CN114717281A - 通过优化碳源提升异源多杀菌素表达菌株发酵产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过优化碳源提升异源多杀菌素表达菌株发酵产量的方法，属于发酵领域。本发明方法为通过改变发酵培养基中的碳源提高多杀菌素异源表达菌株的多杀菌素产量，特别是利用麦芽糖作为碳源能显著提升多杀菌素产量。本发明还提供一种高产多杀菌素的发酵培养基：4％麦芽糖，1％甘油，3％可溶性淀粉，1.5％大豆蛋白胨，1％牛肉提取物，0.65％蛋白胨，0.05％酵母提取物，0.1％MgSO4，0.2％NaCl，0.24％CaCO3，pH 7.2。使用该培养基能够使多杀菌素异源表达菌株的多杀菌素产量达到70mg/L以上。
Description
技术领域
本发明属于发酵领域，具体涉及通过优化碳源提升异源多杀菌素表达菌株发酵产量的方法。
背景技术
多杀菌素作为仅次于阿维菌素的第二大杀虫剂，是目前被广泛使用的具有广谱杀虫活性的抗生素。因具有高效、无残留、对人畜无害等优点而获得三次美国“总统绿色化学品挑战奖”，也是少数被欧盟批准可在有机作物上使用的杀虫剂。多杀菌素是一种被叫做刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)的放线菌所产生，该菌株于上世纪八十年代在维尔京群岛上一座甘蔗酿酒厂附近的土壤中首次被人们分离获得。然而，该菌遗传操作及其苦难，发酵从种子到发酵周期长达22天，而且在发酵过程中极易发生污染，因此，为了规避该品种野生型菌种面临的遗传操作困难，发酵工艺不成熟的问题。现有做法是在将多杀菌素的基因簇转入链霉菌进行异源表达，然而多杀菌素异源表达的产量很低。遗传改造提升多杀菌素的产量受限，需要通过优化培养基进一步提升异源多杀菌素的产量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种提升多杀菌素异源表达菌株多杀菌素发酵产量的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提升多杀菌素异源表达菌株多杀菌素发酵产量的方法，为改变发酵培养基中的碳源。
进一步地，所述的提升多杀菌素异源表达菌株多杀菌素发酵产量的方法，为将麦芽糖作为发酵培养基的碳源。
进一步地，所述的提升多杀菌素异源表达菌株多杀菌素发酵产量的方法，为使用下述配方的发酵培养基进行发酵培养：4％(w/v)麦芽糖，1％(w/v)甘油，3％(w/v)可溶性淀粉，1.5％(w/v)Difco大豆蛋白胨，1％(w/v)牛肉提取物，0.65％(w/v)蛋白胨，0.05％(w/v)酵母提取物，0.1％(w/v)MgSO4，0.2％(w/v)NaCl，0.24％(w/v)CaCO3，调节pH至7.2。
进一步地，所述的多杀菌素异源表达菌株为异源表达多杀菌素的白色链霉菌，即转有多杀菌素基因簇的白色链霉菌。
更进一步地，所述的多杀菌素异源表达菌株为将链霉菌OE3菌株spnA基因和spnD基因的启动子分别替换为强启动子rpsLp-Cf和rpsLp-TP得到的菌株AD。
一种高产多杀菌素的发酵培养基，其配方为：4％(w/v)麦芽糖，1％(w/v)甘油，3％(w/v)可溶性淀粉，1.5％(w/v)Difco大豆蛋白胨，1％(w/v)牛肉提取物，0.65％(w/v)蛋白胨，0.05％(w/v)酵母提取物，0.1％(w/v)MgSO4，0.2％(w/v)NaCl，0.24％(w/v)CaCO3，调节pH至7.2。
本发明利用麦芽糖作为碳源使多杀菌素异源表达菌株的多杀菌素产量由20mg/L左右提升到70mg/L以上，显著提升了多杀菌素的产量。
附图说明
图1是pJTU1278-spnA质粒示意图。
图2是pJTU1278-spnA质粒与链霉菌基因组双交换示意图。
图3是菌株A的验证结果图。
图4是pJTU1278-spnD质粒示意图。
图5是pJTU1278-spnD质粒与链霉菌基因组双交换示意图。
图6是菌株AD的验证结果图。
图7是发酵培养基中残糖与多杀菌素产量的关系图。
图8是发酵培养基成分含量对多杀菌素产量影响的结果图。
图9是更换发酵培养基碳源对多杀菌素产量影响的结果图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1发酵培养基中残糖与多杀菌素产量的关系
在白色链霉菌中S.albus J1074中异源表达多杀菌素，申请人前期发表的文献(TAN G Y,DENG K,LIU X,et al.2017.Heterologous Biosynthesis of Spinosad:AnOmics-Guided Large Polyketide Synthase Gene Cluster Reconstitution inStreptomyces[J].ACS Synth Biol,6(6):995-1005.)和别人做类似工作发表的文献(SONGC,LUAN J,CUI Q,et al.2019.Enhanced Heterologous Spinosad Production from a79-kb Synthetic Multioperon Assembly[J].ACS Synth Biol,8(1):137-147.)中，均认为该发酵培养基(4％(w/v)葡萄糖，1％(w/v)甘油，3％(w/v)可溶性淀粉，1.5％(w/v)Difco大豆蛋白胨，1％(w/v)牛肉提取物，0.65％(w/v)蛋白胨，0.05％(w/v)酵母提取物，0.1％(w/v)MgSO4，0.2％(w/v)NaCl，0.24％(w/v)CaCO3，调节pH至7.2)产量最高。培养方法为：划菌株的孢子琼脂块到装有10mL TSB的PA瓶中，培养约24h至菌的最佳生长状态(棒状菌丝体，不宜为爆炸团成球状)。按照5％-10％的转接量转接到二级种子液中继续培养，约24h后将二级发酵液吸取5mL菌液至装有40mL发酵培养基(4％(w/v)葡萄糖，1％(w/v)甘油，3％(w/v)可溶性淀粉，1.5％(w/v)Difco大豆蛋白胨，1％(w/v)牛肉提取物，0.65％(w/v)蛋白胨，0.05％(w/v)酵母提取物，0.1％(w/v)MgSO4，0.2％(w/v)NaCl，0.24％(w/v)CaCO3，调节pH至7.2)。发酵条件为温度30℃、转速220rpm，发酵周期为7-11d。使用乙腈提取法进行产物萃取。即取1mL发酵液，离心(8000rpm，10min)收集菌体，弃去菌液，加入1mL乙腈，vortex5min，超声10min(常温)，12000rpm离心10min后吸取上清液，过滤后用于后续的分析检测。
申请人前期发表的文献(TAN G Y,DENG K,LIU X,et al.2017.HeterologousBiosynthesis of Spinosad:An Omics-Guided Large Polyketide Synthase GeneCluster Reconstitution in Streptomyces[J].ACS Synth Biol,6(6):995-1005.)中将多杀菌素在模式链霉菌Streptomyces albus J1074中实现异源表达，并将整个基因簇中表达较低的聚酮合酶spnE、鼠李糖合成相关基因(gtt，epi，gdh，kre，spnI)和福乐糖胺合成相关基因(spnO，spnN，spinQ，spnR，spnS)用强启动子进行过表达，得到异源表达多杀菌素的链霉菌OE3。在链霉菌OE3基础上，进一步替换spnA、spnD的启动子，得到菌株AD。具体构建过程如下：
(1)替换spnA的启动子
首先，构建pJTU1278-spnA质粒。该质粒构建的目的是以强启动子rpsLp-Cf替换原spnA的启动子。使用引物对RPSLP-CF-F和RPSLP-CF-R以pLH8质粒(LIU Q,XIAO L,ZHOU Y,et al.2016.Development of Streptomyces sp.FR-008as an emerging chassis[J].Synth Syst Biotechnol,1(3):207-214)为模板扩增启动子rpsLp-cf，使用引物对spnA-UR和spnA-XbaI-UF以OE3的基因组DNA为模板扩增上游同源臂2138bp，使用引物对spnA-DF和spnA-hindIII-DR以OE3的基因组DNA为模板扩增下游同源臂2154bp。将扩增得到的三片段使用OE-PCR连接三片段，然后使用HindIII和XbaI酶切酶连到pJTU1278载体，得到质粒pJTU1278-spnA(见图1)。
质粒构建完后经过酶切验证，并最终通过测序验证得到正确的质粒。其中，pJTU1278质粒是个广泛应用的穿梭载体，可以在大肠杆菌和链霉菌内复制，并含有接合转移元件可以进行接合转移，另外还有硫链丝菌素抗性筛选标记可以用来筛选。
通过三亲本接合转移方法(TAN G Y,DENG K,LIU X,et al.2017.HeterologousBiosynthesis of Spinosad:An Omics-Guided Large Polyketide Synthase GeneCluster Reconstitution in Streptomyces[J].ACS Synth Biol,6(6):995-1005.)将目的质粒pJTU1278-spnA转入链霉菌OE3中。先挑取接合子往下筛选单交换，再经过松弛三轮后筛选双交换。设计引物进行PCR验证。PCR验证引物设计为同源臂的基因上设计的验证引物。使用Primer Primer5设计，引物设计为：上下游引物设计在左右同源臂的基因上，包含插入的启动子rpsLp-cf或原始启动子。利用设计引物spnA_CPF和spnA_CPR，进行PCR验证。双交换示意图如图2。改造后的菌株，可以PCR扩增得到目的片段1284bp，改造前的菌株扩增得到的片段为954bp。通过PCR可以说明菌株发生了双交换(如图3中的160、168)，即得到了所要的目的菌株A。
(2)替换spnD的启动子
该质粒构建的目的是以强启动子rpsLp-TP替换原spnD的启动子。通过设计引物spnD-UHA-F和spnD-UHA-R以OE3的基因组DNA为模板扩增上游同源臂1873bp，spnD-DHA-F和spnD-DHA-KpnI-R以OE3的基因组DNA为模板扩增下游同源臂2146bp，spnD-RPSTP-D和spnD-RPSTP-F以pLH11质粒(LIU Q,XIAO L,ZHOU Y,et al.2016.Development of Streptomycessp.FR-008as an emerging chassis[J].Synth Syst Biotechnol,1(3):207-214)为模板扩增启动子rpsLp-TP。使用OE-PCR连接三片段，然后使用KpnI和XbaI酶切酶连到pJTU1278载体，得到质粒pJTU1278-spnD(见图4)。质粒进行酶切验证，并最终经过测序验证得到正确的质粒。
将质粒pJTU1278-spnD通过结合转移转化到A菌株中，按照(1)中的方法进行筛选，先挑取接合子往下筛选单交换，再经过松弛三轮后筛选双交换。使用引物进行PCR验证，使用Primer Primer 5设计，引物设计为：上下游引物设计在左右同源臂的基因上，包含插入的启动子rpsLp-TP或原始启动子。设计引物D-F和D-R进行PCR验证。双交换示意图见图5，改造后的菌株，可以PCR扩增得到1118bp的目的片段，改造前的菌株扩增得到的片段为727bp。通过PCR可以说明菌株发生了双交换(如图6中的7、9、13)，即得到目的菌株AD。
上述所使用引物信息见表1。
表1
使用上述发酵培养基和方法对菌株AD进行发酵，以探究该发酵培养基中残糖与多杀菌素产量的关系，在发酵过程中由第三天开始测发酵液的多杀菌素产量和残糖含量，结果如图7所示。从结果可以看出，多杀菌素的产量与培养基中剩余的葡萄糖含量有关，当培养基残糖量为0时(第8天)，产量达最大，后续不再增长。
实施例2发酵培养基成分含量对多杀菌素产量的影响
通过实施例1可以看出残糖的含量跟多杀菌素的产量密切相关，因此将发酵培养基含量增加，排查是否因培养基营养不足导致产量无增长。按照实施例1中方法对菌株AD进行发酵，但将发酵培养基设置如下：
(1)control：对照组，按照实施例1中的方法进行发酵；
(2)day4+20％：发酵至第四天补加20％的发酵培养基，即补加8mL发酵培养基；
(3)day4+50％：发酵至第四天补加50％的发酵培养基，即补加20mL发酵培养基；
(4)120％：发酵培养基的含量增加20％，即将发酵培养基中各组分的浓度提升到120％；
(5)150％：发酵培养基的含量增加50％，即将发酵培养基中各组分的浓度提升到150％。
结果见图8，比较几组数据，无明显差异，因此认为增加发酵培养基增加对多杀菌素产量无明显的改善。也就是以葡萄糖作为碳源的情况下，多杀菌素发酵产量无法进一步提升。
实施例3更换发酵培养基碳源对多杀菌素产量的影响
将实施例1中的发酵培养基中的葡萄糖更换为其他不同碳源(浓度均为40g/L)，按照实施例1中的方法对菌株AD进行发酵，结果见图9。从结果可以看出，产量从高到低的碳源依次是麦芽糖、甘露醇、葡萄糖、果糖、蔗糖，可看出麦芽糖作为碳源时，多杀菌素产量最高达到70.6mg/L，比葡萄糖作为碳源时的产量提升了1.8倍。
同时将实施例1中的发酵培养基中的葡萄糖更换为麦芽糖(浓度均为40g/L)，按照实施例1中的方法对菌株OE3进行发酵，结果显示，菌株OE3的多杀菌素产量提升了1.5倍。
这些结果充分说明在异源表达多杀菌素的白色链霉菌中，麦芽糖作为碳源可提升多杀菌素产量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 通过优化碳源提升异源多杀菌素表达菌株发酵产量的方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggctatgcga ttctgacggc gcggaagccg gtcggctgat atcggaacga tcgttggct 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagtccgatg acggctatca ggttcccggc ttcgctcatc atatggcgta tcccctttc 59
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcagaccaga gaagtatctg aaaggggata cgccatatga tgagcgaagc cgggaacct 59
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccccaagctt gtattcaacg ggaatccggc gcatc 35
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccagcgccc gcggcgggca gccaacgatc gttccgatat cagccgaccg gcttccgcg 59
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 22
<212> DNA
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<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcagccgaaa cgagtatctg aaaggggata cgccatatgg tggaaatcac aatggccaa 59
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgcggtacc cgacctgaaa ctcacccgta gcgac 35
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gccgaagagc ttttcttcat tggccattgt gatttccacc atatggcgta tcccctttc 59
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atattcgagt tcatcgacaa cgagctcgac ctgtcctgat atcggaacga tcgttggct 59
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctagtctaga tgctgcggat gacggattgg tcacg 35
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccgatcgcgg acccggttca gccaacgatc gttccgatat caggacaggt cgagctcgt 59
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tccacgagaa gtggaacagc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaccctcaaa accaaacgaa 20
Claims (6)
1.一种提升多杀菌素异源表达菌株多杀菌素发酵产量的方法，其特征在于：通过改变发酵培养基中的碳源提升多杀菌素异源表达菌株多杀菌素的发酵产量。
2.一种提升多杀菌素异源表达菌株多杀菌素发酵产量的方法，其特征在于：利用麦芽糖作为发酵培养基的碳源提升多杀菌素异源表达菌株多杀菌素的发酵产量。
3.一种提升多杀菌素异源表达菌株多杀菌素发酵产量的方法，其特征在于：使用下述配方的发酵培养基进行发酵培养：4％麦芽糖，1％甘油，3％可溶性淀粉，1.5％大豆蛋白胨，1％牛肉提取物，0.65％蛋白胨，0.05％酵母提取物，0.1％MgSO4，0.2％NaCl，0.24％CaCO3，pH 7.2。
4.根据权利要求1-3任一项所述的提升多杀菌素异源表达菌株多杀菌素发酵产量的方法，其特征在于：所述的多杀菌素异源表达菌株为异源表达多杀菌素的白色链霉菌。
5.根据权利要求1-3任一项所述的提升多杀菌素异源表达菌株多杀菌素发酵产量的方法，其特征在于：所述的多杀菌素异源表达菌株为将链霉菌OE3菌株spnA基因和spnD基因的启动子分别替换为强启动子rpsLp-Cf和rpsLp-TP得到的菌株AD。
6.一种高产多杀菌素的发酵培养基，其特征在于：所述的发酵培养基的配方为：4％麦芽糖，1％甘油，3％可溶性淀粉，1.5％大豆蛋白胨，1％牛肉提取物，0.65％蛋白胨，0.05％酵母提取物，0.1％MgSO4，0.2％NaCl，0.24％CaCO3，pH 7.2。
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