CN114703202A - 淡紫紫孢菌Pth11基因及其功能验证方法 - Google Patents

淡紫紫孢菌Pth11基因及其功能验证方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114703202A
CN114703202A CN202210328437.2A CN202210328437A CN114703202A CN 114703202 A CN114703202 A CN 114703202A CN 202210328437 A CN202210328437 A CN 202210328437A CN 114703202 A CN114703202 A CN 114703202A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pth11
prg
gene
solution
spore
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210328437.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114703202B (zh
Inventor
姬红丽
谢家廉
杨芳
徐幸
于文娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection Sichuan Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Plant Protection Sichuan Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection Sichuan Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Plant Protection Sichuan Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202210328437.2A priority Critical patent/CN114703202B/zh
Publication of CN114703202A publication Critical patent/CN114703202A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114703202B publication Critical patent/CN114703202B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本申请提供了两个与稻瘟病跨膜蛋白编码基因pth11同源的淡紫紫孢菌基因Pth11‑rg1和Pth11‑rg2，利用基因敲除技术将上述Pth11基因进行功能屏蔽，获得了ΔPth11‑rg1、ΔPth11‑rg2基因工程菌株，并利用上述基因工程菌株对淡紫紫孢菌Pth11‑rg1、Pth11‑rg2基因的功能进行验证，从而能够较为高效地进行基因水平上的功能的初步鉴定。

Description

淡紫紫孢菌Pth11基因及其功能验证方法
技术领域
本申请涉及病虫害生物防治领域，尤其是涉及淡紫紫孢菌Pth11基因及其功能验证方法。
背景技术
植物寄生性线虫为害水稻、小麦、玉米、大豆、蔬菜、烟草、果树等多种作物以及林木，据估计每年在全世界大约造成800亿美元的损失(Jones et al 2013)。淡紫紫孢菌，原名淡紫拟青霉菌(Purpureocillium lilacinum，原名Paecilomyces lilacinus)是一种重要的线虫卵寄生菌，能寄生孢囊线虫、根结线虫和肾型线虫在内的多种植物病原线虫。该菌分布广泛，适应力强，是国内外线虫生物防治重要的利用和研究对象。
在国内外的市面上已有淡紫紫孢菌制剂商品，用于防治根结线虫、孢囊线虫，并有着良好的效果。然而，目前尚未对淡紫紫孢菌侵入线虫卵的过程进行深入研究，缺乏基因水平上的功能阐述。
发明内容
本申请的目的在于提供两淡紫紫孢菌Pth11基因——Pth11-rg1和Pth11-rg2，上述基因与稻瘟病跨膜蛋白编码基因pth11同源，与淡紫紫孢菌寄生线虫虫卵过程相关。进一步地，本申请还利用基因敲除技术将上述Pth11基因进行功能屏蔽，获得了ΔPth11-rg1、ΔPth11-rg2基因工程菌株，并利用上述基因工程菌株对淡紫紫孢菌Pth11-rg1、Pth11-rg2基因的功能进行验证，从而能够较为高效地进行基因水平上的功能的初步鉴定。
本申请的目的之一在于提供两淡紫紫孢菌Pth11基因——Pth11-rg1和Pth11-rg2，其cDNA序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
上述两基因由稻瘟菌跨膜蛋白编码基因pth11作为指导，利用淡紫紫孢菌转录组和基因组测序数据筛选而得，再通过基因组PCR扩增得到其基因组全长，并对其基因结构进行预测，其对应的核酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
将淡紫紫孢菌接种于PDA培养基培养15d后，用灭菌蒸馏水洗脱分生孢子，并用MM培养液调节孢子浓度到1×107cfu/mL，培养24h得孢子液。将孢子液与分离悬浮的南方根结线虫卵液混合，调节卵的浓度为每毫升2个；同时，以不加卵的孢子液为空白对照，每个处理重复三次。分别在混合后的4h、8h、16h和24h后收集菌丝提取RNA。利用qPCR实验测定Pth11-rg1和Pth11-rg2的相对表达量，结果如图1所示。由图1可知，8h时Pth11-rg1和Pth11-rg2的相对表达量均出现明显上升，至16h时达到高峰，分别是对照表达的6.56倍和5.52倍。由此可说明，Pth11-rg1和Pth11-rg2与淡紫紫孢菌寄生早期识别过程相关，其生物防治效果的发挥时期早于原始菌株。
本申请中，qPCR实验具体包括：①进行mRNA反转录合成第一链cDNA；②使用PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix在20μL反应体系中扩增目的基因。其中，扩增程序为：94℃20s；94℃10s，60℃20s，共45cycles。PCR反应后，退火温度以每个循环0.5℃逐渐升高温度至95℃，形成熔融曲线以检测特异性。目的基因引物为：
Pth11-rg1-F-Q：5’-GGCGGGAGTCATGTTTCTCA-3’；
Pth11-rg1-R-Q；5’-GTCGGGTTTGTCGTGTTAGC-3’；
Pth11-rg2-F-Q：5’-CTGCTCGGGTGTCTTCATCA-3’；
Pth11-rg2-R-Q：5’-GTTGATGCCCTGAATGTCGC-3’；
β-Tubulin作为内参基因(Yang et al 2011b)，引物为：
TubF：5’-AGACCATCTCTGGCGAGCAT-3’；
TubR：5’-GCATCAGTTGTCCGTTTAGGCA-3’。
本申请的目的之二在于提供两淡紫紫孢菌Pth11-rg基因工程菌株，包括敲除了部分Pth11-rg1或Pth11-rg2的基因工程菌株ΔPth11-rg1或转化子ΔPth11-rg2。
本申请的目的之三在于提供利用上述淡紫紫孢菌Pth11-rg基因工程菌株进行Pth11-rg1、Pth11-rg2基因功能验证的方法。
本申请的目的之四在于提供一种淡紫紫孢菌Pth11基因功能验证方法，主要包括以下步骤：
S1.制备淡紫紫孢菌原生质体；
S2.以基因Pth11-rg1或Pth11-rg2的cDNA序列为模板，分别扩增并制备Prg-L+NP与PT+Prg-R片段(同源片段制备如图2所示)；
S3.混合步骤S1制备的淡紫紫孢菌原生质体和步骤S2制备的Prg-L+NP与PT+Prg-R片段，采用PEG介导淡紫紫孢菌原生质体转化，并在含G418抗生素的T-TOP培养基中培养3-4d，获得ΔPth11-rg1、ΔPth11-rg2基因工程菌株；
S4.鉴定步骤S3所获得的ΔPth11-rg1、ΔPth11-rg2基因工程菌株对植物寄生性线虫或其虫卵的处理能力。
进一步地，步骤S1具体包括：
S11.收集淡紫紫孢菌分生孢子，并将孢子液浓度调整至1×105CFU/mL；
S12.以体积份数比1:1000将步骤S11所得孢子液接种于TG培养基中，28℃、150rpm摇培24-36h后，收集菌丝；
S13.用浓度为0.7M的NaCl溶液制备蜗牛酶浓度为1mg/mL、裂解酶浓度为10mg/mL的酶解液；
S14.向步骤S12所得菌丝中加入步骤S13制备的酶解液，30℃、150rpm裂解4-5h，过滤得滤液；
S15.4000rpm离心处理步骤S14所得滤液，弃上清后加入STC溶液重悬得沉淀，沉淀为淡紫紫孢菌原生质体；
其中，
步骤S15后，可采用STC溶液调整淡紫紫孢菌原生质体浓度为1×108个/mL，以体积份数比93：7向淡紫紫孢菌原生质体液相体系中加入DMSO混匀，以冷冻管定容100μL分装，-80℃保存。
进一步地，步骤S2具体包括：
S21.通过PCR分别扩增Prg-L、Prg-R、NP、PT片段，并使Prg-L的3’端与NP的5’端存在20bp重复序列、Prg-R的5’端与PT的3’端存在20bp重复序列；
S22.通过融合PCR分别将步骤S21中Prg-L与NP、Prg-R与PT进行融合，形成Prg-L+NP与PT+Prg-R片段。
其中，步骤S21中的PCR引物包括：
PT-F：5’-CTTTGCTACATCCATACTCCATCCT-3’)；
NP-R：5’-AGAAGGCACTCTTTGCTGCTTGGAC-3’)；
步骤S22中形成的Prg-L+NP与PT+Prg-R片段分别为：
Pth11-rg1L-NP-F：
5’-TCGGCATATTCACCGGCATCTCTGGCATGCGGAGAGACGGACG-3’；
PT-Pth11-rg1R-R：
5’-TGAGAAACATGACTCCCGCCCTGTGCATTCTGGGTAAACGACT-3’；
Pth11-rg2L-NP-F：
5’-CATAATCGCCTTTGCGGTCCCTCTGGCATGCGGAGAGACGGACG-3’；
PT-Pth11-rg2R-R：
5’-ACAGTAGCAAGTCGCAGAGCCTGTGCATTCTGGGTAAACGACT-3’。
进一步地，步骤S3具体包括：
S31.取一冷冻管室温下自然解冻后，与10μL步骤S2制备的Prg-L+NP与PT+Prg-R片段混合后，以TEC溶液混匀、定容至160μL；
S32.以体积份数比1:1向步骤S31定容溶液中滴加质量体积百分比浓度为60％的PEG3350，混匀后静置20min；
S33.以体积份数比1：3向步骤S32静置后的溶液中加入STC溶液，混匀后5000rpm离心，收集沉淀；
S34.以250μL的STC溶液对步骤S33所得沉淀进行重悬，以重悬液涂布PDAS平板，于28℃培养24h；
S35.制备含有浓度为1.2mg/mLG418抗生素的T-TOP培养液，将其覆盖于步骤S34培养平板上，28℃继续培养3-4d。
进一步地，步骤S4具体包括：
S41.接种培养步骤S3所获得的ΔPth11-rg1、ΔPth11-rg2基因工程菌株及原始菌株后，分别洗脱其分生孢子，并使用培养液培养分生孢子；
S42.离心步骤S41所得分生孢子液，收集上清液，浸泡植物寄生性线虫，处理48h后观察植物寄生性线虫的存活情况；
S43.制备植物寄生性线虫虫卵悬液，与步骤S41所得分生孢子液混合，共培养24h后观察植物寄生性线虫虫卵寄生情况。
本申请中，在进行步骤S4前，可采用PCR、qRT-PCR等技术对ΔPth11-rg1、ΔPth11-rg2基因工程菌株进行了基因表达情况鉴定，采用PDA平板、产孢试验等方法对基因工程菌株的菌丝菌落形态和产孢能力进行了鉴定。
具体地，包括：
(1)PCR鉴定：
采用DNAzol试剂分提取ΔPth11-rg1、ΔPth11-rg2基因工程菌株及原始菌株的DNA，通过引物分别扩增对敲除子及原始菌株扩增Pth11-rg1基因同源片段和Pth11-rg2基因同源片段，所用到的引物包括：
Pth11-rg1-F：5’-CTCGGCGCTCGTTTTTGTG-3’；
Pth11-rg1-R：5’-ATTCAACCCTTGTCGCTGGT-3’；
Pth11-rg2-F：5’-ACGTTACAGCCTCGCATCAA-3’；
Pth11-rg2-R：5’-CCAAGGCCTCATCTCCAAGT-3’。
(2)qRT-PCR鉴定：
采用TRzol试剂提取ΔPth11-rg1、ΔPth11-rg2的RNA，并通过mRNA反转录合成第一链cDNA，通过qPCR扩增Pth11-rg1和Pth11-rg2，使用2-ΔΔCt评估靶标基因表达量，并使用R版本3.3.0进行分析，以观察基因表达情况。所用到引物引物同本申请目的之一所提供的qPCR实验。
(3)PDA平板测定菌丝生长：
将ΔPth11-rg1、ΔPth11-rg2基因工程菌株和原始菌株均接种于在PDA培养基平板中心，28℃下培养，当对照原始菌株菌落长满培养皿时，用十字交叉法测量基因工程菌株和原始菌株的菌落直径，取其平均值。并照相观察菌丝菌落形态变化。
(4)产孢试验：
将ΔPth11-rg1、ΔPth11-rg2基因工程菌株和原始菌株分别接种于在PDA培养基培养15天，然后用10mL灭菌蒸馏水洗脱分生孢子，用MM培养液调节孢子浓度到1×107CFU/mL，将该浓度的分生孢子20μL加入200mL的MM培养基上28℃，140rpm下分别培养7d，然后12000rpm离心收集分生孢子，用2mL灭菌蒸馏水重悬，显微镜下通过血球板计算法计算分生孢子浓度。
附图说明
为了更清楚地说明本申请或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了采用qPCR实验时本申请两紫紫孢菌基因——Pth11-rg1、Pth11-rg2的表达动态变化情况。
图2示出了本申请同源片段的制备示意图。
图3示出了本申请实施例对基因工程菌株进行PCR鉴定的结果，其中，泳道1-2为ΔPth11-rg1阳性转化子，泳道3-4为ΔPth11-rg2阳性转化子，泳道5-6为原始菌株中Pth11-rg1的扩增片段，泳道7为原始菌株中Pth11-rg2的扩增片段。
图4示出了本申请实施例对基因工程菌株进行qRT-PCR鉴定的结果。
图5示出了本申请实施例中基因工程菌株与原始菌株菌丝的直径比较。
图6示出了本申请实施例中基因工程菌株与原始菌株孢子数量比较。
图7示出了本申请实施例中采用基因工程菌株与原始菌株上清液对水稻干尖线虫、南方根结线虫的杀伤效果分析。
具体实施方式
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本申请实施例的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
实施例1
本实施例在淡紫紫孢菌转录组和基因组测序数据中筛选得到一与稻瘟病跨膜蛋白编码基因同源的基因Pth11-rg1，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其核酸序列如SEQ IDNO.3所示。
采用以下步骤制备敲除部分Pth11-rg1的基因工程菌株ΔPth11-rg1并进行基因功能验证：
①常规培养淡紫紫孢菌后收集分生孢子，并将孢子液浓度调整至1×105CFU/mL。往100mL TG培养基中接种100μL上述孢子液，于28℃，150rpm摇培24-36h至出现细小菌丝球(此时的菌丝为幼嫩菌丝)。用4层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝，再用少量0.7M NaCl溶液冲洗菌丝体以除去多余培养基，将菌丝体转移至50mL灭菌的锥形瓶中。
②用浓度为0.7M的NaCl溶液制备蜗牛酶浓度为1mg/mL、裂解酶浓度为10mg/mL的酶解液。取10mL酶解液加入步骤①的锥形瓶中，30℃，150rpm裂解4-5h。镜检确认菌丝裂解程度后，过滤并用少量0.7M NaCl冲洗擦镜纸以收集残留的原生质体，滤液于4℃，4000rpm离心15min。弃上清，加入1mL STC溶液轻柔重悬沉淀，4℃，4000rpm离心15min，所得沉淀即为原生质体。用STC溶液将原生质体浓度调整为1×108个/毫升，按照体积百分比7％的比例加入DMSO，混匀后，分装成每管100μL，-80℃保存备用。
③通过PCR分别扩增Prg-L、Prg-R、NP、PT片段，并使Prg-L的3’端与NP的5’端存在20bp重复序列、Prg-R的5’端与PT的3’端存在20bp重复序列；通过融合PCR分别将步骤S21中所述Prg-L与所述NP、所述Prg-R与所述PT进行融合，形成Prg-L+NP与PT+Prg-R片段，
其中，上述引物及片段序列分别为：
PT-F：5’-CTTTGCTACATCCATACTCCATCCT-3’；
NP-R：5’-AGAAGGCACTCTTTGCTGCTTGGAC-3’；
Pth11-rg1L-NP-F：
5’-TCGGCATATTCACCGGCATCTCTGGCATGCGGAGAGACGGACG-3’；
PT-Pth11-rg1R-R：
5’-TGAGAAACATGACTCCCGCCCTGTGCATTCTGGGTAAACGACT-3’。
④取一步骤②制得的冷冻管，室温下自然解冻后，与10μL步骤③制备的Prg-L+NP与PT+Prg-R片段混合后，以TEC溶液混匀、定容至160μL，向其中滴加160μL、质量体积百分比浓度为60％的PEG3350，充分混匀后室温下静置20min。加入1mL STC溶液，轻微混匀，5000rpm离心10min，弃上清，沉淀用250μL STC轻柔重悬。每50μL涂布于一个PDAS平板(原生质体不可涂布至皿边缘，需距离皿边缘0.5cm)。吹干后于28℃培养24h，在每个平板上覆盖10mL含有1.2mg/mL G418抗生素的T-TOP培养基，28℃继续培养3-4天。同时，按照相同转化方法在原生质体中仅加入60μL TEC溶液作为对照组。
⑤采用DNAzol试剂提取基因工程菌株ΔPth11-rg1及原始菌株的DNA，通过引物分别扩增Pth11-rg1基因同源片段，鉴定结果如图3所示。
其中，引物分别为：
Prg1-F：5’-CTCGGCGCTCGTTTTTGTG-3’；
Prg1-R：5’-ATTCAACCCTTGTCGCTGGT-3’。
⑥采用TRzol试剂提取基因工程菌株ΔPth11-rg1的RNA，并通过mRNA反转录合成第一链cDNA。通过qPCR扩增Pth11-rg1观察基因表达情况，以使用β-Tubulin作为内参基因，使用2-ΔΔCt评估靶标基因表达量，并使用R版本3.3.0进行分析，鉴定结果如图4所示。
其中，引物分别为：
Prg1-F-Q：5’-GGCGGGAGTCATGTTTCTCA-3’；
Prg1-R-Q：5’-GTCGGGTTTGTCGTGTTAGC-3’；
TubF：5’-AGACCATCTCTGGCGAGCAT-3’；
TubR：5’-GCATCAGTTGTCCGTTTAGGCA-3’。
⑦将基因工程菌株ΔPth11-rg1和原始菌株接种于在PDA培养基平板中心点，28℃下培养，当对照原始菌株菌落长满培养皿时，用十字交叉法测量敲除菌株和原始菌株的菌落直径，取其平均值。并照相观察菌丝菌落形态变化，观察统计结果如图5所示。由图可知，基因工程菌株ΔPth11-rg1与原始菌株相比，在菌丝生长速度显著低于原始菌株，因此，可说明Pth11-rg1基因与淡紫紫孢菌菌丝生长中起作用。
⑧将基因工程菌株ΔPth11-rg1和原始菌株接种于在PDA培养基培养15d，然后用10mL灭菌蒸馏水洗脱分生孢子，用MM培养液调节孢子浓度到1×107CFU/mL。将该浓度的分生孢子20μL加入200mL MM培养基上28℃，140rpm下分别培养7d，12000rpm离心收集分生孢子，用2mL灭菌蒸馏水重悬，显微镜下通过血球板计算法计算分生孢子浓度，计算结果如图6所示。由图可知，基因工程菌株ΔPth11-rg1与原始菌株相比，在产孢速度上均显著低于原始菌株，因此，可说明Pth11-rg1基因与淡紫紫孢菌产孢过程中起作用。
⑨将基因工程菌株ΔPth11-rg1和原始菌株接种于在PDA培养基培养15d，然后用10mL灭菌蒸馏水洗脱分生孢子，用MM培养液调节孢子浓度到1×107CFU/mL，将该浓度的分生孢子20μL加入200mLMM培养基上28℃，140rpm下培养7天，然后12000rpm离心，收集上清液。于24孔板中分别加入100条南方根结线虫或水稻干尖线虫，将上清液原液和稀释2倍、4倍液取1mL加入对应的24孔板中，每个处理5次重复，处理48h后观察记录线虫的存活情况，以清水作为对照，实验平行重复三次，实验结果如图7所示。由图可知，基因工程菌株ΔPth11-rg1与原始菌株相比，对水稻干尖线虫的致死效果明显下降，对南方根结线虫致死效果上升。
⑩将基因工程菌株ΔPth11-rg1和原始菌株接种于在PDA培养基培养15d，然后用10mL灭菌蒸馏水洗脱分生孢子用MM培养液调节孢子浓度到1×107CFU/mL，将分生孢子预培养24h。将预培养好的孢子液与分离悬浮的南方根结线虫或水稻干尖线虫卵液混合，调节卵的浓度为每毫升2个，以不加卵的孢子液为空白对照。分生孢子与线虫卵共培养24h后，轻柔混匀后，取10mL线虫卵液作为1个重复，置于凹面载玻片中，于显微镜下观察线虫卵寄生情况，记录总卵量和寄生卵量。每个处理5次重复，实验平行重复三次。结果中发现，基因工程菌株ΔPth11-rg1与原始菌株相比，对南方根结线虫或者对水稻干尖线虫卵寄生卵块寄生率明显下降。
实施例2
本实施例在淡紫紫孢菌转录组和基因组测序数据中筛选得到一与稻瘟病跨膜蛋白编码基因同源的基因Pth11-rg2，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，其核酸序列如SEQ IDNO.4所示。
采用以下步骤制备敲除部分Pth11-rg2的基因工程菌株ΔPth11-rg2并进行基因功能验证：
③常规培养淡紫紫孢菌后收集分生孢子，并将孢子液浓度调整至1×105CFU/mL。往100mL TG培养基中接种100μL上述孢子液，于28℃，150rpm摇培24-36h至出现细小菌丝球(此时的菌丝为幼嫩菌丝)。用4层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝，再用少量0.7M NaCl溶液冲洗菌丝体以除去多余培养基，将菌丝体转移至50mL灭菌的锥形瓶中。
④用浓度为0.7M的NaCl溶液制备蜗牛酶浓度为1mg/mL、裂解酶浓度为10mg/mL的酶解液。取10mL酶解液加入步骤①的锥形瓶中，30℃，150rpm裂解4-5h。镜检确认菌丝裂解程度后，过滤并用少量0.7M NaCl冲洗擦镜纸以收集残留的原生质体，滤液于4℃，4000rpm离心15min。弃上清，加入1mL STC溶液轻柔重悬沉淀，4℃，4000rpm离心15min，所得沉淀即为原生质体。用STC溶液将原生质体浓度调整为1×108个/毫升，按照体积百分比7％的比例加入DMSO，混匀后，分装成每管100μL，-80℃保存备用。
③通过PCR分别扩增Prg-L、Prg-R、NP、PT片段，并使Prg-L的3’端与NP的5’端存在20bp重复序列、Prg-R的5’端与PT的3’端存在20bp重复序列；通过融合PCR分别将步骤S21中所述Prg-L与所述NP、所述Prg-R与所述PT进行融合，形成Prg-L+NP与PT+Prg-R片段，
其中，上述引物及片段序列分别为：
PT-F：5’-CTTTGCTACATCCATACTCCATCCT-3’；
NP-R：5’-AGAAGGCACTCTTTGCTGCTTGGAC-3’；
Pth11-rg2L-NP-F：
5’-CATAATCGCCTTTGCGGTCCCTCTGGCATGCGGAGAGACGGACG-3’；
PT-Pth11-rg2R-R：
5’-ACAGTAGCAAGTCGCAGAGCCTGTGCATTCTGGGTAAACGACT-3’。
④取一步骤②制得的冷冻管，室温下自然解冻后，与10μL步骤③制备的Prg-L+NP与PT+Prg-R片段混合后，以TEC溶液混匀、定容至160μL，向其中滴加160μL、质量体积百分比浓度为60％的PEG3350，充分混匀后室温下静置20min。加入1mL STC溶液，轻微混匀，5000rpm离心10min，弃上清，沉淀用250μL STC轻柔重悬。每50μL涂布于一个PDAS平板(原生质体不可涂布至皿边缘，需距离皿边缘0.5cm)。吹干后于28℃培养24h，在每个平板上覆盖10mL含有1.2mg/mL G418抗生素的T-TOP培养基，28℃继续培养3-4天。同时，按照相同转化方法在原生质体中仅加入60μL TEC溶液作为对照组。
⑤采用DNAzol试剂提取基因工程菌株ΔPth11-rg2及原始菌株的DNA，通过引物分别扩增Pth11-rg2基因同源片段，鉴定结果如图3所示。
其中，引物分别为：
Prg2-F：5’-ACGTTACAGCCTCGCATCAA-3’；
Prg2-R：5’-CCAAGGCCTCATCTCCAAGT-3’。
⑥采用TRzol试剂提取基因工程菌株ΔPth11-rg2的RNA，并通过mRNA反转录合成第一链cDNA。通过qPCR扩增Pth11-rg2观察基因表达情况，以使用β-Tubulin作为内参基因，使用2-ΔΔCt评估靶标基因表达量，并使用R版本3.3.0进行分析，鉴定结果如图4所示。
其中，引物分别为：
Prg2-F-Q：5’-CTGCTCGGGTGTCTTCATCA-3’；
Prg2-R-Q：5’-GTTGATGCCCTGAATGTCGC-3’；
TubF：5’-AGACCATCTCTGGCGAGCAT-3’；
TubR：5’-GCATCAGTTGTCCGTTTAGGCA-3’。
⑦将基因工程菌株ΔPth11-rg2和原始菌株接种于在PDA培养基平板中心点，28℃下培养，当对照原始菌株菌落长满培养皿时，用十字交叉法测量敲除菌株和原始菌株的菌落直径，取其平均值。并照相观察菌丝菌落形态变化，观察统计结果如图5所示。由图可知，基因工程菌株ΔPth11-rg2与原始菌株相比，在菌丝生长速度显著低于原始菌株，因此，可说明Pth11-rg2基因与淡紫紫孢菌菌丝生长中起作用；同时，基因工程菌株ΔPth11-rg2在PDA平板生长过程中没有产生紫色色素，由此，Pth11-rg2基因还可能与色素产生过程相关。
⑧将基因工程菌株ΔPth11-rg2和原始菌株接种于在PDA培养基培养15d，然后用10mL灭菌蒸馏水洗脱分生孢子，用MM培养液调节孢子浓度到1×107CFU/mL。将该浓度的分生孢子20μL加入200mL MM培养基上28℃，140rpm下分别培养7d，12000rpm离心收集分生孢子，用2mL灭菌蒸馏水重悬，显微镜下通过血球板计算法计算分生孢子浓度，计算结果如图6所示。由图可知，基因工程菌株ΔPth11-rg2与原始菌株相比，在产孢速度上均显著低于原始菌株，因此，可说明Pth11-rg2基因与淡紫紫孢菌产孢过程中起作用。
⑨将基因工程菌株ΔPth11-rg2和原始菌株接种于在PDA培养基培养15d，然后用10mL灭菌蒸馏水洗脱分生孢子，用MM培养液调节孢子浓度到1×107CFU/mL，将该浓度的分生孢子20μL加入200mLMM培养基上28℃，140rpm下培养7天，然后12000rpm离心，收集上清液。于24孔板中分别加入100条南方根结线虫或水稻干尖线虫，将上清液原液和稀释2倍、4倍液取1mL加入对应的24孔板中，每个处理5次重复，处理48h后观察记录线虫的存活情况，以清水作为对照，实验平行重复三次，实验结果如图7所示。由图可知，基因工程菌株ΔPth11-rg2与原始菌株相比，对水稻干尖线虫的致死效果明显下降，对南方根结线虫致死效果无明显变化。
⑩将基因工程菌株ΔPth11-rg2和原始菌株接种于在PDA培养基培养15d，然后用10mL灭菌蒸馏水洗脱分生孢子用MM培养液调节孢子浓度到1×107CFU/mL，将分生孢子预培养24h。将预培养好的孢子液与分离悬浮的南方根结线虫或水稻干尖线虫卵液混合，调节卵的浓度为每毫升2个，以不加卵的孢子液为空白对照。分生孢子与线虫卵共培养24h后，轻柔混匀后，取10mL线虫卵液作为1个重复，置于凹面载玻片中，于显微镜下观察线虫卵寄生情况，记录总卵量和寄生卵量。每个处理5次重复，实验平行重复三次。结果中发现，基因工程菌株ΔPth11-rg2与原始菌株相比，对南方根结线虫或者对水稻干尖线虫卵寄生卵块寄生率明显下降。
Figure BDA0003572298950000141
Figure BDA0003572298950000151
Figure BDA0003572298950000161
Figure BDA0003572298950000171
Figure BDA0003572298950000181
Figure BDA0003572298950000191
Figure BDA0003572298950000201
Figure BDA0003572298950000211
Figure BDA0003572298950000221
Figure BDA0003572298950000231
Figure BDA0003572298950000241
Figure BDA0003572298950000251
Figure BDA0003572298950000261
SEQUENCE LISTING
<110> 四川省农业科学院植物保护研究所
<120> 淡紫紫孢菌Pth11基因及其应用
<130> CDXS-202204
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1353
<212> DNA
<213> Purpureocillium lilacinum
<400> 1
atgctgacct cggcgctcgt ttttgtggcg gcgccggtgc tgtgcgttgc cggcagcagt 60
tcctcgacag aatcgtcaca tgtggcggca cgcgactcgg cggcgacgaa cattactaga 120
gatgttccag cgtgctcgct tgactgcctc tccgcggcgt gtggtctcgc cgatgaagcc 180
tgcgtatgcg acaggatctc gagcaagaag gtcatggact gttccatggc cgcttgtacc 240
tttgccgaag ctatatcgcc agcggcccgg agactgatcg aagtcgcctg tggcgcgtcg 300
acaacccgca cccgcgtcgg cacgttcaac tacatcaaca ccggcctcgg catattcacc 360
ggcatcatag ccgtcgcgcg gcttatcttc aagcgattca tcagctccgc ccgcaagttt 420
acccccgacg actgggtcat tctcgcgacg ctcgccctcg gtctggccag cgtgctgctc 480
ctctcactag ggctgacggc caacggcctg gggagagaca tctggaccct cgccccggaa 540
ggcatggtga cctttgggtt ctacttttac ctctgcgaga ttgtttacat tgctctcatg 600
gccatggtga agctagcgct gtctctcttt tacttggcca ttttcccggg tgccggtgtg 660
cgccggatac tatgggcgac ggccgtgttc caggtcgtct tcgggctggc gtttgtaatc 720
aaagacgcgg tccagtgcat ccagcccgac ttctactgga agaggttcag cctcgatgct 780
gatccgcggg ggcactgcat caacgtgcat gcctcgggct gggtcaatgc cgtgctgggc 840
gtcgccattg acgtctggct gctggccatt cctctctttc agttgcgcaa attgcaactg 900
gagtggaaga agaaggccgt ggcgggagtc atgtttctca ccggcgcgct ggtgacgctc 960
atctcgattc ttcgactcaa gtccctcaat acatttgcta acacgacaaa cccgacctgg 1020
gaccagtggg cgctggtgct ctggtccacg atcgagatca acacgggcat catctgcacc 1080
agccttcccg ccgtgcgcct catgctgctt cgcctgttcc cgcggatgct cgggactgtc 1140
gcctcgacga catcacggac acgaacgcgc gcagagtcgg cgtatggcga gggggcgagc 1200
agtagccacg aaatgaagcc tccgggctcg tctgcgggag gcagcgacca cacctcgacg 1260
ttgacgctgc tgccaccagc gacaagggtt gaatctcgca gtcctttatt tgaagatgtc 1320
aagtcggctg agacggactc aagacgaaca tag 1353
<210> 2
<211> 1245
<212> DNA
<213> Purpureocillium lilacinum
<400> 2
atggcgacgc cgtttcagac ggaggcctgg accgagtacg gcctgggcgt cgtgattctc 60
tttctgcgct tctttgcgcg ctggaagacg gtcgggttga aggggtgggg aggcgacgat 120
gcctttgcta ttctcgtgct tctgttttgg acggtaggct gcataacccc ctcgtctttc 180
ccgttggatg ctgacttgga taaccagctg gaactatgta tgctggaact catcggacaa 240
tatggcacca acatcggcat cacagacgat gtcggcgcca ccctgacaaa tgagcagatt 300
gcgcgcttcg agtttggctc caagtgcctc ctggccgggt ggaactttta cgtttccctg 360
atatgggcgc tcaaaggctg catgctctgc ttctacaacc gcatcacaga cacgggtatg 420
ctgacgcaga atctgatccg caggcttggc ttgacgcagc aaaagtttgt caagtggacg 480
ggcctggcgt gcttcttcgc ctacgcgggc gtcatgggcg ccatctgggg gcactgcacg 540
cccgtgcaca agaactggca ggtcgtgccg tatcctggcg ataagtgcac gctggctgtg 600
gccaactacc tgactctggt cgttctcaac gtgacgaccg atttcgtcat tctgagcatc 660
ccaattccgc tattgtggaa ggtgaaaatc acactggggc gcaagcttgc cattggcgtg 720
ctgctctgct cgggtgtctt catcattgtc gccactatcc tccgatgcgt tctgtccctg 780
cgcgacattc agggcatcaa cgtcagcacc atctgggcca tccgcgagac ctttgtcggc 840
atcatcgccg tcaacgccgc ggccatcaag cccctcttct ccaagagccg ctggatcgtc 900
tccagcaagg gcagcagcgg cgctaccccg ggatacaaca agaaccagaa ccagtactcg 960
ctggaccaga tgcccggcgg cgcgacctcg accatcggct ccatgtccaa gcggcgcttc 1020
aacaagcaga tgatggagct gggcgacaac tcgagcgagg agcacattgt cgactctaag 1080
gacaaccaca acgggcttgc gtacaacagg tggctgcgca acgaggtcag cgggggtggc 1140
gcgtcgtccg tgggcgggag gagcggcggc agcgcagagg cggacggcat caccgtcacc 1200
acgagggtcg aagtcacccc tgggacgccg cgacacatgg tgtga 1245
<210> 3
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Met Leu Thr Ser Ala Leu Val Phe Val Ala Ala Pro Val Leu Cys Val
1 5 10 15
Ala Gly Ser Ser Ser Ser Thr Glu Ser Ser His Val Ala Ala Arg Asp
20 25 30
Ser Ala Ala Thr Asn Ile Thr Arg Asp Val Pro Ala Cys Ser Leu Asp
35 40 45
Cys Leu Ser Ala Ala Cys Gly Leu Ala Asp Glu Ala Cys Val Cys Asp
50 55 60
Arg Ile Ser Ser Lys Lys Val Met Asp Cys Ser Met Ala Ala Cys Thr
65 70 75 80
Phe Ala Glu Ala Ile Ser Pro Ala Ala Arg Arg Leu Ile Glu Val Ala
85 90 95
Cys Gly Ala Ser Thr Thr Arg Thr Arg Val Gly Thr Phe Asn Tyr Ile
100 105 110
Asn Thr Gly Leu Gly Ile Phe Thr Gly Ile Ile Ala Val Ala Arg Leu
115 120 125
Ile Phe Lys Arg Phe Ile Ser Ser Ala Arg Lys Phe Thr Pro Asp Asp
130 135 140
Trp Val Ile Leu Ala Thr Leu Ala Leu Gly Leu Ala Ser Val Leu Leu
145 150 155 160
Leu Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Gly Leu Gly Arg Asp Ile Trp Thr
165 170 175
Leu Ala Pro Glu Gly Met Val Thr Phe Gly Phe Tyr Phe Tyr Leu Cys
180 185 190
Glu Ile Val Tyr Ile Ala Leu Met Ala Met Val Lys Leu Ala Leu Ser
195 200 205
Leu Phe Tyr Leu Ala Ile Phe Pro Gly Ala Gly Val Arg Arg Ile Leu
210 215 220
Trp Ala Thr Ala Val Phe Gln Val Val Phe Gly Leu Ala Phe Val Ile
225 230 235 240
Lys Asp Ala Val Gln Cys Ile Gln Pro Asp Phe Tyr Trp Lys Arg Phe
245 250 255
Ser Leu Asp Ala Asp Pro Arg Gly His Cys Ile Asn Val His Ala Ser
260 265 270
Gly Trp Val Asn Ala Val Leu Gly Val Ala Ile Asp Val Trp Leu Leu
275 280 285
Ala Ile Pro Leu Phe Gln Leu Arg Lys Leu Gln Leu Glu Trp Lys Lys
290 295 300
Lys Ala Val Ala Gly Val Met Phe Leu Thr Gly Ala Leu Val Thr Leu
305 310 315 320
Ile Ser Ile Leu Arg Leu Lys Ser Leu Asn Thr Phe Ala Asn Thr Thr
325 330 335
Asn Pro Thr Trp Asp Gln Trp Ala Leu Val Leu Trp Ser Thr Ile Glu
340 345 350
Ile Asn Thr Gly Ile Ile Cys Thr Ser Leu Pro Ala Val Arg Leu Met
355 360 365
Leu Leu Arg Leu Phe Pro Arg Met Leu Gly Thr Val Ala Ser Thr Thr
370 375 380
Ser Arg Thr Arg Thr Arg Ala Glu Ser Ala Tyr Gly Glu Gly Ala Ser
385 390 395 400
Ser Ser His Glu Met Lys Pro Pro Gly Ser Ser Ala Gly Gly Ser Asp
405 410 415
His Thr Ser Thr Leu Thr Leu Leu Pro Pro Ala Thr Arg Val Glu Ser
420 425 430
Arg Ser Pro Leu Phe Glu Asp Val Lys Ser Ala Glu Thr Asp Ser Arg
435 440 445
Arg Thr
450
<210> 4
<211> 414
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Met Ala Thr Pro Phe Gln Thr Glu Ala Trp Thr Glu Tyr Gly Leu Gly
1 5 10 15
Val Val Ile Leu Phe Leu Arg Phe Phe Ala Arg Trp Lys Thr Val Gly
20 25 30
Leu Lys Gly Trp Gly Gly Asp Asp Ala Phe Ala Ile Leu Val Leu Leu
35 40 45
Phe Trp Thr Val Gly Cys Ile Thr Pro Ser Ser Phe Pro Leu Asp Ala
50 55 60
Asp Leu Asp Asn Gln Leu Glu Leu Cys Met Leu Glu Leu Ile Gly Gln
65 70 75 80
Tyr Gly Thr Asn Ile Gly Ile Thr Asp Asp Val Gly Ala Thr Leu Thr
85 90 95
Asn Glu Gln Ile Ala Arg Phe Glu Phe Gly Ser Lys Cys Leu Leu Ala
100 105 110
Gly Trp Asn Phe Tyr Val Ser Leu Ile Trp Ala Leu Lys Gly Cys Met
115 120 125
Leu Cys Phe Tyr Asn Arg Ile Thr Asp Thr Gly Met Leu Thr Gln Asn
130 135 140
Leu Ile Arg Arg Leu Gly Leu Thr Gln Gln Lys Phe Val Lys Trp Thr
145 150 155 160
Gly Leu Ala Cys Phe Phe Ala Tyr Ala Gly Val Met Gly Ala Ile Trp
165 170 175
Gly His Cys Thr Pro Val His Lys Asn Trp Gln Val Val Pro Tyr Pro
180 185 190
Gly Asp Lys Cys Thr Leu Ala Val Ala Asn Tyr Leu Thr Leu Val Val
195 200 205
Leu Asn Val Thr Thr Asp Phe Val Ile Leu Ser Ile Pro Ile Pro Leu
210 215 220
Leu Trp Lys Val Lys Ile Thr Leu Gly Arg Lys Leu Ala Ile Gly Val
225 230 235 240
Leu Leu Cys Ser Gly Val Phe Ile Ile Val Ala Thr Ile Leu Arg Cys
245 250 255
Val Leu Ser Leu Arg Asp Ile Gln Gly Ile Asn Val Ser Thr Ile Trp
260 265 270
Ala Ile Arg Glu Thr Phe Val Gly Ile Ile Ala Val Asn Ala Ala Ala
275 280 285
Ile Lys Pro Leu Phe Ser Lys Ser Arg Trp Ile Val Ser Ser Lys Gly
290 295 300
Ser Ser Gly Ala Thr Pro Gly Tyr Asn Lys Asn Gln Asn Gln Tyr Ser
305 310 315 320
Leu Asp Gln Met Pro Gly Gly Ala Thr Ser Thr Ile Gly Ser Met Ser
325 330 335
Lys Arg Arg Phe Asn Lys Gln Met Met Glu Leu Gly Asp Asn Ser Ser
340 345 350
Glu Glu His Ile Val Asp Ser Lys Asp Asn His Asn Gly Leu Ala Tyr
355 360 365
Asn Arg Trp Leu Arg Asn Glu Val Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Val
370 375 380
Gly Gly Arg Ser Gly Gly Ser Ala Glu Ala Asp Gly Ile Thr Val Thr
385 390 395 400
Thr Arg Val Glu Val Thr Pro Gly Thr Pro Arg His Met Val
405 410

Claims (10)

1.淡紫紫孢菌Pth11基因，其特征在于，在淡紫紫孢菌转录组和基因组测序数据中筛选得到与稻瘟病跨膜蛋白编码基因同源的两基因Pth11-rg1和Pth11-rg2，两基因的cDNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的淡紫紫孢菌Pth11基因，其特征在于，Pth11-rg1和Pth11-rg2的核酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
3.淡紫紫孢菌Pth11-rg基因工程菌株，其特征在于，包括：
敲除部分权利要求1或2所述的Pth11-rg1的基因工程菌株ΔPth11-rg1；
或
敲除部分权利要求1或2所述的Pth11-rg2的基因工程菌株ΔPth11-rg2。
4.淡紫紫孢菌Pth11-rg基因工程菌株的应用，其特征在于，用于验证权利要求1或2所述淡紫紫孢菌Pth11基因功能。
5.一种淡紫紫孢菌Pth11基因功能验证方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.制备淡紫紫孢菌原生质体；
S2.以权利要求1所述的淡紫紫孢菌Pth11基因的cDNA序列为模板，分别扩增并制备Prg-L+NP与PT+Prg-R片段；
S3.混合步骤S1制备的淡紫紫孢菌原生质体和步骤S2制备的Prg-L+NP与PT+Prg-R片段，采用PEG介导淡紫紫孢菌原生质体转化，并在含G418抗生素的T-TOP培养基中培养3-4d，获得ΔPth11-rg1、ΔPth11-rg2基因工程菌株；
S4.鉴定步骤S3所获得的ΔPth11-rg1、ΔPth11-rg2基因工程菌株对植物寄生性线虫或其虫卵的处理能力。
6.根据权利要求5所述的淡紫紫孢菌Pth11基因的应用方法，其特征在于，步骤S1具体包括：
S11.收集所述淡紫紫孢菌分生孢子，并将孢子液浓度调整至1×105CFU/mL；
S12.以体积份数比1:1000将步骤S11所得孢子液接种于TG培养基中，28℃、150rpm摇培24-36h后，收集菌丝；
S13.用浓度为0.7M的NaCl溶液制备蜗牛酶浓度为1mg/mL、裂解酶浓度为10mg/mL的酶解液；
S14.向步骤S12所得菌丝中加入步骤S13制备的酶解液，30℃、150rpm裂解4-5h，过滤得滤液；
S15.4000rpm离心处理步骤S14所得滤液，弃上清后加入STC溶液重悬得沉淀，所述沉淀为淡紫紫孢菌原生质体；
其中，
步骤S15后，可采用STC溶液调整所述淡紫紫孢菌原生质体浓度为1×108个/mL，以体积份数比93：7向淡紫紫孢菌原生质体液相体系中加入DMSO混匀，以冷冻管定容100μL分装，-80℃保存。
7.根据权利要求5所述的淡紫紫孢菌Pth11基因的应用方法，其特征在于，步骤S2具体包括：
S21.通过PCR分别扩增Prg-L、Prg-R、NP、PT片段，并使Prg-L的3’端与NP的5’端存在20bp重复序列、Prg-R的5’端与PT的3’端存在20bp重复序列；
S22.通过融合PCR分别将步骤S21中所述Prg-L与所述NP、所述Prg-R与所述PT进行融合，形成Prg-L+NP与PT+Prg-R片段。
8.根据权利要求7所述的淡紫紫孢菌Pth11基因的应用方法，其特征在于，PCR引物包括：
PT-F：5’-CTTTGCTACATCCATACTCCATCCT-3’；
NP-R：5’-AGAAGGCACTCTTTGCTGCTTGGAC-3’；
形成的Prg-L+NP与PT+Prg-R片段分别为：
Pth11-rg1L-NP-F：
5’-TCGGCATATTCACCGGCATCTCTGGCATGCGGAGAGACGGACG-3’；
PT-Pth11-rg1R-R：
5’-TGAGAAACATGACTCCCGCCCTGTGCATTCTGGGTAAACGACT-3’；
Pth11-rg2L-NP-F：
5’-CATAATCGCCTTTGCGGTCCCTCTGGCATGCGGAGAGACGGACG-3’；
PT-Pth11-rg2R-R：
5’-ACAGTAGCAAGTCGCAGAGCCTGTGCATTCTGGGTAAACGACT-3’。
9.根据权利要求6所述的淡紫紫孢菌Pth11基因的应用方法，其特征在于，步骤S3具体包括：
S31.取一所述冷冻管室温下自然解冻后，与10μL所述步骤S2制备的Prg-L+NP与PT+Prg-R片段混合后，以TEC溶液混匀、定容至160μL；
S32.以体积份数比1:1向步骤S31定容溶液中滴加质量体积百分比浓度为60％的PEG3350，混匀后静置20min；
S33.以体积份数比1：3向步骤S32静置后的溶液中加入STC溶液，混匀后5000rpm离心，收集沉淀；
S34.以250μL的STC溶液对步骤S33所得沉淀进行重悬，以重悬液涂布PDAS平板，于28℃培养24h；
S35.制备含有浓度为1.2mg/mLG418抗生素的T-TOP培养液，将其覆盖于步骤S34培养平板上，28℃继续培养3-4d。
10.根据权利要求5所述的淡紫紫孢菌Pth11基因的应用方法，其特征在于，步骤S4具体包括：
S41.接种培养步骤S3所获得的ΔPth11-rg1、ΔPth11-rg2基因工程菌株及原始菌株后，分别洗脱其分生孢子，并使用培养液培养分生孢子；
S42.离心步骤S41所得分生孢子液，收集上清液，浸泡所述植物寄生性线虫，处理48h后观察所述植物寄生性线虫的存活情况；
S43.制备所述植物寄生性线虫虫卵悬液，与步骤S41所得分生孢子液混合，共培养24h后观察所述植物寄生性线虫虫卵寄生情况。
CN202210328437.2A 2022-03-30 2022-03-30 敲除Pth11-rg1基因在提高淡紫紫孢菌对南方根结线虫致死效果的应用 Active CN114703202B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210328437.2A CN114703202B (zh) 2022-03-30 2022-03-30 敲除Pth11-rg1基因在提高淡紫紫孢菌对南方根结线虫致死效果的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210328437.2A CN114703202B (zh) 2022-03-30 2022-03-30 敲除Pth11-rg1基因在提高淡紫紫孢菌对南方根结线虫致死效果的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114703202A true CN114703202A (zh) 2022-07-05
CN114703202B CN114703202B (zh) 2023-05-26

Family

ID=82171267

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210328437.2A Active CN114703202B (zh) 2022-03-30 2022-03-30 敲除Pth11-rg1基因在提高淡紫紫孢菌对南方根结线虫致死效果的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114703202B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110423702A (zh) * 2019-08-05 2019-11-08 云南大学 高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbC及其构建方法与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992019739A1 (en) * 1991-05-03 1992-11-12 Mycogen Corporation Novel nematode-active toxins and genes which code therefor
WO2014102241A1 (en) * 2012-12-28 2014-07-03 Ab Enzymes Gmbh Genes/genetic elements associated with mating impairment in trichoderma reesei qm6a and its derivatives and process for their identification
CN110317802A (zh) * 2019-06-01 2019-10-11 山东省农业科学院植物保护研究所 一种防治苹果轮纹病的微生物菌剂及其制备方法
CN110982715A (zh) * 2019-08-05 2020-04-10 云南大学 高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与应用
CN112501170A (zh) * 2020-11-30 2021-03-16 武汉爱博泰克生物科技有限公司 一种构建mlh1基因敲除细胞系的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992019739A1 (en) * 1991-05-03 1992-11-12 Mycogen Corporation Novel nematode-active toxins and genes which code therefor
WO2014102241A1 (en) * 2012-12-28 2014-07-03 Ab Enzymes Gmbh Genes/genetic elements associated with mating impairment in trichoderma reesei qm6a and its derivatives and process for their identification
CN110317802A (zh) * 2019-06-01 2019-10-11 山东省农业科学院植物保护研究所 一种防治苹果轮纹病的微生物菌剂及其制备方法
CN110982715A (zh) * 2019-08-05 2020-04-10 云南大学 高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与应用
CN112501170A (zh) * 2020-11-30 2021-03-16 武汉爱博泰克生物科技有限公司 一种构建mlh1基因敲除细胞系的方法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIALIAN XIE等: "Genome and Transcriptome Sequences Reveal the Specific Parasitism of the Nematophagous Purpureocillium lilacinum 36-1", 《FRONTIERS IN MICROBIOLOGY》 *
WEN-FENG XU等: "Understanding the Transcriptional Changes During Infection of Meloidogyne incognita Eggs by the Egg-Parasitic Fungus Purpureocillium lilacinum", 《FRONTIERS IN MICROBIOLOGY》 *
XIE,J.等: "hypothetical protein PCL_00325 [Purpureocillium lilacinum]", 《GENBANK DATABASE》 *
XIE,J.等: "hypothetical protein PCL_09898 [Purpureocillium lilacinum]", 《GENBANK DATABASE》 *
李星月;余辉;朱从桦;李其勇;郭展;张鸿;: "四川烟草根结线虫危害及其综合防控对策", 四川农业科技 *
杜红霞等: "苹果树腐烂病菌染色质重塑因子Vmles4的功能研究", 《干旱地区农业研究》 *
谢家廉: "南方根结线虫效应蛋白Misp12功能分析和淡紫紫孢菌寄生适应性的比较基因组研究", 《中国优秀博士学位论文全文数据库》 *
谢家廉: "南方根结线虫效应蛋白Misp12功能分析和淡紫紫孢菌寄生适应性的比较基因组研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
郝泽婷: "淡紫拟青霉非还原型聚酮化合物合成基因簇的鉴定及表达分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110423702A (zh) * 2019-08-05 2019-11-08 云南大学 高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbC及其构建方法与应用
CN110423702B (zh) * 2019-08-05 2022-11-01 云南大学 高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbC及其构建方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114703202B (zh) 2023-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114703202A (zh) 淡紫紫孢菌Pth11基因及其功能验证方法
CN109021084A (zh) 枳抗寒基因PtrERF109及其在植物抗寒遗传改良中的应用
CN101589147A (zh) 改善农作物的植物生长、蒸腾效率和耐旱性的玉米erecta基因
CN112390864B (zh) Mad1蛋白在调控真菌产孢与萌发及植物亚麻酸代谢路径中的应用
CN110358778B (zh) SlDALR2基因在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的应用
CN109694876A (zh) 培育低镉积累水稻的方法及其相关材料的用途
CN109734784B (zh) SlDALR1基因在增强番茄细菌性叶斑病抗性中的应用
CN109371044B (zh) 一种稻瘟菌基因Movan及其应用
CN114317562B (zh) 普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关蛋白的编码基因PvEXO70及应用
CN113980986B (zh) 一个crk22基因及其编码蛋白在马铃薯抗逆育种中的应用
CN113956337B (zh) 基因FoUPE3在防治香蕉枯萎病中的应用
CN112961843B (zh) 植物免疫调节相关蛋白及其应用
CN115074381B (zh) 调节禾本科植物株高或生物量性状的方法及应用
Fowler et al. Early changes in gene expression during direct somatic embryogenesis in alfalfa revealed by RAP-PCR
CN110607312B (zh) 一种黄曲霉致病基因hsp90及其应用
CN114107327A (zh) 绿色木霉高温胁迫响应关键酶基因TvHSP70、重组表达载体、工程菌及其应用
CN1285872A (zh) 与植物疾病抗性相关的基因
CN113005122B (zh) 一种抗玉米病毒的小rna
KR101438685B1 (ko) 병저항성 및 고온스트레스 관련 유전자 CaHSP70 및 이를 이용한 형질전환 식물체
CN116286850B (zh) 一种水稻稻曲病抗性负调控基因及其用途
TWI541349B (zh) 經截短之甘油醛－３－磷酸脫氫酶啟動子
CN110628787B (zh) 一种黄曲霉致病基因wprB及其应用
CN115011615B (zh) 一种香蕉枯萎病菌内源报告基因carS及其应用
CN115927368A (zh) 一种提高植物抗病性的基因rel及其应用
CN117844818A (zh) 玉米TIR家族基因ZmTIR3及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant