.4，得到细胞外基质溶液。
第二部分：制备具有良好生物相容性的高分子瓣膜
(1)将硅橡胶基材超声清洗干净；
(2)将清洗后的硅橡胶基材浸泡在浓度为5wt％的I295的乙醇溶液中；
(3)将浸泡后的硅橡胶基材置于空气中，风干；
(4)将风干后的硅橡胶基材浸泡在浓度为10wt％的甲基丙烯酸水溶液中，放入紫外交联箱引发聚合反应3min；
(5)随后将交联聚合后的硅橡胶基材浸泡在浓度为10mg/mL的细胞外基质溶液中，并加入70mM的EDC和70mM的NHS，在20℃下反应18h，得到具有良好生物相容性的高分子瓣膜。
实施例2
一种细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法，包括以下两个部分：
第一部分：制备细胞外基质溶液
(1)将洗净后的猪皮切成粒径小于1cm的碎块；
(2)将切碎的猪皮浸泡在胰酶溶液中脱细胞；胰酶溶液的溶剂为PBS，浓度为0.25wt％；
(3)将脱细胞后的猪皮浸泡在20mg/mL胃蛋白酶溶液中，于20℃下反应24h；
(4)分离消化液与猪皮残渣，并将消化液的pH调节至7.4，得到细胞外基质溶液。
第二部分：制备具有良好生物相容性的高分子瓣膜
(1)将聚乳酸基材超声清洗干净；
(2)将清洗后的聚乳酸基材浸泡在浓度为20wt％的苯甲酮的乙醇溶液中；
(3)将浸泡后的聚乳酸基材置于空气中，风干；
(4)将风干后的聚乳酸基材浸泡在浓度为30wt％的甲基丙烯酸水溶液中，放入紫外交联箱引发聚合反应15min；
(5)随后将交联聚合后的聚乳酸基材浸泡在浓度为10mg/mL的细胞外基质溶液中，并加入30mM的EDC和30mM的NHS，在50℃下反应48h，得到具有良好生物相容性的高分子瓣膜。
实施例3
一种细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法，包括以下两个部分：
第一部分：制备细胞外基质溶液
(1)将洗净后的猪皮切成粒径小于1cm的碎块；
(2)将切碎的猪皮浸泡在胰酶溶液中脱细胞；胰酶溶液的溶剂为PBS，浓度为0.25wt％；
(3)将脱细胞后的猪皮浸泡在10mg/mL胃蛋白酶溶液中，于37℃下反应48h；
(4)分离消化液与猪皮残渣，并将消化液的pH调节至7.4，得到细胞外基质溶液。
第二部分：制备具有良好生物相容性的高分子瓣膜
(1)将聚氨酯基材超声清洗干净；
(2)将清洗后的聚氨酯基材浸泡在浓度为10wt％的苯甲酮的乙醇溶液中；
(3)将浸泡后的聚氨酯基材置于空气中，风干；
(4)将风干后的聚氨酯基材浸泡在浓度为20wt％的甲基丙烯酸水溶液中，放入紫外交联箱引发聚合反应7min；
(5)随后将交联聚合后的聚氨酯基材浸泡在浓度为10mg/mL的细胞外基质溶液中，并加入50mM的EDC和50mM的NHS，在20℃下反应24h，得到具有良好生物相容性的高分子瓣膜。
实施例4
一种细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法，包括以下两个部分：
第一部分：制备细胞外基质溶液
(1)将洗净后的猪皮切成粒径小于1cm的碎块；
(2)将切碎的猪皮浸泡在胰酶溶液中脱细胞；胰酶溶液的溶剂为PBS，浓度为0.25wt％；
(3)将脱细胞后的猪皮浸泡在10mg/mL胃蛋白酶溶液中，于37℃下反应48h；
(4)分离消化液与猪皮残渣，并将消化液的pH调节至7.4，得到细胞外基质溶液。
第二部分：制备具有良好生物相容性的高分子瓣膜
(1)将SIBS(苯乙烯-b-异丁烯-b-苯乙烯)基材超声清洗干净；
(2)将清洗后的SIBS基材浸泡在浓度为8wt％的I295的乙醇溶液中；
(3)将浸泡后的SIBS基材置于空气中，风干；
(4)将风干后的SIBS基材浸泡在浓度为15wt％的甲基丙烯酸水溶液中，放入紫外交联箱引发聚合反应7min；
(5)随后将交联聚合后的SIBS基材浸泡在浓度为10mg/mL的细胞外基质溶液中，并加入50mM的EDC和79mM的NHS，在20℃下反应24h，得到具有良好生物相容性的高分子瓣膜。
结果分析
以实施例4中制得的生物相容性高分子瓣膜为例，分析采用本发明中方法制备所得材料的亲疏水性能、凝血时间、细胞相容性等性能。分析结果如图1～图4所示，途中SIBS表示高分子瓣膜，SIBS-BP表示包覆聚甲基丙烯酸中间层后的高分子瓣膜，SIBS-BP+表示采用实施例4中的方法制备得到的具有良好生物相容性的高分子瓣膜。
图1为不同材料的亲疏水性能够考察，从图中可以看出。采用本发明中的方法可以有效降低高分子瓣膜的水接触角，所制得的材料亲水性提高，抗污能力增强。
图2为不同材料的凝血时间考察，图中两组条形从左到右均依次为SIBS、SIBS-BP、SIBS-BP+和Control。从图中可以看出，采用本发明中的方法可以有效延长高分子瓣膜的凝血时间，所制得的材料抗凝血性能提高。
图3为不同材料的内皮细胞粘附相对含量考察。从图中可以看出，采用本发明中的方法可以有效提高高分子瓣膜表面的内皮细胞粘附数量，所制得的材料内皮细胞相容性提高，增强了高分子瓣膜植入人体后内皮化的能力。
图4为SIBS和SIBS-BP+植入体内后CD68(巨噬细胞)表达量。从图中可以看出，采用本发明中的方法可以有效降低材料在植入血管后，周围巨噬细胞的数量，抑制免疫反应的发生。
虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (8)

1.一种细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将清洗干净的高分子瓣膜在光引发剂溶液中浸泡4~8min后，取出风干，得瓣膜基底；所述高分子瓣膜为硅橡胶、聚乳酸、聚醚醚酮、聚氨酯或苯乙烯-b-异丁烯-b-苯乙烯；
S2：将瓣膜基底浸泡于甲基丙烯酸水溶液中，于紫外光下聚合反应3~15min，在紫外光照射下，光引发剂催化甲基丙烯酸中的双键进行聚合反应，形成空间网状结构的膜层并包覆在高分子瓣膜表面，在高分子表面形成涂层，然后捞出并清洗干净，得反应基底，所述甲基丙烯酸水溶液的浓度为10~30wt%；
S3：将反应基底浸泡在细胞外基质溶液中，加入EDC和/或NHS，于20~50℃下反应18~48h，得具有良好生物相容性的高分子瓣膜；所述细胞外基质溶液由猪皮消化得到。
2.根据权利要求1所述的细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法，其特征在于：所述光引发剂溶液的溶质为I295或苯甲酮，溶剂为乙醇；其浓度为5~20wt%。
3.根据权利要求1所述的细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法，其特征在于：S1中高分子瓣膜在光引发剂溶液中的浸泡时间为5min。
4.根据权利要求1所述的细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法，其特征在于：S2中紫外聚合反应时间为10min。
5.根据权利要求1所述的细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法，其特征在于：S3中所加入的EDC和/或NHS在细胞外基质溶液中的浓度为30~140mM。
6.根据权利要求1所述的细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法，其特征在于，所述细胞外基质溶液经过以下步骤制得：
SS1：将洗净后的猪皮切成粒径小于1cm的碎块，然后将猪皮碎块浸没于胰酶溶液中，室温下浸泡2~4h；
SS2：将经过胰酶处理后的猪皮碎块浸没于胃蛋白酶溶液中，于20~45℃下消化24~72h；
SS3：分离消化液与猪皮残渣，并将消化液的pH值调节至7.4，得细胞外基质溶液。
7.根据权利要求6所述的细胞外基质涂层增强高分子瓣膜生物相容性的方法，其特征在于：所述胃蛋白酶溶液以0.01 M的盐酸为溶剂，所述胃蛋白酶溶液的浓度为1~20mg/mL。
8.根据权利要求1~7任一项所述的制备方法制得的高分子瓣膜。
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