CN114681426A - 一种益生菌聚合物微囊制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种益生菌聚合物微囊制剂及其制备方法和应用，包括：步骤1，将灭活益生菌的菌悬液加入壳寡糖水溶液中，进行第一次反应，然后添加阿拉伯胶，进行第二次反应，去除沉淀和聚集物，得到微胶囊溶液；步骤2，将谷氨酰胺转酶加入微胶囊溶液中，进行第三次反应，冷冻干燥，得到益生菌微胶囊；步骤3，将(3‑羧丙基)三苯基溴化膦溶解于2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中，添加1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应，得到(3‑羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液；将(3‑羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液与益生菌微胶囊混合，搅拌反应后，透析，冷冻干燥，得到益生菌聚合物微囊制剂。可对益生菌表现出更好的保护作用，可作用于眼部脉络膜微血管内皮细胞及其线粒体，具有保护眼部组织细胞等保健和治疗功效。

Description

一种益生菌聚合物微囊制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种保健品及药物制剂的技术领域，具体涉及一种益生菌聚合物微囊制剂及其制备方法和应用。
背景技术
脉络膜位于视网膜和巩膜之间，是一层柔软光滑、具有弹性和富有血管的棕色薄膜。脉络膜的主要作用是营养视网膜外层，相当于供给大脑营养的软- 蛛网膜。脉络膜血管内皮细胞(Choroidal vascular endothelial cells，CVECs) 的损伤会导致多种眼部疾病的发生。例如黄斑变性、高度近视、特发性脉络膜视网膜炎、眼组织胞浆菌病及眼底血管样条纹等眼部疾病的发展，造成血管舒展与紧缩调节的活性物质发生分泌紊乱。血管内皮细胞是人体最大的内分泌、旁分泌及自分泌的代谢器官，可以产生和分泌几十种生物活性物质。血管内皮细胞具有复杂的功能，主要分为4点：屏障保护作用、血管张力作用、内皮分泌作用、修复增殖作用。血管内皮是最易受损的靶细胞，可因缺血、缺氧、血流的机械损伤等因素而受损。
因此，研究保护CVECs是防治缓解眼部疾病的新途径。针对眼部健康，最新研究发现了一株护眼益生菌，由原料供应商Kyowa Hakko提供，其公司宣布在美国推出一种突破性的热灭活益生菌菌株，市场命名为Eyemuse，已经开展的临床研究证明该菌株能够支持健康的眼部功能，据悉这是首款针对眼部健康的益生菌专利菌株。研究测试表明，Eyemuse可通过调节免疫反应减轻眼疲劳，同时能诱导巨噬细胞分泌IL-10，并通过调节免疫平衡进一步支持眼睛健康。热灭活益生菌，又称为“非活性益生菌菌株(Paraprobiotics)”，具有调节免疫反应的效果，这可能在某种程度上能够减少眼睛疲劳。但是热灭活益生菌易受加工、储存以及动物消化道酸性环境等条件的影响而不稳定。
聚合物微囊制剂可以提高食用性益生菌的物理保护和稳定性，为有效成分提供更大的保护，复杂凝聚法在用于封装益生菌方面具有十分广阔的前景。然而，生物聚合物的组成和浓度以及环境条件等参数会影响微胶囊的生产及其结构，使得益生菌的稳定性无法保证。
发明内容
本发明的目的是提供一种益生菌聚合物微囊制剂及其制备方法和应用，可对益生菌表现出更好的保护作用，可作用于眼部脉络膜微血管内皮细胞及其线粒体，具有保护眼部组织细胞等保健和治疗功效。
本发明通过以下技术方案实现：
一种益生菌聚合物微囊制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，复凝聚法制备微囊体系
将灭活益生菌的菌悬液加入壳寡糖水溶液中，进行第一次反应，然后添加阿拉伯胶，进行第二次反应，去除沉淀和聚集物，得到微胶囊溶液；
步骤2，酶促反应的共价交联过程：
将谷氨酰胺转酶加入微胶囊溶液中，进行第三次反应，冷冻干燥，得到益生菌微胶囊；
步骤3，益生菌聚合物微囊制剂制备
将(3-羧丙基)三苯基溴化膦溶解于2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中，添加 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应，得到(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液；将(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液与益生菌微胶囊混合，搅拌反应后，透析，冷冻干燥，得到益生菌聚合物微囊制剂。
优选的，步骤1中，灭活益生菌为灭活的Eyemuse菌株。
优选的，步骤1中，第一次反应的温度为50-60℃，时间为15-25min，第二次反应的温度为30-35℃，时间为30-45min。
优选的，步骤1中，添加阿拉伯胶后，调节pH值至4.3-4.5。
优选的，步骤2中，第三次反应的温度为25-28℃，时间为15-20h。
优选的，步骤3中，第一次搅拌反应的温度为室温，时间为6-8h；第二次搅拌反应的温度为室温，时间为12-24h；透析时间为3-5d。
优选的，步骤3中，(3-羧丙基)三苯基溴化膦、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(5-7)：(5-6.5)：(3-5)。
采用所述的制备方法得到的益生菌聚合物微囊制剂。
所述的益生菌聚合物微囊制剂在制备治疗眼部疾病药物中的应用。
优选的，所述药物为靶向眼部脉络膜血管内皮细胞线粒体的药物。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明首先采用复凝聚法制备微囊，然后再采用谷氨酰胺转酶与复凝聚法制备的微囊进行交联。由于复凝聚微囊在一定条件下的凝聚作用不够紧密，谷氨酰胺转酶的添加可增强其抗性结构，增加微囊的结构紧密性，可对益生菌表现出更好的保护作用，提高生物利用度。并且，本发明通过采用聚合物体系对益生菌微胶囊进行封装设计，具体利用复合凝聚法和转谷氨酰胺酶交联法对于益生菌进行封装，旨在提高微囊的抗性和对益生菌的保护作用。进一步在体系中修饰(3-羧丙基)三苯基溴化膦，可被用作各种探针的线粒体靶向载体。由于(3- 羧丙基)三苯基溴化膦含有三个苯基，使整个分子高度脂溶，除了苯环上的三个正电荷外，还可以去定域，此特性使得(3-羧丙基)三苯基溴化膦很容易通过磷脂双层通过被动扩散进入细胞质双层。并且在线粒体膜电位的驱动下，进一步从细胞质积累到线粒体中，使本体系能被靶向输送至脉络膜微血管内皮细胞线粒体。
进一步的，本发明采用的Eyemuse菌株能很好的防治缓解眼部疾病。
进一步的，pH 4.0左右为微胶囊形成的最佳条件。
本发明制备得到的益生菌聚合物微囊制剂，稳定性更高，可用于眼部疾病的治疗。
进一步的，线粒体是细胞的动力源，消耗氧气以产生维持细胞正常运转所需的能量。线粒体在维持细胞内稳态所需的一系列其他细胞过程中发挥着关键作用，包括调节钙贮量和作为细胞凋亡的启动器。维护健康的线粒体对细胞生存和正常运作至关重要。本发明益生菌聚合物微囊制剂能被靶向输送至脉络膜微血管内皮细胞线粒体，在缺氧条件下，能抑制细胞增殖及迁移，治疗眼部疾病。
与传统的体系给药系统相比，基于微囊具有更大的优势，因为它具有更高的稳定性、生物相容性、更高的渗透性和更精确的靶向性。
附图说明
图1是实施例5中制备的益生菌聚合物微囊制剂在水溶液中的扫描电镜 (SEM)的照片(×100K)；
图2是实施例5中制备的益生菌聚合物微囊制剂的横截断裂面在水溶液中的扫描电镜(SEM)的照片(×100K)；
图3是实施例7中所述的聚合物对CVECs细胞缺氧条件下的增殖作用影响；
图4是实施例8中所述的聚合物对CVECs细胞迁移能力的观察与比较；
图5是实施例9中所述的对照组尼罗红染料在CVECs细胞中的荧光分布图；
图6是实施例9中所述的实验靶向示踪组在CVECs细胞线粒体靶定位对比图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行描述，这些描述只是进一步解释本发明的特征和优点，并非用于限制本发明的权利要求。
本发明益生菌聚合物微囊制剂的制备方法，包括以下步骤：
1、益生菌Eyemuse菌株的培养及热灭活处理
将益生菌接种于肉汤培养基中，接种量为3-5％％。肉汤培养基的成分：氯化钠0.5-0.8％(w/v)、蛋白胨0.8-1.2％(w/v)、牛肉浸膏0.4-0.8％(w/v)，调整pH值在7.0-7.2左右。置于摇床培养24-36h，温度为28-30℃，转速为 120-200rpm/min。培养好的菌液在温度为4℃，转速在4500-5500rpm/min，离心15-20min，弃上清，收集沉淀。将沉淀用PBS洗涤沉淀3-5次，再用生理盐水进行冲洗。最终菌浓度调整为1.0×1010-5.0×1010cfu/mL的培养物。可在4℃条件下保存。继续在温度为90-95℃的水浴锅中处理1-1.5h，最后可利用平板稀释涂布法检验其均为灭活菌株。
2、复凝聚法制备微囊体系
将步骤1中的培养物20-35mL添加至80-100mL 3-5％壳寡糖水溶液(平均分子量在1000-1500Da)，在水浴锅中加热至50-60℃15-25min。继续添加120-150mL 3-5％阿拉伯胶和450-600mL无菌蒸馏水，调节pH值至4.3-4.5 左右，将溶液自然冷却至30-35℃，继续冰浴30-45min，沉淀和少量聚集物过滤出去，留下微胶囊溶液部分。
3、酶促反应的共价交联过程:
将谷氨酰胺转酶(活性100-150U/g)添加到制备好的微胶囊溶液中，酶浓度在3-5U/g PTN。反应温度在25-28℃，持续搅拌15-20h，并进行4℃冷藏保存，得到酶交联复凝聚微胶囊溶液。
4、酶交联复凝聚微胶囊的冷冻干燥制备
微胶囊需要预冷冻(-18℃，24-30h)。在冷冻干燥机工艺条件(真空： 0.200-0.300μHg)，冷凝器温度为-40～-50℃，将酶交联复凝聚微胶囊溶液冷冻干燥24-48h，得到益生菌微胶囊。
5、线粒体亚细胞器的靶向输送益生菌聚合物微囊制剂设计
S1、制备(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液：将(3-羧丙基)三苯基溴化膦溶解于25-30mL(0.1-0.15M，pH 5.0-5.5)的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液中。继续添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，在转速为450-520rpm条件下持续搅拌6-8h，得到(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液。其中，(3-羧丙基)三苯基溴化膦、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的浓度分别为5-7mg/mL、5-6.5mg/mL、 3-5mg/mL。
S2、将(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液与步骤4的益生菌微胶囊缓慢混合，在450-550rpm条件下搅拌反应12-24h，于500Da的透析袋内进行透析3-5d，再冷冻干燥，得到益生菌聚合物微囊制剂。
实施例1：益生菌Eyemuse菌株的培养及热灭活处理
将益生菌接种于肉汤培养基中，接种量为3％。肉汤培养基的成分:氯化钠 0.5％(w/v)、蛋白胨0.8％(w/v)、牛肉浸膏0.4％(w/v)，调整pH值在 7.0左右。置于摇床培养24h，温度为28℃，转速为120rpm/min。培养好的菌液在温度为4℃，转速在4500rpm/min，离心15min，弃上清，收集沉淀。将沉淀用PBS洗涤沉淀3次，再用生理盐水进行冲洗。最终菌浓度调整为1.0 ×1010cfu/mL。可在4℃条件下保存。继续在温度为95℃的水浴锅中处理1h，最后可利用平板稀释涂布法检验其均为灭活菌株。
实施例2：复凝聚法制备微囊体系
将实施例1中的培养物20mL添加至80mL 3％壳寡糖水溶液(平均分子量在1000Da)，在水浴锅中加热至50℃15min。继续添加120mL 3％阿拉伯胶和450mL无菌蒸馏水，调节pH值至4.3左右。将溶液自然冷却至30℃，继续冰浴30min，留下微胶囊溶液部分，沉淀和少量聚集物过滤出去。
对比例1：复凝聚法制备尼罗红染料微囊
将20mL含有20μg尼罗红染料的乙醇溶液添加至80mL 3％壳寡糖水溶液 (平均分子量在1000Da)，在水浴锅中加热至50℃15min。继续添加120mL 3％阿拉伯胶和450mL无菌蒸馏水。调节pH值至4.3左右。将溶液自然冷却至30C，继续冰浴30min，留下溶液部分，沉淀和少量聚集物过滤出去。(对比例1与实施例2所述的制备方法相同，乙醇溶液中尼罗红替代益生菌，以实现对体系的荧光示踪，能够进入细胞并且靶向作用于线粒体进行验证)。
实施例3：酶促反应的共价交联过程：
将谷氨酰胺转酶(活性100U/g)添加到实施例2制备好的微胶囊溶液中，酶浓度在3U/g PTN。反应温度在25℃，持续搅拌15h。并进行4℃冷藏保存。
对比例2：游离益生菌株
游离益生菌株，即为实施例1同等条件下对益生菌株进行培养和热灭活。没有封装包裹及共价反应酶交连步骤。
实施例4：酶交联复凝聚微胶囊的冷冻干燥制备
微胶囊需要预冷冻(-18℃，24h)：在冷冻干燥机工艺条件(真空：0.200-0.300 μHg)，冷凝器温度为-40℃，将实施例3得到的酶交联复凝聚微胶囊冷冻干燥 24h。
对比例3：尼罗红染料微囊酶促反应的共价交联过程及冷冻干燥
将谷氨酰胺转酶(活性100U/g)添加到对比例1制备好的尼罗红染料微胶囊溶液中，酶浓度在3U/g PTN。反应温度在25℃，持续搅拌15h。并进行4℃冷藏保存。然后按照实施例4条件进行冷冻干燥。
实施例5：实验聚合物组
线粒体亚细胞器的靶向输送益生菌聚合物微囊制剂设计：
S1、制备(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液：将(3-羧丙基)三苯基溴化膦溶解于25mL(0.1M，pH 5.0)的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液中。继续添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，在转速为 450rpm条件下持续搅拌6h。其中，(3-羧丙基)三苯基溴化膦、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的浓度分别为5mg/mL、 5mg/mL、3mg/mL。
S2、将(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液与实施例4得到的微胶囊缓慢混合，在450rpm条件下搅拌反应12h，于500Da的透析袋内进行透析3d，再冷冻干燥，冻干条件同实施例4。
对比例4：实验靶向示踪组
S1、制备(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液：将5mg/mL的(3-羧丙基) 三苯基溴化膦溶解于25mL(0.1M，pH 5.0)的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液中。继续添加5mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺，溶液1mL，在转速为450rpm条件下持续搅拌6h。其中， (3-羧丙基)三苯基溴化膦、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的浓度分别为5mg/mL、5mg/mL、3mg/mL。
S2、将(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液与对比例3制备的微胶囊缓慢混合，在450rpm条件下搅拌反应12h，于500Da的透析袋内进行透析3d，再冷冻干燥，冻干条件同实施例4。
如图1是实施例5中制备的益生菌聚合物微囊制剂在水溶液中的扫描电镜 (SEM)的照片(×100K)，可以看出，实验聚合物组样品形态接近球形，粒径在50μm左右。
如图2是实施例5中制备的益生菌聚合物微囊制剂的横截断裂面在水溶液中的扫描电镜(SEM)的照片(×100K)，显示出在聚合物中封装的益生菌可以完好的保持其原有形貌以得到保护。
实施例6：益生菌聚合物微囊制剂的封装效率测定
计算封装效率(EE)。EE＝(N/N0)×100(1)，其中N为微胶囊释放出的活细胞数(logCFU g-1)，N0为微胶囊前培养物中的活细胞数(log CFU g-1)。经计算，该体系的封装率约为65.67％。
实施例7：益生菌聚合物微囊制剂的形态表征
利用冷场扫描电镜对于益生菌聚合物微囊制剂的表观形貌进行表征。标尺可以显示其平均粒径大小。对于冷冻干燥条件下的益生菌聚合物微囊制剂，整体形貌特点及横截剖面角度进行同时表征评价。
实施例6：脉络膜血管内皮细胞培养
选取人原代血管内皮细胞CVECs培养，用含10％胎牛血清FBS、100mg/L 内皮细胞生长因子ECGF、100mg/L肝素、胰岛素(0.3IU/ml)以及1g/L含双抗的Ham's F-12完全营养培养基于37℃、体积分数为5％CO2培养箱进行培养。
实施例7：益生菌聚合物微囊制剂对CVECs细胞缺氧条件下的增殖作用影响
取对数生长期人原代血管内皮细胞，加0.25％胰酶进行消化、含10％胎牛血清的Ham's F-12完全营养培养液重悬并吹打成单个细胞后计数，调整细胞的终浓度为1.0×105个/mL，以每孔150μL细胞悬液接种到96孔板中，放入培养箱进行24h孵育。将培养基吸出，添加样品进行6h孵育，样品浓度均为 10μg/mL，对照组添加等量PBS缓冲液。如下分组处理细胞：对照组(正常氧气浓度条件)，缺氧组(1％O2，5％CO2，94％N2)，缺氧+实验游离益生菌组，缺氧+实验聚合物组。之后每孔添加25μL 5mg/mL的MTT溶液，在37℃含有浓度为5％CO2、饱和湿度条件下的培养箱进行4h孵育。轻轻吸出每孔培养基。每孔继续添加200μL的DMSO。使结晶体充分溶解后，利用酶标仪在 570nm波长处测定每孔的吸光度值A计算细胞的增值率。细胞增殖率＝(实验组吸光度值-对照组吸光度值)/对照组吸光度值。
如图3是实施例7中所述的益生菌聚合物微囊制剂对CVECs细胞缺氧条件下的增殖作用影响所示，细胞的MTT实验结果表明，不同的分组样品对于细胞的增殖率不同：对照组为1.10±0.10，缺氧组为1.73±0.06，缺氧+实验游离益生菌组为1.53±0.06，缺氧+实验聚合物组为1.33±0.06。各组间具有显著性差异(P＜0.05)，与对照组相比，缺氧组细胞增殖率明显升高；与缺氧组相比，缺氧+实验游离益生菌组的细胞增殖率具有明显的下调趋势，并且缺氧+实验聚合物组的下调趋势更为明显，由此可以得出，在缺氧的培养条件下，会提高CVECs细胞的细胞活力增长，起到促进细胞增值作用，游离益生菌对缺氧条件下的细胞增殖具有显著抑制作用，并且通过封装后的益生菌聚合物微囊制剂具有对于细胞增殖更为强烈的抑制作用。
实施例8：划痕实验
检测CVECs细胞迁移：取CVECs细胞按照每孔5×105个接种于6孔板中，培养24h后观察细胞，当细胞均匀铺满培养孔底部后，用1000μL的移液枪头在细胞上垂直划痕，再用PBS将孔板底部的飘浮细胞轻轻漂洗干净，添加入含1％胎牛血清的培养基，按照上述不同分组处理细胞，利用荧光倒置显微镜进行图片成像监测划痕部分的宽度距离作0h起始时间点的记录。将细胞继续培养12h后检测相同划痕部分的宽度距离，利用ImageJ软件计算划痕宽度。相对迁移距离＝12h迁移距离-0h迁移距离。
如图4是实施例8中所述的益生菌聚合物微囊制剂对CVECs细胞迁移能力的观察与比较结果，可以分析出，不同的分组样品对于细胞迁移程度不同：对照组为315.00±5.00，缺氧组为646.67±15.27，缺氧+实验游离益生菌组为423.33±25.17，缺氧+实验聚合物组为346.67±15.28。各组间细胞的迁移程度具有显著性差异(P＜0.05)。与对照组相比，缺氧组细胞迁移距离明显增加。与缺氧组相比，缺氧+实验游离益生菌组的细胞迁移距离均明显下降，且与缺氧组相比，缺氧+实验聚合物组的距离下降的更为明显。因此，缺氧培养条件下CVECs细胞迁移能力增强，游离益生菌对缺氧条件下的细胞迁移具有抑制作用，且通过封装后的益生菌聚合物微囊制剂具有对于细胞的迁移距离具有明显的抑制作用。
实施例9：CVECs细胞线粒体靶向传输成像
取对数生长期CVECs细胞，加0.25％胰酶进行消化、含10％胎牛血清的 Ham's F-12完全营养培养液重悬并吹打成单个细胞后计数，调整细胞的终浓度为1.0×105个/mL，以每孔150μL细胞悬液接种到96孔板中，放入培养箱进行24h孵育。将培养基吸出，分别添加含有不同实验组样品的培养液100μL(其中染料含量约0.1μg)进行6h孵育。如下分组处理细胞：按如下分组处理细胞：对照组(仅为尼罗红染料对于细胞进行染色)，实验靶向示踪组。孵育结束后向培养液中加入100μL 0.2μM的Mito-Tracker Green的线粒体染料再置于37℃下5％的CO2细胞培养箱中孵育处理细胞30min，孵育结束后吸出培养基并用 PBS缓冲液清洗细胞3次，利用激光共聚焦显微镜进行示踪成像。
如图5是实施例9中所述的对照组尼罗红染料在CVECs细胞中的荧光分布图，经过尼罗红染料染色的细胞具有一定的荧光信号。
如图6是实施例9中所述的实验靶向示踪组在CVECs细胞线粒体靶定位对比图，经过实验靶向示踪组中释放的尼罗红染料荧光强度更显著，并且能够与Mito-Tracker Green线粒体染料有明显重合(如图6箭头所示)，说明了实验靶向示踪组对于线粒体的靶向特性。并对实验聚合物组中的益生菌能够进入细胞并且靶向作用于线粒体进行了验证。

Claims (10)

1.一种益生菌聚合物微囊制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，复凝聚法制备微囊体系
将灭活益生菌的菌悬液加入壳寡糖水溶液中，进行第一次反应，然后添加阿拉伯胶，进行第二次反应，去除沉淀和聚集物，得到微胶囊溶液；
步骤2，酶促反应的共价交联过程
将谷氨酰胺转酶加入微胶囊溶液中，进行第三次反应，冷冻干燥，得到益生菌微胶囊；
步骤3，益生菌聚合物微囊制剂制备
将(3-羧丙基)三苯基溴化膦溶解于2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中，添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应，得到(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液；将(3-羧丙基)三苯基溴化膦羧基活化液与益生菌微胶囊混合，搅拌反应后，透析，冷冻干燥，得到益生菌聚合物微囊制剂。
2.根据权利要求1所述的益生菌聚合物微囊制剂的制备方法，其特征在于，步骤1中，灭活益生菌为灭活的Eyemuse菌株。
3.根据权利要求1所述的益生菌聚合物微囊制剂的制备方法，其特征在于，步骤1中，第一次反应的温度为50-60℃，时间为15-25min，第二次反应的温度为30-35℃，时间为30-45min。
4.根据权利要求1所述的益生菌聚合物微囊制剂的制备方法，其特征在于，步骤1中，添加阿拉伯胶后，调节pH值至4.3-4.5。
5.根据权利要求1所述的益生菌聚合物微囊制剂的制备方法，其特征在于，步骤2中，第三次反应的温度为25-28℃，时间为15-20h。
6.根据权利要求1所述的益生菌聚合物微囊制剂的制备方法，其特征在于，步骤3中，第一次搅拌反应的温度为室温，时间为6-8h；第二次搅拌反应的温度为室温，时间为12-24h；透析时间为3-5d。
7.根据权利要求1所述的益生菌聚合物微囊制剂的制备方法，其特征在于，步骤3中，(3-羧丙基)三苯基溴化膦、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(5-7)：(5-6.5)：(3-5)。
8.采用权利要求1-7任一项所述的制备方法得到的益生菌聚合物微囊制剂。
9.权利要求8所述的益生菌聚合物微囊制剂在制备治疗眼部疾病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物为靶向眼部脉络膜血管内皮细胞线粒体的药物。
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