CN114736873A - 一种稳定表达btg抗增殖因子2的食管鳞状细胞癌细胞株及其制备方法 - Google Patents

一种稳定表达btg抗增殖因子2的食管鳞状细胞癌细胞株及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种稳定表达BTG抗增殖因子2的食管鳞状细胞癌细胞株及其制备方法，具体为将食管鳞状细胞癌细胞株Eca109通过BTG2重组质粒转染后进行筛选，最终得到可稳定表达BTG抗增殖因子2的BTG2‑Eca109细胞株。能稳定表达BTG2蛋白的Eca109细胞株，可以为今后研究ESCC的基因诊断及靶向治疗提供有力的实验工具。BTG2蛋白作为一个抗细胞增值蛋白，参与到细胞内的很多生物学活动中，如细胞分化、增殖、凋亡等，同时也涉及到肿瘤治疗过程中的放疗敏感性。Eca109细胞株可以通过稳定表达BTG2基因，可用以研究食管鳞状细胞癌的放疗敏感性问题，从而为开发BTG2相关的癌症治疗提供新的思路。

Description

一种稳定表达BTG抗增殖因子2的食管鳞状细胞癌细胞株及其 制备方法
技术领域
本发明涉及细胞株培养领域，特别涉及一种稳定表达BTG抗增殖因子2的食管鳞状细胞癌细胞株及其制备方法。
背景技术
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，全球每年食管癌发病为57.2万人，死亡50.8万人。我国食管癌每年发病30.7万人，死亡28.3万人，在致死性肿瘤中排名第四，其中食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）占90%。虽然ESCC诊断和治疗在不断提高，但因其高侵袭及早转移的特性，很多患者发现时已是晚期，失去了手术机会，只能选择姑息治疗。放射治疗是一种重要的ESCC姑息治疗方式，但临床效果并不十分理想，五年存活率仅为10%~30%。影响放疗效果的原因很多，其中放疗抵抗依然是ESCC放疗的一个最大障碍，被认为是肿瘤局部复发或放疗失败的重要原因，严重影响食管癌患者预后。
B细胞易位基因2（B cell translocation gene 2，BTG2）隶属于BTG家族，由于该家族蛋白具有抗细胞增殖功能，因此也称为BTG抗增殖因子2（BTG anti-proliferationfactor 2）。目前的研究表明，BTG2是重要的抑癌和放射敏感基因p53的下游靶基因，作瞬时早期反应蛋白在多种组织或器官重表达，参与细胞分化、增殖、凋亡等多种生物学活动，被认为是喉癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等多种类型癌症的新型抑癌基因，更重要的是过表达BTG2可以亦可以提高乳腺癌细胞的放疗敏感性。但目前为止BTG2与ESCC发生发展及放疗敏感性关系的研究还未见报道。因此，亟需建立一种能稳定表达BTG2蛋白的细胞系，为今后研究ESCC的基因诊断及靶向治疗提共实验工具。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种稳定表达BTG抗增殖因子2的食管鳞状细胞癌细胞株及其制备方法，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下步骤：
S1. 细胞培养
将Eca109细胞株用DMEM培养基在37℃、5% CO2的培养箱中常规培养，每天观察并更换培养基一次。当细胞生长到汇合度达到75-85%时用0.2-0.3%的胰蛋白酶消化细胞进行传代。转染质粒前细胞需传代2-3次以保证细胞状态良好。
S2. 构建重组质粒
设计基因序列，在BTG2全长的基因组核酸序列5端引入EcoRⅤ酶切位点，3端引入XhoⅠ酶切位点，将得到的序列进行基因片段合成，将合成产物采用EcoRⅤ和XhoⅠ进行双酶切，对酶切产物进行纯化，并在纯化产物中加入T4DNA连接酶与pcDNA3.0质粒（该质粒已采取EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切处理），在4℃连接15-17h，将连接产物转化至感受态细胞DH5α中，并将转化产物涂抹于含青霉素（50ug/ml）的LB琼脂糖培养皿中，37℃培养6.5-7.5h后挑取单克隆细胞加入LB培养液中并37℃，200rpm摇菌13-15h。用质粒小提试剂盒提取质粒后进行EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切筛选，将筛选出的阳性克隆质粒进行测序，并将序列比对无误的质粒命名为BTG2-pcDNA3.0。
S3. 转染
取293T细胞复苏后用DMEM培养基在37℃、5% CO2的培养箱中常规培养，待汇合度达到75-85%时弃去原先培养基，1ml PBS清洗2-3次后更换为Opti-MEM培养基。随后将S2中得到的BTG2-pcDNA3.0质粒用Lipofectamine2000感染293T细胞，每5.5-6.5h收集细胞上清液并更换新鲜的Opti-MEM培养基，收集7-9次后将上清液过滤并添加到S1中得到的Eca109细胞（汇合度25% - 35%）中，将Eca109细胞继续置于细胞培养箱中培养46-50h。
S4. 筛选
将S3中得到的Eca109细胞换含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液并加入浓度为90-110μg/ml的嘌呤霉素进行筛选，一周后将存活的细胞培养于96孔板，并稀释至每孔1-2个细胞，9-11天后挑出单克隆细胞，连续传代9-11代后进行细胞鉴定。
进一步地，步骤一和步骤三中所述DMEM培养基含9-11%胎牛血清、90-110U/ml青霉素、90-110ug/ml链霉素。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明构建了能稳定表达BTG2蛋白的Eca109细胞株，为今后研究ESCC的基因诊断及靶向治疗提供了有力的实验工具。BTG2蛋白作为一个抗细胞增值蛋白，参与到细胞内的很多生物学活动中，如细胞分化、增殖、凋亡等，同时也涉及到肿瘤治疗过程中的放疗敏感性。Eca109细胞株可以通过稳定表达BTG2基因，可用以研究食管鳞状细胞癌的放疗敏感性问题，从而为开发BTG2相关的癌症治疗提供新的思路。
附图说明
图1为BTG2-Eca109细胞株BTG2蛋白表达水平Western blot检测结果；
图2为BTG2-Eca109细胞株BTG2的mRNA表达水平Q-PCR检测结果；
图3为BTG2-Eca109细胞株的CCK-8 增殖实验结果；
图4为BTG2-Eca109细胞株的的细胞划痕实验结果。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1~3中，pcDNA3.0载体购于北京华越洋生物公司，置于-20℃保存；293T细胞株、食管鳞状细胞癌细胞株Eca109购于中科院上海细胞库，置于-180℃保存，感受态细胞DH5α来源于北京天根生化科技公司，保存于-20℃，质粒小提试剂盒来源于北京天根生化科技公司。
实施例1
S1. 细胞培养
将Eca109细胞株复苏后用DMEM培养基（含9%胎牛血清、90U/ml青霉素、90ug/ml链霉素）在37℃、5% CO2的培养箱中常规培养，每天观察并更换培养基一次。当细胞生长到汇合度达到75%时用0.3%胰蛋白酶（0.2%Trypsin-0.53mM EDTA）消化细胞进行传代。转染质粒前细胞需传代2次以保证细胞状态良好。
S2. 构建重组质粒
设计基因序列，在BTG2全长的基因组核酸序列5端引入EcoRⅤ酶切位点，3端引入XhoⅠ酶切位点，将得到的序列送生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因片段合成，将合成产物采用EcoRⅤ和XhoⅠ进行双酶切，对酶切产物进行纯化，并在纯化产物中加入T4DNA连接酶与pcDNA3.0质粒（该质粒已采取EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切处理），在4℃连接15h，将连接产物转化至感受态细胞DH5α中，并将转化产物涂抹于含青霉素（50ug/ml）的LB琼脂糖培养皿中，37℃培养7.5h后挑取单克隆细胞加入LB培养液中37℃，200rpm摇菌15h。用质粒小提试剂盒提取质粒后进行EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切筛选，将筛选出的阳性克隆质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，并将序列比对无误的质粒命名为BTG2-pcDNA3.0。
S3. 转染
取293T细胞复苏后用DMEM培养基（含9%胎牛血清、90U/ml青霉素、90ug/ml链霉素）在37℃、5% CO2的培养箱中常规培养，待汇合度达到75%时弃去原先培养基，1ml PBS清洗2次后更换为Opti-MEM培养基。随后将S2中得到的BTG2-pcDNA3.0质粒用Lipofectamine2000感染293T细胞，每5.5h收集细胞上清液并更换新鲜的Opti-MEM培养基，收集7次后将上清液过滤并添加到S1中得到的Eca109细胞（汇合度25%）中，将Eca109细胞继续置于细胞培养箱中培养46h。
S4. 筛选
将S3中得到的Eca109细胞含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液并加入浓度为90μg/ml的嘌呤霉素进行筛选，一周后将存活的细胞培养于96孔板，并稀释至每孔1个细胞，9天后挑出单克隆细胞，连续传代11代后进行细胞鉴定。
实施例2
S1. 细胞培养
将Eca109细胞株复苏后用DMEM培养基（含11%胎牛血清、110U/ml青霉素、110ug/ml链霉素）在37℃、5% CO2的培养箱中常规培养，每天观察并更换培养基一次。当细胞生长到汇合度达到85%时用0.2%胰蛋白酶（0.3%Trypsin-0.53mM EDTA）消化细胞进行传代。转染质粒前细胞需传代3次以保证细胞状态良好。
S2. 构建重组质粒
设计基因序列，在BTG2全长的基因组核酸序列5端引入EcoRⅤ酶切位点，3端引入XhoⅠ酶切位点，将得到的序列送生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因片段合成，将合成产物采用EcoRⅤ和XhoⅠ进行双酶切，对酶切产物进行纯化，并在纯化产物中加入T4DNA连接酶与pcDNA3.0质粒（该质粒已采取EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切处理），在4℃连接17h，将连接产物转化至感受态细胞DH5α中，并将转化产物涂抹于含青霉素（50ug/ml）的LB琼脂糖培养皿中，37℃培养6.5h后挑取单克隆细胞加入LB培养液中37℃，200rpm摇菌13h。用质粒小提试剂盒提取质粒后进行EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切筛选，将筛选出的阳性克隆质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，并将序列比对无误的质粒命名为BTG2-pcDNA3.0。
S3. 转染
取293T细胞复苏后用DMEM培养基（含11%胎牛血清、110U/ml青霉素、110ug/ml链霉素）在37℃、5% CO2的培养箱中常规培养，待汇合度达到85%时弃去原先培养基，1ml PBS清洗3次后更换为Opti-MEM培养基。随后将S2中得到的BTG2-pcDNA3.0质粒用Lipofectamine2000感染293T细胞，每6.5h收集细胞上清液并更换新鲜的Opti-MEM培养基，收集9次后将上清液过滤并添加到S1中得到的Eca109细胞（汇合度35%）中，将Eca109细胞继续置于细胞培养箱中培养50h。
S4. 筛选
将S3中得到的Eca109细胞换含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液并加入浓度为110μg/ml的嘌呤霉素进行筛选，一周后将存活的细胞培养于96孔板，并稀释至每孔2个细胞，11天后挑出单克隆细胞，连续传代9代后进行细胞鉴定。
实施例3
S1. 细胞培养
将Eca109细胞株复苏后用DMEM培养基（含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素）在37℃、5% CO2的培养箱中常规培养，每天观察并更换培养基一次。当细胞生长到汇合度达到80%时用0.25%胰蛋白酶（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）消化细胞进行传代。转染质粒前细胞需传代3次以保证细胞状态良好。
S2. 构建重组质粒
设计基因序列，在BTG2全长的基因组核酸序列5端引入EcoRⅤ酶切位点，3端引入XhoⅠ酶切位点，将得到的序列送生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因片段合成，将合成产物采用EcoRⅤ和XhoⅠ进行双酶切，对酶切产物进行纯化，并在纯化产物中加入T4DNA连接酶与pcDNA3.0质粒（该质粒已采取EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切处理），在4℃连接16h，将连接产物转化至感受态细胞DH5α中，并将转化产物涂抹于含青霉素（50ug/ml）的LB琼脂糖培养皿中，37℃培养7h后挑取单克隆细胞加入LB培养液中37℃，200rpm摇菌14h。用质粒小提试剂盒提取质粒后进行EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切筛选，将筛选出的阳性克隆质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，并将序列比对无误的质粒命名为BTG2-pcDNA3.0。
S3. 转染
取293T细胞复苏后用DMEM培养基（含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素）在37℃、5% CO2的培养箱中常规培养，待汇合度达到80%时弃去原先培养基，1ml PBS清洗3次后更换为Opti-MEM培养基。随后将S2中得到的BTG2-pcDNA3.0质粒用Lipofectamine2000感染293T细胞，每6h收集细胞上清液并更换新鲜的Opti-MEM培养基，收集8次后将上清液过滤并添加到S1中得到的Eca109细胞（汇合度30%）中，将Eca109细胞继续置于细胞培养箱中培养48h。
S4. 筛选
将S3中得到的Eca109细胞换含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液并加入浓度为100μg/ml的嘌呤霉素进行筛选，一周后将存活的细胞培养于96孔板，并稀释至每孔1个细胞，10天后挑出单克隆细胞，连续传代10代后进行细胞鉴定。
将实施例3中得到的BTG2-Eca109细胞株进行检测，结果如下：
一、Western blot检测
RIPA裂解液收集BTG2-Eca109细胞，pcDNA3.0空载Eca109细胞（阴性对照）以及Eca109细胞（空白对照）的细胞全蛋白。20ug的蛋白上样量上样于10%SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，分别于BTG2抗体及GAPDH抗体于4℃孵育过夜，TBST洗3次后于HRP-山羊抗兔抗体及HRP-山羊抗小鼠抗体室温孵育1h,ECL显色。用化学发光成像系统成像及拍照。Western blot结果显示：BTG2-Eca109细胞中BTG2蛋白的表达高于阴性对照及空白对照，差异具有统计学意义（P＜0.001），阴性对照与空白对照之间差异无统计学意义（图1）。
二、Real-time PCR检测
Trizol法从BTG2-Eca109细胞，pcDNA3.0空载Eca109细胞（阴性对照）以及Eca109细胞（空白对照）中提取RNA，逆转录为cDNA后进行荧光定量PRC检测。PCR引物序列为BTG2:5`-GCGCGGGCTCTTCCTCTTTG-3`(forward)，5`-GGCGCAGCGATCCTTCACCT-3`(backward)，GAPDH:5`-TTCGCACACCTGGGTGCCAG-3`(forward)，5`-AAGAGGATCCACTCATCATTTATGGCTATG-3`。
采用SYBR Green qRT-PCR方法，按照 2-ΔΔCT对细胞中BTG2基因相对表达水平并分析统计。Real-time PCR 结果显示：BTG2-Eca109细胞中BTG2的mRNA的表达量显著高于阴性对照及空白对照组（P＜0.001），阴性对照与空白对照组之间差异无统计学意义（图2）。
三、BTG2-Eca109的增殖能力下降
取对数生长期的BTG2-Eca109细胞株的消化与计数，以5000个/孔的密度接种于96孔板中，另取pcDNA3.0空载体组，Eca109阴性对照组以同样的密度接种，置入37℃，5%CO2培养箱中培养。分别于24h，48h，72h以及96h分别取出，加入CCK-8试剂10ul，放回入细胞培养箱中孵育1h。取出96孔板，置于酶标仪下，检测450nm下的OD值并记录。结果显示BTG2-Eca109细胞株传代10次后其增殖能力的表达远低于阴性阴性对照及空白对照组，差异具有统计学意义（P＜0.001）（图3）。
四、BTG2-Eca109的迁移能力下降
取对数生长期的BTG2-Eca109细胞株的消化与计数，以8*105个/孔的密度接种于6孔板中，待 6 孔板中细胞汇合度达到 90%以上之后进行之后开始实验。pcDNA3.0空载体组，Eca109阴性对照组以同样的方式操作。从细胞培养箱中取出 6 孔板，弃去培养基。使用移液吸头标着直尺在孔中央沿着孔直径划一条竖线， PBS1ml冲洗6孔板3次，洗去划下的细胞，并加入完全培养基。与0 h、12 h以及 24 h把划好的六孔板置入显微镜下观察并拍照记录的细胞形态（图4）。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (2)

1.一种稳定表达BTG抗增殖因子2的食管鳞状细胞癌细胞株，其特征在于：所述细胞株为BTG2-Eca109细胞株。
2.权利要求1所述的一种稳定表达BTG抗增殖因子2的食管鳞状细胞癌细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将食管鳞状细胞癌细胞株Eca109通过BTG2重组质粒转染后进行筛选，最终得到可稳定表达BTG抗增殖因子2的BTG2-Eca109细胞株。
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