CN103725733A - 一种多杀菌素的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多杀菌素的发酵方法，包括如下步骤：（1）将能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104经斜面培养、种子培养，得到种子液；（2）将种子液接种到发酵培养基中，发酵；在发酵0-12h时添加硬脂酸，在40-56h时添加异丁醇，在90-105h时添加甘氨酸，丙氨酸和缬氨酸，共发酵192-216h。本发明的方法可使多杀菌素产量最高达到531.7mg/L。另外，这种培养方法所添加的物质成分单一，针对性更强，对于研究多杀菌素发酵过程的调控过程具有一定的指导意义。

Description

一种多杀菌素的发酵方法
技术领域
本发明涉及一种多杀菌素的发酵方法，属于微生物发酵领域。
背景技术
多杀菌素是由刺糖多孢菌生产的一种大环内酯类农用抗生素，兼具出色的杀虫效果和环保特性。作为一种广谱的生物农药，多杀菌素对昆虫的毒害有高度的选择性，其对非靶标生物基本无毒或低毒，对哺乳动物无致癌、致畸、致突变或神经毒性。目前，制约多杀菌素实现产业化和广泛推广应用的主要问题在于生产成本高，发酵工艺复杂，发酵效能低。培养基优化和菌株改造是目前国内多杀菌素研究的重点，李能威等通过单因素、多因素试验和2次正交试验获得最优发酵培养基，使多杀菌素产量达395.4mg/L，较对照提高62.5%。梁艳等通过紫外线诱变筛选得到一株具有鼠李糖和丙酸钠抗性的突变株，添加前体正丙醇后产量达到125.3mg/L，比初始菌株提高了285.5%；但继续提高产量效果都不明显。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多杀菌素的发酵方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种多杀菌素的发酵方法，包括如下步骤：
（1）将能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104经斜面培养、种子培养，得到种子液；
（2）将种子液以接种量10%‐15%的比例接种到发酵培养基中，于30℃、200‐250rpm发酵；在发酵0‐12h时添加硬脂酸，使浓度为1.0‐2g/L，在40‐56h时添加异丁醇，使浓度为1.8‐2.5g/L，在90‐105h时添加甘氨酸使浓度为0.3‐1g/L，添加丙氨酸使浓度为0.2‐0.8g/L和添加缬氨酸使浓度为0.1‐0.5g/L，共发酵192‐216h。
发酵培养基组份按g/L计：葡萄糖50-70、麦芽糖10-20、棉籽蛋白20-30、豆粉10-15、酵母膏10-25，K2HPO40.5-2，NaCl0.5-2，MgSO42-3，CaCO35-7，余量为水，pH=7.2-8.0。
步骤（2）优选为：将种子液以接种量10%的比例接种到发酵培养基中，于30℃、220rpm发酵；在发酵0h时添加硬脂酸，使浓度为1.0g/L，在48h时添加异丁醇，使浓度为2.2g/L，在96h时添加甘氨酸使浓度为0.5g/L，添加丙氨酸使浓度为0.5g/L和添加缬氨酸使浓度为0.25g/L，共发酵192h。
本发明的方法可使多杀菌素产量最高达到531.7mg/L。另外，这种培养方法所添加的物质成分单一，针对性更强，对于研究多杀菌素发酵过程的调控过程具有一定的指导意义。
附图说明
图1为重组质粒构建过程图。
图2是重组质粒pLU101的质粒图谱。
图3是重组质粒pLU102的质粒图谱。
图4是重组质粒pLU104的质粒图谱。
图5是多杀菌素野生菌株与多杀菌素基因工程菌发酵结果。
图6是重组质粒pLU101验证电泳图。
图7是重组质粒pLU102验证电泳图。
图8是重组质粒pLU104验证电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。但本发明的保护范围不能认为仅局限于下述具体实施方式，在不脱离本发明基本构思的前提下，所属领域的技术人员据此作出的简单推演或同等替换方案，均属于本发明的保护范围。
各实施例的斜面培养基组分按g/L计为酪蛋白胨2.5，葡萄糖5，牛肉膏3，琼脂20，硫酸镁2，余量为水，pH=7.5,115℃高压蒸汽灭菌20min。
种子培养基（g/L）：葡萄糖10，N-Z-Amine A（酸水解酪蛋白）30，酵母膏1.0，牛肉膏1.0，MgSO42.0，余量为水，灭菌前pH=7.3。
实施例1
1.基因元件克隆和含有对应基因原件的质粒构建
将包含ermE*启动子（SEQ ID NO.23）的pIB139质粒用HindIII和XbaI酶切消化，所用酶为Fermentas Fast Taq限制性内切酶，酶切体系如下：目的DNA片段30ng，加入2μL10×buffer，限制性内切酶HindIII和XbaI各1μL(内切酶最后加入)，补充蒸馏水至20μL。将酶切体系置于37℃30min，得到0.3kb的包含ermE*启动子的HindIII/XbaI片段。将该HindIII/XbaI片段插入质粒pOJ260，得到pOJ261质粒。
用引物对spnK-F-Ndel（SEQ ID NO.1）和spnK-R-Xbal（SEQ ID NO.2）从刺糖多胞菌（Saccharopolyspora spinosa）ATCC49460（以下简称刺糖多胞菌ATCC49460）染色体中获取spnK基因序列并扩增，再用Ndel和Xbal酶切消化spnK的PCR产物。随后将处理过的片段插入到同样被Ndel和Xbal酶切消化的pOJ261质粒中，得到重组pLU101质粒，质粒验证见图6。
本发明所用pcr酶为北京全式金生物技术有限公司的pfu聚合酶，PCR扩增体系如下：依照下述在冰上配制PCR反应体系，先加水，最后加pfu聚合酶；
Figure BDA0000450992380000021
在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环);98℃变性10秒、退火10秒、72℃延伸1分钟(32个循环);72℃延伸8分钟(1个循环)。
本发明中涉及到的寡核苷酸引物列于表1。
表1 引物序列
引物 序列 序列5′→3′
spnK-F-Ndel SEQ ID NO.1 CCGCCTTCCATATGTCCACAACGCAC
spnK-R-Xbal SEQ ID NO.2 CGTCTAGAGCGGAAATGCCTGTGTG
SN-F-XbaI SEQ ID NO.3 TATCTAGACGCTTCGTCGACCTGGTTGGCAC
SN-R-Xbal SEQ ID NO.4 TATCTAGACCCCACGCTCGTCTACCACAG
gtt-F-Ndel SEQ ID NO.5 CGGTATCCATATGAAGGGGATCGT
gtt-R-Xbal SEQ ID NO.6 CTTCTAGACGGTCCGCGATTTCAATG
gdh-kre-F-Ndel SEQ ID NO.7 CTGAGGGCCATATGCGGATTCTGGT
gdh-kre-R-Xbal SEQ ID NO.8 GTTCTAGACCCAGACGCGGAAAAG
gdh-gtt-F-MauBl SEQ ID NO.9 CTAATAACGCGCGCGGCGATTAAGTTGGGTAACG
gdh-gtt-R-MauBl SEQ ID NO.10 AATATATCGCGCGCGCAATGGAAATCGGAC
Con-F SEQ ID NO.11 CCGTGATTTTGTAGCCCTGG
Con-R SEQ ID NO.12 GGCCTACTTCACCTATCCTGC
gtt-F-Xbal SEQ ID NO.24 ATTCTAGAGGTACCAGCCCGACCCGAGCA
gtt-R-MauBl SEQ ID NO.25 AATATATCGCGCGCGCAATGGAAATCGGAC
6个与福乐糖胺合成相关的基因：
用引物对SN-F-XbaI（SEQ ID NO.3）和SN-R-XbaI（SEQ ID NO.4）从刺糖多胞菌ATCC49460染色体中获取并扩增出：spnN，spnO，spnP，spnQ，spnR和spnS基因序列，PCR产物用XbaI酶切消化。随后将spnP，spnO，spnN，spnQ，spnR和spnS序列的酶切产物插入同样被XbaI酶切消化的质粒pLU101，得到重组质粒pLU102，质粒验证见图7。
以同样的方法，gtt和gdh-kre基因分别用引物对gtt-F-Ndel（SEQ ID NO.5），gtt-R-Xbal（SEQ ID NO.6）和gdh-kre-F-Ndel（SEQ ID NO.7），gdh-kre-R-Xbal（SEQ ID NO.8）从刺糖多胞菌ATCC49460染色体中获取并扩增，gtt基因的PCR产物用Ndel和Xbal酶切消化，将处理过的PCR片段插入到同样被Ndel和Xbal酶切消化的pOJ261质粒中，得到pOJ263质粒。
同样，gdh-kre的PCR产物酶切消化后插入pOJ261质粒中，得到pOJ262质粒。然后，用引物对gtt-F-Xbal（SEQ ID NO.24）和gtt-R-MauBl（SEQ ID NO.25），将ermE*启动子调控的gtt序列从pLU263质粒中扩增，并以Xbal和MauBl酶切消化，插入pOJ262得到质粒pLU103。
最后，pLU103质粒中的ermE*启动子调控的gtt和gdh-kre序列用引物对gdh-gtt-F-MauBI（SEQ ID NO.9）和gdh-gtt-R-ManBl（SEQ ID NO.10）扩增，PCR产物用MauBl酶切消化，插入到pLU102质粒中得到质粒pLU104，质粒验证见图8。
质粒pLU101、质粒pLU102和质粒pLU104的构建过程及质粒见图1，2，3，4。
2.能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU101、LU102和LU104的构建：
所有构建的质粒均通过结合转移从大肠杆菌S17-1导入刺糖多胞菌，并同源重组整合到染色体中,步骤如下：
用质粒pLU101转化感受态大肠杆菌S17-1，将得到的大肠杆菌在安普霉素抗性(安普霉素100μg/ml)的LB平板上进行筛选。挑转化子至4ml LB(安普霉素100μg/ml)中37℃振荡培养12小时。
从斜面挑取适量刺糖多孢菌ATCC49460于30℃下培养在TSB液体培养基中72h左右，1%接种量转接于50mlTSB培养42h左右使菌液达到对数生长后期，离心倒去上清，菌体用LB液体洗涤2次（4000rpm，10min,4℃)，最后重悬于20ml LB，待用。
将已转化的大肠杆菌S17-1菌株2%接种于50ml LB的250ml三角瓶，37℃振荡培养2小时左右，使菌液OD值在0.4-0.6之间，将菌液移入离心管，离心（4000rpm，10min,4℃)，倒去上清，菌体洗涤2次（4000rpm，10min，4℃)，最后重悬于2ml LB中，供体-受体(E.coli-S.spinosa)按50μL(109/ml)：50μL(108孢子/ml)混合加入无菌的离心管。将混合菌液涂R6平板，用涂棒充分混匀菌液，29℃恒温箱培养32h，取出平板，涂50μl/mL安普霉素，并加入25ug/mL的萘啶酮酸，抑制结合转移的过程中大肠杆菌的生长，再于30℃恒温箱培养，培养约一周后出现重组接合子，用引物对Con-F（SEQ ID NO.11）和Con-R（SEQ ID NO.12）通过PCR扩增验证正确的为能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU101。
R6平板培养基成分（g/L)：蔗糖200.0，糊精10.0，酪蛋白氨基酸1.0，MgSO4·7H2O0.05，谷氨酸钠盐11.0,K2S040.1，CaCl2·2H2O7.0，3-(N-吗啉代)丙磺酸钠盐（MOPS）(0.1mol/L,Ph=7.2)100.0，微量元素（ml)1.0ml，琼脂20.0，余量是水。
微量元素组成（mg/L):ZnCl240,FeCl3·6H2O200，CuCl2·2H2O10，MnCl2·4H2O10，Na2B4O4·10H2O10，（NH4)6Mo7O24·4H2O10，余量是水。
用质粒pLU102替代质粒pLU101，其它操作同本实施例，得到能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU102。
用质粒pLU104替代质粒pLU101，其它操作同本实施例，得到能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104。
所述spnK表达盒由ermE*启动子、spnK编码基因和spnK终止子组成；
所述spnN表达盒由spnN启动子、spnN编码基因和spnN终止子组成；
所述spnO表达盒由spnO启动子、spnO编码基因和spnO终止子组成；
所述spnP表达盒由spnP启动子、spnP编码基因和spnP终止子组成；
所述spnQ表达盒由spnQ启动子、spnQ编码基因和spnQ终止子组成；
所述spnR表达盒由spnR启动子、spnR编码基因和spnR终止子组成；
所述spnS表达盒由spnS启动子、spnS编码基因和spnS终止子组成；
所述gtt表达盒由ermE*启动子、gtt编码基因和gtt终止子组成；
所述gdh表达盒由ermE*启动子、gdh编码基因和gdh终止子组成；
所述kre表达盒由ermE*启动子、kre编码基因和kre终止子组成。
所述ermE*启动子的序列是SEQ ID NO.23所示；
所述spnK编码基因的序列是SEQ ID NO.13所示；
所述spnN编码基因的序列是SEQ ID NO.14所示；
所述spnO编码基因的序列是SEQ ID NO.15所示；
所述spnP编码基因的序列是SEQ ID NO.16所示；
所述spnQ编码基因的序列是SEQ ID NO.17所示；
所述spnR编码基因的序列是SEQ ID NO.18所示；
所述spnS编码基因的序列是SEQ ID NO.19所示；
所述gtt编码基因的序列是SEQ ID NO.20所示；
所述gdh编码基因的序列是SEQ ID NO.21所示；
所述kre编码基因的序列是SEQ ID NO.22所示。
3.能提高多杀菌素产量的基因工程菌的发酵验证
菌株培养基：
斜面培养基（g/L）：酪蛋白胨2.5，葡萄糖5，牛肉膏3，琼脂20，硫酸镁2，余量为水，灭菌前pH=7.5。
种子培养基（g/L）：葡萄糖10，N-Z-Amine A（酸水解酪蛋白）30，酵母膏1.0，牛肉膏1.0，MgSO42.0，余量为水，灭菌前pH=7.3。
发酵培养基（g/L）：葡萄糖68，牛奶蛋白胨25，棉籽蛋白22，玉米浆14.5，油酸甲酯40，碳酸钙5，余量为水，灭菌前pH=7.5。
摇瓶发酵培养：将培养好能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU101、LU102、LU104及野生菌刺糖多胞菌ATCC49460的新鲜平板，用适量无菌生理盐水将成熟的孢子洗下，分别转移至装有5颗玻璃珠的四个三角瓶中震荡20min使孢子分散。用纱布无菌过滤后，吸取适量单孢子悬液移至装有30mL/250mL种子培养基的三角瓶中，使其中的孢子浓度约为107-108个/mL，200r/min，30℃条件下摇瓶培养3d。
将种子培养液按照5%的接种量接入发酵摇瓶中，发酵摇瓶装液量为30mL/250mL的三角瓶，在30℃、220rpm摇床中培养9d。
发酵液样品的提取：刺糖多孢菌发酵的过程中合成的多杀菌素大部分存在于发酵液中，还有少量存在于菌丝体中，所以本实验中采取提取全发酵液的方法。
取1.0mL发酵液，加入3.0mL甲醇，4℃避光提取24h，超声处理20min，10000r/min离心10min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后进行HPLC检测。
多杀菌素的HPLC检测：
色谱条件如下：色谱仪:依利特P230Ⅱ系列高效液相色谱仪；色谱柱:Apollo C185μ250mm*4.6mm；流动相:甲醇：乙腈：水=40:55:5，其中含有0.05%的乙酸铵；流速:1.0mL/min；紫外检测波长：246nm；柱温:30℃。
利用多杀菌素的产品“菜喜”（25g/L悬浮剂）来制备标准品(2400mg/L)：用移液枪准确量取500μL的菜喜，置于100mL的容量瓶中，用甲醇多次洗刷枪头内壁并用甲醇定容，超声波处理20min，避光静置24h，高速离心后溶液用0.22μm的有机滤膜过滤，上清液放入棕色瓶中4℃保存待用。
能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU101，其多杀菌素产量达到87mg/L，且PSA产量达到97mg/L，PSA量与野生菌种(29mg/L)相比提高了3.3倍。
能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU102，其多杀菌素的产量达到214mg/L，比野生菌种（82mg/L）高2.6倍，如图5所示。
能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104，其多杀菌素产量可达到405mg/L，是原始菌株的5倍。
能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104简称刺糖多孢菌LU104。
实施例2
发酵培养基组份按g/L计：葡萄糖50、麦芽糖10、棉籽蛋白20、豆粉10、酵母膏10，K2HPO40.5，NaCl0.5，MgSO42，CaCO35，余量为水，pH=7.2。
实施例3
发酵培养基组份按g/L计：葡萄糖50、麦芽糖15、棉籽蛋白20、豆粉15、酵母膏25，K2HPO42，NaCl2，MgSO43，CaCO37，余量为水，pH=8。
实施例4
发酵培养基组份按g/L计：葡萄糖70、麦芽糖20、棉籽蛋白30、豆粉15、酵母膏25，K2HPO41，NaCl1，MgSO42，CaCO35，余量为水，pH=7.2。
实施例5
对照组
将刺糖多孢菌LU104于斜面培养基在30℃下培养5天，接种于种子培养基中，摇瓶体积为250mL，装液量为30mL，于30℃、220rpm培养60h，然后以接种量10%将种子液接种到实施例2制备的发酵培养基的摇瓶中，摇瓶体积为250mL，装液量为30mL，于30℃、220rpm发酵192h得到发酵液。样品经浸提处理后用HPLC法检测多杀菌素的产量，多杀菌素的产量达到305.2mg/L。
实施例6
一种多杀菌素的补料发酵方法，包括如下步骤：
（1）将刺糖多孢菌LU104于斜面培养基在30℃下培养5天，接种于种子培养基中，摇瓶体积为250mL，装液量为30mL，于30℃、220rpm培养52h，得到种子液；
（2）将种子液以接种量10%的比例接种到实施例2制备的发酵培养基中，于30℃、220rpm条件下发酵，在发酵0h时添加硬脂酸，使浓度为1.0g/L，在48h时添加异丁醇，使浓度为2.2g/L，在96h时添加甘氨酸使浓度为0.5g/L，添加丙氨酸使浓度为0.5g/L和添加缬氨酸使浓度为0.25g/L，共发酵192h，多杀菌素的产量达到531.7mg/L。
实施例7
一种多杀菌素的补料发酵方法，包括如下步骤：
（1）将刺糖多孢菌LU104于斜面培养基在30℃下培养5天，接种于种子培养基中，摇瓶体积为250mL，装液量为30mL，于30℃、220rpm培养52h，得到种子液；
（2）将种子液以接种量10%的比例接种到实施例3制备的发酵培养基中，于30℃、200rpm条件下发酵，在发酵0h时添加硬脂酸，使浓度为1.5g/L，在40h时添加异丁醇，使浓度为1.8g/L，在90h时添加甘氨酸使浓度为0.3g/L，添加丙氨酸使浓度为0.2g/L和添加缬氨酸使浓度为0.1g/L，共发酵192h，多杀菌素的产量达到491.6mg/L。
实施例8
一种多杀菌素的补料发酵方法，包括如下步骤：
（1）将刺糖多孢菌LU104于斜面培养基在30℃下培养5天，接种于种子培养基中，摇瓶体积为250mL，装液量为30mL，于30℃、220rpm培养52h，得到种子液；
（2）将种子液以接种量10%的比例接种到实施例4制备的发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下发酵，在发酵12h时添加硬脂酸，使浓度为2g/L，在56h时添加异丁醇，使浓度为2.5g/L，在105h时添加甘氨酸使浓度为0.5g/L，添加丙氨酸使浓度为0.5g/L和添加缬氨酸使浓度为0.5g/L，共发酵192h，多杀菌素的产量达到511.2mg/L。
实施例9
一种多杀菌素的补料发酵方法，包括如下步骤：
（1）将刺糖多孢菌LU104于斜面培养基在30℃下培养5天，接种于种子培养基中，摇瓶体积为250mL，装液量为30mL，于30℃、220rpm培养52h，得到种子液；
（2）将种子液以接种量15%的比例接种到实施例2制备的发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下发酵，在发酵0h时添加硬脂酸，使浓度为1.0g/L，在48h时添加异丁醇，使浓度为1.8g/L，在105h时添加甘氨酸使浓度为1g/L，添加丙氨酸使浓度为0.8g/L和添加缬氨酸使浓度为0.5g/L，共发酵216h，多杀菌素的产量达到519.4mg/L。
Figure IDA0000450992460000011
Figure IDA0000450992460000021
Figure IDA0000450992460000031
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Figure IDA0000450992460000051
Figure IDA0000450992460000081
Figure IDA0000450992460000091
Figure IDA0000450992460000101
Figure IDA0000450992460000111
Figure IDA0000450992460000121
Figure IDA0000450992460000131

Claims (3)

1.一种多杀菌素的发酵方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将能提高多杀菌素产量的基因工程菌LU104经斜面培养、种子培养，得到种子液；
（2）将种子液以接种量10%‐15%的比例接种到发酵培养基中，于30℃、200‐250rpm发酵；在发酵0‐12h时添加硬脂酸，使浓度为1.0‐2g/L，在40‐56h时添加异丁醇，使浓度为1.8‐2.5g/L，在90‐105h时添加甘氨酸使浓度为0.3‐1g/L，添加丙氨酸使浓度为0.2‐0.8g/L和添加缬氨酸使浓度为0.1‐0.5g/L，共发酵192‐216h。
2.根据权利要求1所述的一种多杀菌素的发酵方法，其特征是所述发酵培养基组份按g/L计：葡萄糖50-70、麦芽糖10-20、棉籽蛋白20-30、豆粉10-15、酵母膏10-25，K2HPO40.5-2，NaCl0.5-2，MgSO42-3，CaCO35-7，余量为水，pH=7.2-8.0。
3.根据权利要求1所述的一种多杀菌素的发酵方法，其特征是所述步骤（2）为：将种子液以接种量10%的比例接种到发酵培养基中，于30℃、220rpm发酵；在发酵0h时添加硬脂酸，使浓度为1.0g/L，在48h时添加异丁醇，使浓度为2.2g/L，在96h时添加甘氨酸使浓度为0.5g/L，添加丙氨酸使浓度为0.5g/L和添加缬氨酸使浓度为0.25g/L，共发酵192h。
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