CN115490758A - 一种用于治疗或辅助治疗结直肠癌的抗肿瘤多肽ccr313及其应用 - Google Patents

一种用于治疗或辅助治疗结直肠癌的抗肿瘤多肽ccr313及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗或辅助治疗结直肠癌的抗肿瘤多肽CCR313，所述抗肿瘤多肽CCR313由LINC00313:6的开放阅读框翻译而来，其序列如序列表1所示；抗肿瘤多肽CCR313由77个氨基酸组成，其序列如序列表2所示；抗肿瘤多肽CCR313通过人工合成获得。上述技术方案，具有抗肿瘤作用的多肽CCR313，其通过抑制结直肠癌细胞增殖转移及侵袭达到治疗或辅助治疗结直肠癌的作用。另外，该多肽易于在体外合成，方便临床应用。解决目前结直肠癌五年生存率低，死亡率高居不下的问题。因此，多肽CCR313具有潜在的商业产业价值，可广泛应用于肿瘤，尤其是晚期结直肠癌治疗技术领域之中。

Description

一种用于治疗或辅助治疗结直肠癌的抗肿瘤多肽CCR313及其 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于治疗或辅助治疗结直肠癌的抗肿瘤多肽CCR313及其应用。
背景技术
2020年结直肠癌世界发病病例超过190万，发病率占全球癌症新发病例总数的10.0％，位列全球第三，同时结直肠癌已成为我国第三大恶性肿瘤。SEER数据库显示，结直肠癌的世界五年生存率仅为64.7％，低于肾癌、白血病等；死亡率高达9.2％，仅次于肺癌。结直肠癌起病隐匿，而肠镜作为常规的早期结直肠癌筛查方式，价格高、检查流程繁杂，这些因素导致结直肠癌通常在临床晚期出现肠梗阻、便血等严重症状后才被确诊，这也是结直肠癌五年生存率低的原因。
目前尚缺少足够廉价可靠，可用作常规筛查的早期结直肠癌诊断标志物；而且临床常用的mFOLFOX化疗方案仍是晚期结直肠癌的主要治疗手段。近年来，虽然贝伐单抗、帕尼单抗、西妥昔单抗、阿柏西普、雷莫芦单抗等靶向药物及免疫治疗在部分结直肠癌患者中有一定的疗效，但仅部分患者能从中获益。因此，为了改善晚期结直肠癌患者的预后，我们亟需一种能够用于治疗或辅助治疗结直肠癌的药物。
分子靶向的多肽药物已成为抗癌药物研究的热点和发展方向，在多种肿瘤治疗中取得可喜进展，并相继投入临床使用；目前而言，全球范围内已有80余种多肽药物上市。多肽由几个到几十个天然或非天然氨基酸缩合而成，能够通过天然产物提取、基因重组和化学合成等方式获得。多肽易于合成改造和优化组合的特点利于我们对其进行修饰或融合，改造出比天然内源表达多肽肿瘤靶向性更强和口服给药顺应性更佳的重组多肽。多肽药物具有免疫原性低、组织渗透性好、安全性高、不易在组织中蓄积等优点，在抗肿瘤等方面都表现出显著的疗效。多肽药物的抗肿瘤机制多样，它们可通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管形成、抑制肿瘤增殖转移等机制抑制肿瘤的发生发展，这取决于多肽的靶点。
CCR313是一个特殊的多肽，它由原本被认为不翻译蛋白的RNA——长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA/lincRNA)翻译而来，由我们首次发现。具体地，我们过表达了其对应的lncRNA(LINC00313:6)，通过Western Blot实验发现了其翻译蛋白的存在，即CCR313。虽然LINC00313在国际上已被10篇文献提及，被证明与多种癌症、骨关节炎有关，但无一例外的，他们均未发现LINC00313:6转录本的翻译能力，CCR313无疑是新多肽。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于治疗或辅助治疗结直肠癌的抗肿瘤多肽CCR313，替代或辅助现有mFOLFOX等化疗方案，避免或减小化学疗法在治疗结直肠癌时易产生耐受和严重不良反应的问题；可以与现有单靶点多肽靶向药物互补，对抗肿瘤对单靶点的耐药性。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种用于治疗或辅助治疗结直肠癌的抗肿瘤多肽CCR313，抗肿瘤多肽CCR313由77个氨基酸组成，其全部序列为：
MTTLSKSKQPSAAGNLDEQTPGECFCRSCFVTSSEVWKRWKHLDPACAADPWEAPTPRIEKPDGKECLGRTSCPRLA。
作为优选的，所述抗肿瘤多肽CCR313由LINC00313:6的开放阅读框翻译而来，其序列如序列表1所示。
作为优选的，抗肿瘤多肽CCR313通过人工合成获得。
本发明还提供一种用于治疗或辅助治疗结直肠癌的抗肿瘤多肽CCR313在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供一种药物组合，包括含有所述的抗肿瘤多肽CCR313、能杀死肿瘤细胞的制剂以及将药物分散并转入体内发挥生物学功能的药物载体。
所述制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、靶向药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。
所述药物载体为纳米材料、脂质体、聚乙二醇修饰或油性化合物中的任意一种，或多种油性化合物组成的混合物。
本发明的优点是：与现有技术相比，本发明具有抗肿瘤作用的多肽CCR313，其通过抑制结直肠癌细胞增殖转移及侵袭达到治疗或辅助治疗结直肠癌的作用。另外，该多肽易于在体外合成，方便临床应用。解决目前结直肠癌五年生存率低，死亡率高居不下的问题。替代或辅助现有mFOLFOX等化疗方案，避免或减小化学疗法在治疗结直肠癌时易产生耐受和严重不良反应的问题；可以与现有单靶点多肽靶向药物互补，对抗肿瘤对单靶点的耐药性。
因此，多肽CCR313具有潜在的商业产业价值，可广泛应用于肿瘤，尤其是晚期结直肠癌治疗技术领域之中。
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为本发明实施例3中多肽CCR313过表达效果Western Blot图；
图2为本发明实施例4中CCK-8法检测多肽CCR313对人结肠腺癌细胞系Caco-2增殖能力影响曲线图；
图3为本发明实施例5中transwell实验检测多肽CCR313对人结肠腺癌细胞系Caco-2迁移能力影响结果示意图；
图4为本发明实施例6中transwell实验检测多肽CCR313对人结肠腺癌细胞系Caco-2侵袭能力影响结果示意图。
具体实施方式
本发明公开的一种用于治疗或辅助治疗结直肠癌的抗肿瘤多肽CCR313，抗肿瘤多肽CCR313由77个氨基酸组成，其全部序列为：MTTLSKSKQPSAAGNLDEQTPGECFCRSCFVTSSEVWKRWKHLDPACAADPWEAPTPRIEKPDGKECLGRTSCPRLA。
作为优选的，所述抗肿瘤多肽CCR313由LINC00313:6的开放阅读框翻译而来，其序列如序列表1所示。
作为优选的，抗肿瘤多肽CCR313通过人工合成获得。
本发明还提供一种用于治疗或辅助治疗结直肠癌的抗肿瘤多肽CCR313在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供一种药物组合，包括含有所述的抗肿瘤多肽CCR313、能杀死肿瘤细胞的制剂以及将药物分散并转入体内发挥生物学功能的药物载体。
所述抗肿瘤多肽CCR313由人工合成，为由77个氨基酸组成的多肽，其序列见“序列表2”
所述制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、靶向药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。
所述药物载体为纳米材料、脂质体、聚乙二醇修饰或油性化合物中的任意一种，或多种油性化合物组成的混合物。
作为优选的，所述制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、抗血管新生药物/西妥昔单抗等靶向药物、PD-1/PD-L1单抗等免疫药物、激素及金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。
下面将结合具体实施例对本发明做进一步的说明，以助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
主要材料和仪器：
McCoy's 5A培养基；DMEM基础培养基；RPMI-1640培养基；opti-MEM培养基；LB培养基；胎牛血清；氨苄青霉素、链霉素；pcDNA3.1-EGFP快速连接试剂盒(T4连接酶)；OMEGA凝胶回收试剂盒；EasyTaq DNA Polymerase；DNA ladder,100-2000bp；小量质粒抽提试剂盒；Lipo3000转染染试剂盒；HindIII限制性内切酶，BamHI限制性内切酶；低分子量蛋白Maker；胰蛋白酶；PBS；CCK-8试剂盒；高效RIPA组织/细胞裂解液；蛋白定量(BCA)测试试剂盒；三氟乙酸(TFA)；茴香硫醚；1，2-乙二硫醇；苯酚；DEPC水；Trizol；丙三醇；氯仿；乙醚。
实施例1：多肽CCR313的合成、纯化
抗肿瘤多肽CCR313是由长链非编码RNA LINC00313:6翻译所得，LINC00313:6序列见“序列表3”；人工合成方式采用固相合成方式(Solid Phase Peptide Synthesis,SPPS)，具体如下：根据多肽CCR313序列:MTTLSKSKQPSAAGNLDEQTPGECFCRSCFVTSSEVWKRWKHLDPACAADPWEAPTPRIEKPDGKECLGRTSCPRLA；使肽链从羧基端向氨基端逐个残基依次延申，待多肽合成后，用适量(8ml/g树脂)切割液(TFA：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：H2O＝87.5：5：2.5：2.5：2.5)将多肽从树脂上分离2.5h，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:6)离心沉降四次，然后用高效液相色谱分离纯化，冻干，得到一定纯度的多肽。
实施例2：过表达载体pcDNA313的构建与转染
化学合成多肽对应的开放阅读框目的片段，其序列见“序列表1”，通过PCR法并添加HindIII和BamHI酶切位点和保护碱基，
按下列组分配置PCR反应液并轻轻混匀(避免剧烈涡旋振荡)，见表1，所用引物序列如“序列表4”
表1：
试剂名称 使用量
2×qPCR SYBR Green Master Mix 10μL
Forward Primer(10uM) 0.5μL
Reverse Primer(10uM) 0.5μL
DNA 模板 1μL
RNase free H2O 8μL
Total 20μL
进行PCR反应(二步法)
Stage1：预变性95℃5min；
Stage2：PCR反应95℃10s，60℃30～34s，35cycles；
Stage3：冷却保存4℃∞
2％琼脂糖凝胶电泳25min，分离产物后使用OMEGA凝胶回收试剂盒回收产物。使用HindIII酶和BamHI酶双酶切质粒和目的片段后对进行琼脂糖凝胶电泳及胶回收，使用T4连接酶16℃过夜连接质粒与目的片段；将连接产物转化到受体菌DH5a中，使用含100μg/mLAmpicillin(氨苄)的LB培养基涂板，培养过夜，挑取阳性单克隆菌落,并使用PCR法鉴定，方法同上，若出现相同条带则表明构建成功。对上述构建的质粒种菌以及原pcDNA3.1种菌进行摇菌扩增，使用小量质粒提取试剂盒抽提质粒，Lipo3000(脂质体3000)与质粒按2μL/μg的比例配置，配合Opti-MEM培养基，转染Caco-2、COLO、HT-29三种结直肠癌细胞系，8h后分别使用DMEM、McCoy's 5A、RPMI-1640培养基培养；48小时后荧光显微镜下通过荧光蛋白观察转染效率。
实施例3：Western Blot验证pcDNA313质粒过表达多肽CCR313效果
转染成功后使用RIPA裂解液裂解实施例2中经转染的Caco-2、COLO、HT-29细胞和未经转染的Caco-2、COLO、HT-29细胞，收集产物，BCA法蛋白定量，根据结果，按30ug/10ul计算所需的蛋白体积、纯水体积及5*Loading Buffer体积，将上述成分混合后充分震荡，95摄氏度煮5-10分钟即可储存备用。制备浓缩胶、分离胶，通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶恒压80V电泳，待marker分开后将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝电泳至胶底，电泳结束后将胶板取出转膜至PVDF膜上，封闭液封闭2h，洗涤后一抗4℃孵育过夜，所用一抗为GAPDH和定制抗CCR313抗体；洗涤后抗兔二抗孵育2h，利用ECL发光液和曝光机曝光，保存图像。
参见图1，在Caco-2、COLO、HT-29三种结直肠癌细胞系中进行了验证；其中多肽CCR313大小为9kD；管家基因GAPDH蛋白作为内参，大小为37kD；pcDNA3.1为空载过表达质粒；pcDNA313为含有多肽CCR313对应DNA片段的过表达质粒。
实施例4：CCK-8法检测多肽CCR313对人结肠腺癌细胞系Caco-2增殖能力影响
使用DMEM培养基培养实施例2中pcDNA313转染的Caco-2细胞系(pcDNA313组)以及pcDNA3.1转染的Caco-2细胞系(pcDNA3.1组)至对数生长期，计数细胞并调整细胞浓度至4*105个/mL，以100μL/孔接种于96孔培养板中；设置实验组和空载对照组，各组设三个复孔；待细胞贴壁后，给予相应处理，分别孵育24h、48h、72h；每孔加入10ul CCK8，37℃孵育4h后，置酶标仪测450nm波长处的吸光度(OD)值；评估各组细胞相对增殖能力变化，绘制曲线图，见图2。
实施例5：transwell实验检测多肽CCR313对人结肠腺癌细胞系Caco-2迁移能力
使用DMEM培养基培养实施例2中pcDNA313转染的Caco-2细胞系(pcDNA313组)以及pcDNA3.1转染的Caco-2细胞系(pcDNA3.1组)至收集对数生长期细胞，胰酶消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，调整浓度为2×105/ml；在上室加入100μl细胞悬液，在下室加入600μl含10％血清的培养基，培养箱培养24h后将其下表面浸泡在70％甲醇溶液中，固定30min～60min，用结晶紫或台盼蓝染色，镜检，并计算PET膜下表面的细胞数。transwell实验检测多肽CCR313对人结肠腺癌细胞系Caco-2迁移能力影响结果图及柱状图，如图3所述。
实施例6：transwell实验检测多肽CCR313对人结肠腺癌细胞系Caco-2侵袭能力
使用DMEM培养基培养实施例2中pcDNA313转染的Caco-2细胞系(pcDNA313组)以及pcDNA3.1转染的Caco-2细胞系(pcDNA3.1组)，胰酶消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，调整浓度为2×105/ml；在4℃条件下将100μl含300μl/mlMatrigel胶的无血清培养基均匀涂抹一层于细胞培养池的PET膜上表面，然后将培养池轻轻放入24孔板孔内，37℃放置3h，取出于超净工作台过夜干燥；在上室加入100μl细胞悬液，在下室加入600μl含10％血清的培养基，培养箱培养24h后将其下表面浸泡在70％甲醇溶液中，固定30min～60min，用结晶紫或台盼蓝染色，镜检，并计算PET膜下表面的细胞数。transwell实验检测多肽CCR313对人结肠腺癌细胞系Caco-2侵袭能力影响结果图及柱状图，如图4所示。
本发明中涉及的序列表如下所示：
序列表1
开放阅读框(ORF)：
ATGACAACTCTGAGCAAGTCAAAACAACCGTCAGCAGCGGGAAACCTCGATGAACAAACACCGGGAGAGTGTTTCTGCAGATCCTGCTTTGTGACTTCGAGTGAAGTGTGGAAGCGCTGGAAGCACTTAGACCCTGCCTGTGCCGCAGACCCCTGGGAGGCACCAACACCCCGGATCGAGAAGCCCGATGGGAAAGAATGTCTGGGAAGGACGTCATGCCCGAGGCTTGCGTGA
序列表2
多肽CCR313序列：
MTTLSKSKQPSAAGNLDEQTPGECFCRSCFVTSSEVWKRWKHLDPACAADPWEAPTPRIEKPDGKECLGRTSCPRLA*
序列表3
LINC00313:6
>NR_026863.1Homo sapiens long intergenic non-protein coding RNA 313(LINC00313),long non-coding RNA
CTAGAGAGCTGGCGCACCTCCTGGGCCTGACGCGGGCTTCCTGGATTGCATAAAGGCTCCTTCTCCTTACATAGCCAGGGCAAAGGTGCATGACAACTCTGAGCAAGTCAAAACAACCGTCAGCAGCGGGAAACCTCGATGAACAAACACCGGGAGAGTGTTTCTGCAGATCCTGCTTTGTGACTTCGAGTGAAGTGTGGAAGCGCTGGAAGCACTTAGACCCTGCCTGTGCCGCAGACCCCTGGGAGGCACCAACACCCCGGATCGAGAAGCCCGATGGGAAAGAATGTCTGGGAAGGACGTCATGCCCGAGGCTTGCGTGACAGTTTCCACTCACAGTGCGCTCACTCTGAACCTCTGTGCACACGATGGGCCTGCATCTCTTCCCACTATCTGCTAGGAAACACGAGGGGAAGGAAATGACCGCAGAAGGGAGTGCACCGTGGGGGCAGGAGGTGCTGCGGCCAATGGGCAGTGCTGGGAGATGAAACCAACAGCGGCGATTGCCCCAGAAAGAACTTGGCGCTGCTAAGGCAATGGCGGCCCGAAAGAGGCCCCTGACGCATGAGGAGCGGCCGC
序列表4
过表达载体构建引物序列
Forward primer：CCAAGCCTTATGACAACTCTGAGCAAGTCAAAAC
Reverse primer：CGGGATCCTCACGCAAGCCTCGGGCATGA
本发明具有抗肿瘤作用的多肽CCR313，其通过抑制结直肠癌细胞增殖转移及侵袭达到治疗或辅助治疗结直肠癌的作用。另外，该多肽易于在体外合成，方便临床应用。解决目前结直肠癌五年生存率低，死亡率高居不下的问题。替代或辅助现有mFOLFOX等化疗方案，避免或减小化学疗法在治疗结直肠癌时易产生耐受和严重不良反应的问题；可以与现有单靶点多肽靶向药物互补，对抗肿瘤对单靶点的耐药性。
因此，多肽CCR313具有潜在的商业产业价值，可广泛应用于肿瘤，尤其是晚期结直肠癌治疗技术领域之中。
上述实施例对本发明的具体描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，本领域的技术工程师根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整均落入本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于治疗或辅助治疗结直肠癌的抗肿瘤多肽CCR313，其特征在于：抗肿瘤多肽CCR313由77个氨基酸组成，其全部序列为：MTTLSKSKQPSAAGNLDEQTPGECFCRSCFVTSSEVWKRWKHLDPACAADPWEAPTPRIEKPDGKECLGRTSCPRLA。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗或辅助治疗结直肠癌的抗肿瘤多肽CCR313，其特征在于：所述抗肿瘤多肽CCR313由LINC00313:6的开放阅读框翻译而来，其序列如序列表1所示。
3.根据权利要求2所述的一种用于治疗或辅助治疗结直肠癌的抗肿瘤多肽CCR313，其特征在于：抗肿瘤多肽CCR313通过人工合成获得。
4.根据权利要求1所述的一种用于治疗或辅助治疗结直肠癌的抗肿瘤多肽CCR313在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.一种药物组合，其特征在于：包括含有权利要求1或2所述的抗肿瘤多肽CCR313、能杀死肿瘤细胞的制剂以及将药物分散并转入体内发挥生物学功能的药物载体。
6.一种含有权利要求5所述的药物组合的制剂，其特征在于：所述制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、靶向药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。
7.一种含有权利要求5所述的药物组合的药物载体，其特征在于：所述药物载体为纳米材料、脂质体、聚乙二醇修饰或油性化合物中的任意一种，或多种油性化合物组成的混合物。
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