CN114729394B - 核酸纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及核酸纯化方法，具体地涉及包括使用含有亲水性有机溶剂的溶液使所述核酸结晶的第一步骤；以及用高湿热风干燥结晶的核酸的第二步骤的核酸纯化方法。
Description
[技术领域]
本申请涉及核酸纯化方法，具体地涉及包括使用含有亲水性有机溶剂的溶液使所述核酸结晶的第一步骤；以及用高湿热风干燥结晶的核酸的第二步骤的核酸纯化方法。
[背景技术]
作为核酸结晶方法，使用亲水性有机溶剂的方法是主要使用的。在核酸用于食品的情况下，由于国家对有机溶剂残留量的规定，最终产品中有机溶剂的去除是一个非常重要的问题。通常用于核酸结晶的亲水性有机溶剂包括乙醇、甲醇等。特别地，由于对甲醇残留量的规定是严格的，因此需要完全去除甲醇。然而，使用有机溶剂的方法(韩国专利第10-0051324号)仍然通常用作核酸结晶方法。在这方面，除了该专利之外，韩国专利第10-0083595号、中国专利第100395256号、中国专利第101863943号、韩国专利第10-0025552号和韩国专利第10-0117428号等也公开了使用有机溶剂的核酸结晶方法。
核酸晶体，尤其是以七水合物的形式存在的鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物晶体，在低温如室温下也失去结晶水，并且当温度从室温升高至80℃达约30分钟时，七水合物转化为2.5水合物时，发生约70％的损失(图1)。鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物晶体中水合物的这种损失降低了晶体的结晶度并引起晶体弱化和晶形的变化，因此在干燥期间将结晶水保持在七水合物水平是非常重要的。当存在大量的表面水时，晶体转变成无定形形式，发生凝聚，因此在纯化过程中也发生由于凝聚现象而导致的损失。
由于核酸的这些特性，已经在低温如室温下进行干燥，作为去除结晶核酸中残留的有机溶剂的方法。然而，存在的问题是，在低温下干燥核酸晶体的情况下，不能完全去除晶体中残留的有机溶剂。另一方面，在高温下进行干燥以完全去除晶体中残留的有机溶剂(就有机溶剂而言)是有利的，但存在的问题是，由于结晶水的蒸发，核酸晶体的产品质量降低，因此需要一种替代方法。
[公开内容]
[技术问题]
本申请的目的是提供核酸纯化方法，其包括使用含有亲水性有机溶剂的溶液使核酸结晶的第一步骤；以及用温度为30℃以上且90℃以下和相对湿度为40％以上且90％以下的空气干燥结晶的核酸的第二步骤。
[技术方案]
在本公开内容中公开的每个描述和实施方案也可以应用于其它描述和实施方案。也就是说，本公开内容中公开的各种要素的所有组合都落入本公开内容的范围内。此外，本公开内容的范围不受以下具体描述的限制。
此外，本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规实验来确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同物。此外，这些等同物应被解释为落入本发明的范围内。
另外，在整个说明书中，当一个部分被称为“包括”一个要素时，应理解，除非特别描述相反的内容，否则可以进一步包括其它要素，而不是排除其它要素。
在下文中，将详细描述本发明。
为了实现该目的，本申请的一个方面提供了核酸纯化方法，其包括使用含有亲水性有机溶剂的溶液使核酸结晶的第一步骤；以及用温度为30℃以上且90℃以下和相对湿度为40％以上且90％以下的空气干燥结晶的核酸的第二步骤。
本申请的核酸纯化方法包括使用含有亲水性有机溶剂的溶液使核酸结晶的第一步骤。在本申请中，结晶方法没有特别限制，只要它是使用含有亲水性有机溶剂的溶液的方法。
如本文所用，术语“核酸”是指由碱基、糖和磷酸组成的化合物。具体地，在本申请中，核酸可以是选自鸟苷5’-单磷酸(5’-GMP)和肌苷5’-单磷酸(5’-IMP)的任何一种或多种，更具体地鸟苷5’-单磷酸(5’-GMP)，但不限于此。
在本申请中，核酸意在包括核酸化合物的盐和盐的水合物形式。
如本文所用，术语“盐”是指其中阳离子和阴离子通过静电引力彼此键合的形式，并且通常可以是金属盐、有机碱的盐、无机酸的盐、有机酸的盐、碱性或酸性氨基酸的盐等。例如，金属盐可以是碱金属盐(钠盐、钾盐等)，碱土金属盐(钙盐、镁盐、钡盐等)，铝盐等；有机碱的盐可以是三乙胺，吡啶，甲基吡啶，2,6-二甲基吡啶，乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，环己胺，二环己胺，N,N-二苄基乙二胺等的盐；无机酸的盐可以是盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等的盐；有机酸的盐可以是甲酸、乙酸、三氟乙酸、邻苯二甲酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等的盐；碱性氨基酸的盐可以是精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等的盐；以及酸性氨基酸的盐可以是天冬氨酸、谷氨酸等的盐。
如本文所用，术语“水合物”是指这样的形式，其中水与化合物键合，并且其中包含的水在水合物为晶体时被称为结晶水。
换句话说，在本申请中，核酸是指核酸化合物、其盐或盐的水合物。具体地，核酸可以是选自以下的任何一种或多种：鸟苷5’-单磷酸二钠盐(5’-GMP 2Na)和肌苷5’-单磷酸二钠盐(5’-IMP 2Na)，它们分别是鸟苷5’-单磷酸(5’-GMP)的盐和肌苷5’-单磷酸(5’-IMP)的盐。更具体地，核酸可以是鸟苷5’-单磷酸二钠盐(5’-GMP 2Na)，但不限于此。
具体地，核酸可以是鸟苷5’-单磷酸二钠盐(5’-GMP 2Na)和肌苷5’-单磷酸二钠盐(5’-IMP 2Na)的水合物。具体地，核酸可以是鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物(5’-GMP 2Na7H2O)或肌苷5’-单磷酸二钠盐7.5水合物(5’-IMP 2Na 7.5H2O)，但不限于此。
如本文所用，术语“亲水性有机溶剂”是指表现出亲水特性的有机溶剂。具体地，有机溶剂可以是选自甲醇和乙醇的任何一种或多种，更具体地是甲醇，但不限于此。
本申请的第一步骤可以具体地包括向核酸浓缩物中加入含有亲水性有机溶剂的溶液的步骤(i)；冷却添加有溶液的核酸浓缩物的步骤(ii)；通过离心分离所产生的核酸晶体浆料的步骤(iii)；以及洗涤分离的核酸晶体的步骤(iv)，但不限于此。
在本申请中，相对于核酸浓缩物，亲水性有机溶剂可以以1.0RV以上且1.5RV以下，特别是1.0RV以上且1.5RV以下、1.1RV以上且1.4RV以下、1.1RV以上且1.3RV以下、或1.15RV以上且1.25RV以下加入，但不限于此。
在本申请中，冷却可以进行1小时以上且3小时以下，特别是1小时以上且3小时以下、或1.5小时以上且2.5小时以下，但不限于此。
在本申请中，冷却可以在20℃以上且30℃以下，特别是在20℃以上且30℃以下、22℃以上且28℃以下、23℃以上且27℃以下、或24℃以上且26℃以下进行，但不限于此。
在本申请中，离心可以在2000rpm以上且3000rpm以下进行，但不限于此。
本申请的核酸纯化方法包括用温度为30℃以上且90℃以下和相对湿度为40％以上且90％以下的空气干燥结晶的核酸的第二步骤。
本申请的第二步骤可以具体地包括控制空气的温度和湿度的步骤(a)；以及用温度和湿度控制的空气干燥在第一步骤中获得的核酸晶体的步骤(b)，但不限于此。
在本申请中，空气可以具有30℃以上且小于60℃的温度和40％以上且90％以下的相对湿度。具体地，温度可以是30℃以上且小于60℃、30℃以上且55℃以下、35℃以上且55℃以下、35℃以上且50℃以下、40℃以上且55℃以下、45℃以上且55℃以下、45℃以上且55℃以下、45℃以上且小于60℃、或50℃以上且小于60℃，以及相对湿度可以是40％以上且90％以下、55％以上且85％以下、50％以上且80％以下、40％以上且60％以下、45％以上且55％以下、或80％以上且90％以下，但温度和相对湿度不限于此。
在本申请中，空气可以具有60℃以上且90℃以下的温度和70％以上且90％以下的相对湿度。具体地，温度可以是60℃以上且90℃以下、60℃以上且85℃以下、60℃以上且80℃以下、65℃以上且90℃以下、65℃以上且80℃以下、或65℃以上且75℃以下、以及相对湿度可以是70％以上且90％以下、75％以上且90％以下、或80％以上且90％以下，但温度和相对湿度不限于此。
在本申请中，干燥可以进行2小时以上且7小时以下。具体地，干燥时间可以是2小时以上且7小时以下、2.5小时以上且6.5小时以下、3小时以上且6小时以下，但不限于此。
在本申请中，干燥方法没有特别限制，只要它是使用高湿度热空气，即温度和湿度控制空气的方法。具体地，可以使用能够控制空气湿度的干燥器进行干燥，但不限于此。
在本申请中使用的干燥器由温度和湿度控制装置和干燥器小室组成(图2)。可以将温度和湿度由温度和湿度控制装置控制的高湿度热空气供应到干燥器小室，然后可以引入湿晶体以去除核酸晶体中的有机溶剂和表面水。图2是示出可用于本申请的干燥器的实例的示意图。
[有益效果]
在本申请的核酸纯化方法中，使用亲水性有机溶剂进行核酸结晶后剩余的有机溶剂可以通过用高湿度热空气干燥而完全去除。在干燥过程中也保持核酸中的结晶水，保持水合物结构，不会发生晶体的凝聚，从而获得优异的收率。
仅通过用高湿度热空气干燥即表现该效果，因此还具有降低成本的效果，并且该核酸纯化方法可以广泛地用于核酸的更经济的纯化。
[附图简述]
图1是说明根据温度核酸晶体中结晶水损失的图；以及
图2是说明可用于本申请的干燥器的实例的示意图。
[发明详述]
在下文中，将参考示例性实施方案更详细地描述本发明的配置和效果。然而，这些示例性实施方案仅用于说明的目的，并且本发明的范围不旨在受这些示例性实施方案的限制。
实验例1
实验例1-1：核酸的结晶
制备浓缩物，其中鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物以约250g/L存在。在38℃下以0.2RV/hr的流速加入对应于相对于浓缩物体积的1.2RV(相对体积)的亲水性有机溶剂，持续6小时。从终止输入的时间点开始进行冷却至25℃持续2小时，并且使用离心机分离晶体浆料。此时，以2000rpm至3000rpm的速度进行离心，将含有50％亲水性有机溶剂的水溶液用作洗涤溶液，并通过以2000rpm喷雾洗涤晶体。洗涤完成后，获得水分含量为30％的鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物的湿晶体。
实验例1-2：结晶核酸的干燥
使用安装在干燥器底部的湿度控制装置控制用于晶体干燥的高湿度热空气(图2)。在将低温空气加热到高温后，控制使用湿度。在通过湿度控制装置稳定后，将高湿度热空气供应到干燥器小室。此后，引入在实验例1-1中获得的湿晶体以去除核酸晶体中的有机溶剂和表面水。使用安装在小室内的热湿度计观察干燥器内的温度和湿度。
实验例2：晶体分析
实验例2-1：有机溶剂含量变化的分析
设备：Hewlett 5890packard系列2
柱：Porapak q(waters associates，80/100填充柱supelco中的6FT1/8)
载气：氢气、氮气
检测器类型：FID
烘箱温度：140℃
样品入口温度：150℃
检测器温度：175℃
样品注射体积：1μL
为了分析晶体中的有机溶剂含量，精确称量1.0000g鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物晶体，将其置于0.01L容量瓶中，并用超纯水稀释以制备100g/L样品。然后，制备50mg/L甲醇(或乙醇)标准试剂(J.T.Baker>99.0％)，将标准试剂用作外标，并通过气相色谱(GC)分析样品。
实验例2-2：通过测量残留水合物分析结晶水的变化
为了分析残留的水合物含量，精确称量20mg鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物晶体，并将其置于热重分析仪盘中。之后，以2℃/min的速率将热重分析仪的温度从25℃的初始温度升高至300℃，以观察重量变化。此时，在鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物晶体中，在约200℃区域中发生23.6％的重量变化，这可以被认为是由于七水合物蒸发引起的重量变化，并且通过此来分析残留的水合物含量。
实验例2-3：收率变化的分析
为了分析干燥后的收率，在干燥期间发生的损失通过测量干燥完成后收集在安装在干燥器顶部的袋式过滤器中的细粉的重量来测量。
实验例3：结晶水随温度和湿度条件变化的观察
在通过安装在干燥器底部的湿度控制装置改变干燥器小室中的温度和湿度条件的同时，观察鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物湿晶体中结晶水的变化。
结果，如表1所呈现的，当在30℃以上且90℃以下的温度和40％以上且90％以下的相对湿度的条件下进行干燥时，发现残留水合物为12.7％至25.2％。
当在30℃以上且小于60℃的温度和40％以上的相对湿度或60℃以上且90℃以下的温度和80％以上的相对湿度的条件下进行干燥时，证实残留水合物为21.4％至25.2％，并且因此已经证实在上述范围内存在显著更大量的残留水合物。
[表1]
通过结果发现，在温度和湿度条件下在干燥器中长期处理也保持结晶水。由于水合物结构在干燥过程期间不变形(因为结晶水为约23.6％(±2％)，这是鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物晶体中结晶水的理论量)，已经证实不发生晶体的凝聚现象，并且没有因凝聚而导致的收率损失。另外，已经证实结晶度也是优异的，因为没有过度干燥过程。
通过这一点，已经证实当温度和相对湿度在该范围内时，逐步保持结晶水，可以完全去除有机溶剂，并且不会发生晶体的凝聚现象，并且由于水合物结构在干燥过程中不变形，因此不会因凝聚而导致的收率损失。
实施例1：核酸纯化I
在通过安装在干燥器底部的湿度控制装置将干燥器小室中的温度和湿度在35℃和50％保持恒定后，连续引入鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物湿晶体。此时，湿晶体中的水分(包括表面水和结晶水)为约30％。
结果，如表2所呈现的，当在34℃的温度和48％的相对湿度的条件下进行6小时干燥时，残留的水合物为22.3％，并且甲醇含量为0ppm。
[表2]
根据结果发现，在温度和湿度条件下，在干燥过程中逐步保持结晶水，并且可以完全去除甲醇。另外，已经证实不会发生晶体的凝聚现象，并且由于水合物结构在干燥过程中不变形，因此没有因凝聚而导致的收率损失。
实施例2：核酸纯化II
在通过安装在干燥器底部的湿度控制装置将干燥器小室中的温度和湿度在55℃和60％保持恒定后，连续引入鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物湿晶体。此时，湿晶体中的水分(包括表面水和结晶水)为约30％。
结果，如表3所呈现的，当在55℃的温度和60％的相对湿度的条件下进行3小时干燥时，残留的水合物为23％，并且甲醇含量为0ppm。
[表3]
根据结果发现，在温度和湿度条件下，在干燥过程中逐步保持结晶水，并且可以完全去除甲醇。另外，已经证实不会发生晶体的凝聚现象，并且由于水合物结构在干燥过程中不变形，因此没有因凝聚而导致的收率损失。
实施例3：核酸纯化III
在通过安装在干燥器底部的湿度控制装置将干燥器小室中的温度和湿度在70℃和80％保持恒定后，连续引入鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物湿晶体。此时，湿晶体中的水分(包括表面水和结晶水)为约30％。
结果，如表4所呈现的，当在70℃的温度和80％的相对湿度的条件下进行3小时干燥时，残留的水合物为23％，并且甲醇含量为0ppm。
[表4]
根据结果发现，在温度和湿度条件下，在干燥过程中逐步保持结晶水，并且可以完全去除甲醇。另外，已经证实不会发生晶体的凝聚现象，并且由于水合物结构在干燥过程中不变形，因此没有因凝聚而导致的收率损失。
比较例1：核酸纯化IV
在通过安装在干燥器底部的湿度控制装置将干燥器小室中的温度(相对湿度不受控制的干空气；约13％的湿度)在37℃保持恒定后，连续引入鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物湿晶体。此时，湿晶体中的水分(包括表面水和结晶水)为约30％。
结果，如表5所呈现的，当在37℃的温度和不受控制的相对湿度(约13％)的条件下进行3小时干燥时，残留的水合物为13％，并且甲醇含量为9ppm。
[表5]
根据结果发现，在温度和湿度条件下完全去除甲醇是不可能的。另外，已经证实结晶度较差，因为结晶水为约13％，并且基于结晶水的理论量，发生约45％的损失，并且由于水合物的量不足，无法达到质量。
比较例2：核酸纯化V
在通过安装在干燥器底部的湿度控制装置将干燥器小室中的温度和湿度在70℃和50％保持恒定后，连续引入鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物湿晶体。此时，湿晶体中的水分(包括表面水和结晶水)为约30％。
结果，如表6所呈现的，当在70℃的温度和50％的相对湿度的条件下进行3小时干燥时，残留的水合物为13％，并且甲醇含量为0ppm。
[表6]
根据结果发现，在温度和湿度条件下可以完全去除甲醇。然而，已经证实结晶度较差，因为结晶水为约13％，并且基于结晶水的理论量，发生约45％的损失，并且由于水合物的量不足，无法达到质量。
根据上述结果发现，当保持本申请的温度和湿度范围，即30℃以上且90℃以下的温度和40％以上且90％以下的相对湿度的条件时，保持结晶水，完全去除甲醇，并且没有因晶体凝聚而导致的收率损失；具体地，在30℃以上且小于60℃的温度下保持40％以上且90％以下的湿度，以及在60℃以上且90℃以下的温度下保持70％以上且90％以下的湿度。另外，已经发现，当温度和湿度范围超出上述范围时，由于湿度的降低，结晶水蒸发或有机溶剂不能完全去除。
基于以上描述，本领域技术人员将理解，本公开内容可以以不同的具体形式实现，而不改变其技术精神或基本特征。因此，应理解，以上实施方案不是限制性的，而是在所有方面都是说明性的。本公开内容的范围由所附权利要求书而不是由其之前的说明书来限定，因此落入权利要求书的界限和范围或此种界限和范围的等同物内的所有改变和修改旨在由权利要求书涵盖。
Claims (3)
1.核酸纯化方法，所述方法包括：
使用含有亲水性有机溶剂的溶液使所述核酸结晶的第一步骤；以及
用温度为30℃以上且60℃以下和相对湿度为40％以上且90％以下的空气，或温度为65℃以上且75℃以下和相对湿度为75％以上且90％以下的空气干燥所述结晶的核酸的第二步骤；
其中所述核酸包括选自鸟苷5’-单磷酸二钠盐和肌苷5’-单磷酸二钠盐的任何一种或多种。
2.根据权利要求1所述的核酸纯化方法，其中所述核酸包括鸟苷5’-单磷酸二钠盐七水合物或肌苷5’-单磷酸二钠盐7.5水合物。
3.根据权利要求1所述的核酸纯化方法，其中所述亲水性有机溶剂是选自甲醇和乙醇的任何一种或多种。
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